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Effect of methyl jasmonate on the glucosinolate contents and whole genome expression in Brassica oleracea
J Plant Biotechnol 2019;46:189-204
Published online September 30, 2019
© 2019 The Korean Society for Plant Biotechnology.

Jeongyeo Lee · Sung Ran Min · Jaeeun Jung · HyeRan Kim

Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Daejeon, Republic of Korea
Correspondence to: e-mail: kimhr@kribb.re.kr
cc This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract

In this study, we analyzed the changes in glucosinolate content and gene expression in TO1000DH3 and Early big seedling upon methyl jasmonate (MeJA) treatment. Analysis of glucosinolate contents after MeJA treatment at 200 μM concentration showed that the total glucosinolate content increased by 1.3-1.5 fold in TO1000DH3 and 1.3-3.8 fold in Early big compared to those before treatment. Aliphatic glucosinolates, progoitrin and gluconapin, were detected only in TO1000DH3, and the changes in the content of neoglucobrassicin were the greatest at 48 hours after MeJA treatment in TO1000DH3 and Early big. The transcriptomic analysis showed that transcripts involved in stress or defense reactions, or those related to growth were specifically expressed in TO1000DH3, while transcripts related to nucleosides or ATP biosynthesis were specifically expressed in Early big. GO analysis on transcripts with more than two-fold change in expression upon MeJA treatment, corresponding to 12,020 transcripts in TO1000DH3 and 13,510 transcripts in Early big, showed that the expression of transcripts that react to stimulus and chemical increased in TO1000DH3 and Early big, while those related to single-organism and ribosome synthesis decreased. In particular, the expression increased for all transcripts related to indole glucosinolate biosynthesis, which is associated with increase in glucobrassicin and neoglucobrassicin contents. Upon MeJA treatment, the expression of AOP3 (Bo9g006220, Bo9g006240), TGG1 (Bo14804s010) increased only in TO1000DH3, while the expression of Dof1.1 (Bo5g008360), UGT74C1 (Bo4g177540), and GSL-OH (Bo4g173560, Bo4g173550, Bo4g173530) increased specifically in Early big.

Keywords : Methyl jasmonate, Glucosinolate, Transcriptome, Brassica oleracea
서 론

배추과(Brassicaceae) 식물은 350개의 속, 13개의 과로 구분되며, 약 3,200여종이 포함되어 있는 것으로 알려져 있다 (Kowalsky et al. 1994; Goncalves et al. 2012). 배추과에 속하는 양배추류(Brassicaoleracea)는 양배추(B. oleracea var. capitat), 브로콜리(B. oleracea var. italica), 케일(B. oleracea var. acephala), 콜라비(B. oleracea var. gongylodes), 콜리플라워(B. oleracea var. botrytis), 방울양배추(B. oleracea var. gemmifera) 등 다양한 경제적 작물을 포함한다(Hagen et al. 2009; Lee et al. 1997). 양배추는 전 세계적으로 식용되고 있는 작물로써 시장규모가 매우 크며, 재배면적 기준으로 세계 4대 채소 작물로 구분될 만큼 주요 작물에 속한다. 영양학적 관점에서의 양배추는 칼슘, 칼륨, 마그네슘 등 다양한 미네랄과 비타민(A, B1, B2, C) 및 엽산을 상당량 함유하고 있다. 또한 식물 화학물질과 항체, 효소 및 호르몬을 생성하는데 필요한 필수 아미노산의 일종인 라이신(lysine)을 함유하고 있어 영양가치가 높다(Choi et al. 1995; Higdon et al. 2007). 특히 항암작용에 효과가 있는 글루코시놀레이트(glucosinolates, GSLs)를 많이 함유하고 있어 최근 암을 예방하는 대표적인 식품으로도 자리매김을 하고 있다(Rangkadilok et al. 2004; Li et al. 2010).

글루코시놀레이트는 질소와 황을 함유하는 이차대사산물로 현재까지 약 200종류 이상이 알려져 있으며, 이 중 30여종의 생리 활성 기능이 알려져 있다(Clarke 2010). 글루코시놀레이트는 전구체인 L-amino acid (methionine, tryptophan, phenylalanine) 종류에 따라 각각 aliphatic, indolyl, aromatic GSLs로 구분된다(Lim 2002; Sun et al. 2011). 글루코시놀레이트는 화학적으로 안정된 상태로 존재하지만 식물 조직이 손상을 받으면 myrosinase (EC 3.2.3.1)에 의해 가수분해되어 불안정한 thiohrdroxamate-O-sulfonate를 형성하고, isothiocynates, oxazoldine-2-thiones, indole-3-cabinol, nitriles, epithionitrile, thiocynates 등과 같은 안정된 물질로 전환된다(Fahey et al. 2001; Halkier and Du 1997; Higdon et al. 2007; Keck and Finley 2004; Zhang et al. 2006). 특히 isothiocyanate는 세포 자멸과 세포주기 억제 기작을 통하여 방광암, 대장암, 폐암 등 항암효과가 뛰어나다고 보고되었다(Cartea et al. 2008; Hwang et al. 2012). 글루코시놀레이트는 glucuronyl transferase, glutathione-S-transferase 등 phase II detoxification 효소의 활성을 유도함으로써 항암 작용을 활성화하는 것으로도 알려져 있다(Holst and Williamson 2004; Keum et al. 2004). 또한 강한 항균, 살충 작용과 같은 생체 방어 반응에 관여하는 기능 또한 보고되어 왔다(Zhang and Talalay 1994).

식물의 이차대사산물은 세포가 영양분 고갈, 환경 변화, 미생물에 의한 오염과 같은 스트레스를 받을 때 식물체 내에 축적된다(Dixon and Paiva 1995). 메틸자스모네이트(MeJA)는 식물세포내에 이차대사산물의 생성을 촉진시키는 대표적인 elicitor로서(Yukimune et al. 1996; Ketchum et al. 1999), 식물 세포 발달과정에 있어 종자 발달, 뿌리 생장, 과일 숙성과 노화를 조절하며, 외부 스트레스 자극에 의한 방어 기작을 유도하는 신호전달 물질로 잘 알려져 있다(Cheong and Choi 2003). 최근에 MeJA를 elicitor로 처리하여 다양한 이차대사산물의 합성 및 생산을 효율화 한 연구들이 다양하게 보고되고 있다. MeJA를 처리한 결과 주목의 paclitaxel 합성이 촉진되었고(Yukimune et al. 1996; Ketchum et al. 1999), 인삼 부정근의 ginsenoside (Kim et al. 2004; Choi et al. 2005; Kim et al. 2007; Kim et al. 2009) 및 더덕 모상근의 사포닌 함량이 증가하였다(Kim et al. 2015). Elicitation은 목적하는 성분 함량을 식물체내에서 증대시키기 위한 방법으로서 인간의 질병 예방과 건강유지에 중요한 기능성 물질을 대상으로 주로 적용되어 왔다. 최근에는 이런 점에 초점을 맞춰 생산 위주의 재배 환경 조절보다는 이차대사산물의 생합성을 증대시키는 재배환경을 제공하여 작물의 기능성 물질 함량을 증가시키연구 또한 활발히 진행되고 있다(Poiroux-Gonord et al. 2010; Rajashekar et al. 2009; Schreiner 2005).

Next Generation Sequencing (NGS)은 전통적인 염기서열 분석 방법에 비해 빠르고 저렴한 비용으로 대용량의 단편 염기서열 데이터를 얻을 수 있는 차세대 염기서열 분석 기술이다. NGS 기법을 응용한 RNA 시퀀싱(High-throughput mRNA sequencing, RNA-seq)은 전사체로부터 얻어진 cDNA를 시퀀싱 하는 방법으로, 전사체 발현양을 상대적으로 정량화할 수 있어, 유전자의 발현 정도나 각 조건에 따라 특이하게 발현하는 유용 유전자의 발굴에 활용 가능하며, 분석 대상의 reference 유전체 정보가 없어도 유전자 발현 분석이 가능하다(Kukurba and Montgomery 2015). 양배추류는 약 630 Mb로 유전체 크기가 측정되며, 85% 의 유전체를 대표하는 양배추 (B. oleracea var. capitata (homozygous line 02-12) 유전체 정보와 488.6 Mb의 케일(Rapid cycling B. oleracea line TO1000DH3) 유전체 정보가 보고되었으며(Liu et al. 2014; Parkin et al. 2014), 최근에 3세대 염기서열분석 방법인 Nanopore 기반으로 브로콜리(B. oleracea HDEM)의 유전체 정보가 보고되어 (Belser et al. 2018) 총 3개의 reference 유전체 정보가 존재한다. 이 풍부한 reference 정보 기반으로 양배추 기관별(잎, 뿌리, 꽃), 고온스트레스, CMS, 검은썩음병 및 위황병 저항성 관련 등 비교적 많은 형질에 대한 전사체 연구가 보고되어 왔다(Kim et al. 2014; Wang et al. 2011; Izzah et al. 2014; Xing et al. 2016). 글루코시놀레이트 생합성 관련해서는 브로콜리의 꽃봉우리의 발달단계 별, 종자 및 새싹에서의 글루코시놀레이트 성분과 함량 관련된 전사체 분석 연구가 수행되어(Li et al. 2019; Gao et al. 2014), 브로콜리 종자와 새싹으로부터 25개의 글루코시놀레이트 생합성 관련 유전자가 선발되어 종자보다 발아 후 새싹에서 발현양이 증가되는 것을 보고하였다. 특히 알리패틱 글루코시놀레이트 분해와 관련된 myrosinase 2 (TGG2)의 발현양이 늙은 잎 보다 어린 잎에서 약 20~130배 많아 글루코시놀레이트 breakdown product 함량이 종자 발아 및 어린 잎 발달 단계에 중요한 작용을 하는 것으로 보고되었다(Gao et al. 2014). 또한 브로콜리 꽃봉우리 발단단계에서 glucoraphanin 합성과 관련된 10개 유전자(CYP79F1, MAM1, MAM3, St5b-2, FMOGS-OX1, MY, AOP2, ESPESM1)의 발현 비교 분석을 통해 CYP79F1 유전자가 유일하게 다른 기관에서는 발현되지 않으며 어린 꽃눈에서만 발현이 증가되는 것을 확인하여 이 유전자가 화서의 sulforaphane 생성에 중요한 역할을 할 것으로 보고하였다(Li et al. 2019). 하지만, 현재까지 elicitor 처리에 따른 양배추의 글루코시놀레이트 함량 변화와 글루코시놀레이트 함량 변화에 따른 전사체 발현 변화 관련 분석은 아직 보고되지 않았다.

본 연구에서는 유전체 정보와 유전 분석 정보가 풍부한 B. oleracea의 국제 표준 유전 집단 양친 계통인 TO1000DH3 (B. oleracea var. acephala)와 Early big (Brassicaoleracea var. italicaPlenck)의 유묘를 대상으로 elicitor로서 MeJA 처리에 따른 글루코시놀레이트 함량 변화를 분석하고, elicitor 처리로 인한 글루코시놀레이트 성분의 함량 변화에 따른 전사체 발현을 비교 분석을 수행하였다. 이로부터 양배추류 식물체내 글루코시놀레이트 생합성 유전 기작과 함량 증가와 관련된 유전자를 발굴하고자 하였다. 본 연구 결과는 사람에게 유용한 기능성 물질인 글루코시놀레이트 성분의 함량이 증대된 양배추 소재 개발을 위한 기초 자료로 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.

재료 및 방법

식물 재료 및 MeJA 처리

Rapid cycling B. oleracea인 TO1000DH3 (Brassicaoleracea var. acephala)와 브로콜리 Early big (Brassicaoleracea var. italicaPlenck) 두 계통이 본 실험에 사용되었다. 종자를 상토에 파종하여 16시간의 광주기, 22°C와 50% 상대습도 조건에서 3주 간 키웠다. 3주 자란 TO1000DH3와 Early big 유묘에 200 μM의 MeJA를 분사하였고, 12, 24 및 48시간 후에 뿌리를 제거한 지상부를 채취하였다. MeJA를 처리하여 준비된 샘플은 글루코시놀레이트 함량 분석과 RNA 추출을 위하여 -80°C에 보관하였다.

글루코시놀레이트 추출 및 HPLC 분석

MeJA 처리 후 샘플링하여 얻은 시료는 동결건조하여 파쇄 하였다. 건조된 분말 시료 100 mg을 2 mL 튜브에 넣고 끓는 70% (v/v) methanol을 1.5 mL 첨가하여 혼합하였다. 70°C에서 5분동안 글루코시놀레이트를 추출하여 원심분리(12,000 rpm, 10 min, 4°C) 후 상층액을 수거하였다. 동일한 과정으로 총 3회 추출하여 각 상층액을 모두 합하였다. 미니 칼럼 충진용 DEAE Sephadex A-25는 초순수에 녹여 sodium acetate 0.5M을 넣고 H+형태로 활성화시켰다. Mini-column에 상기의 활성화된 DEAE Sephadex A-25를 넣은 후 글루코시놀레이트 추출물을 로딩 후 추출물이 다 빠지면 증류수 2 mL을 로딩하여 컬럼을 세척하였다. Aryl sulfatase solution (115 mg/5 mL) 75 μL를 넣은 후 16시간 동안 상온에서 정치하였다. 초순수 1.5 mL로 글루코시놀레이트를 용출하였고, 0.45 μm hydrophilic PTFE syringe filter (직경 13 mm)로 여과한 후 HPLC용 vial병에 넣어 냉장 보관하였다.

글루코시놀레이트 함량 분석은 1200 series HPLC system (Agilent Technologies, CA, USA)를 사용하였고, 분석 컬럼은 Inertsil ODS-3 column (150 × 3.0mm I.d., particle size 3μm)을 사용하였다. 컬럼 온도는 40°C, 검출 파장은 227 nm, 유량은 0.2 mL/min로 설정하였고, 시료는 automatic injector를 사용하여 10 μL 주입하였다. 초순수와 acetonitrile를 이동상 용액으로 사용하였다. Acetonitrile를 18분까지는 7 → 24%로 증가시키고, 32분까지는 24%를 유지시키고 32.1분에 24 → 7%로 감소, 40분까지 7%를 유지시켰다. 각 GSL 성분의 정량은 외부표준물질인 sinigrin (0.1mg/mL)의 HPLC 피크 면적과 각 성분의 면적을 비교하고 그 값에 response factor (Clarke, 2010)를 적용하여 정량화(μmol/g dry wt.)하였다.

RNA 추출 및 전사체 분석

MeJA를 처리하여 준비한 TO1000DH3와 Early big 샘플 로부터 TRIzol (Invitrogen, MA, USA)을 이용하여 total RNA를 추출하였다. 전사체 정보 생산을 위해 Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2 (catalog #RS-122-2001; Illumina, CA, USA)를 이용하여 paired-end library를 제작하였으며, RNA-seq은 염기서열 생산은 HiSeq2500 platform을 이용하여 수행되었다. Short read의 전처리 과정을 위하여 SolexaQA에서 제공하는 DynamicTrim과 LengthSort 프로그램을 사용하였으며 phred score Q≥20, short read length ≥25 기준으로 clean read를 선발하였다.

Quality trimming을 통해 얻은 clean read들은 Bowtie2 프로그램을 이용하여 TO1000DH3의 reference genome (GCA_ 000695525.1)에 mapping하여 유전자 발현양을 비교 분석하였다. 데이터의 편차에 대한 normalization은 DESeq library를 이용하여 수행하였다(Anders and Huber 2010). 획득한 전사체 중 글루코시놀레이트 생합성 경로 관련 유전자는 110개의 Arabidopsisthaliana 유전자를 이용하여 BLAST 분석 (e-value 1e-10, identity 70 이상)을 통해 선발하였다(Wang et al. 2011). 샘플 간 차별적으로 발현하는 유전자 (DEGs)는 발현값이 2배 이상 차이가 나는 ≥2 fold change와 FDR (False Discovery Rate)값 0.01 이하인 조건을 동시에 만족하는 전사체를 선발하여 분석하였다. 선발된 DEGs의 GO 분석은 web-based 분석 툴인 Plant Transcriptional Regulatory Map (http://plantregmap.cbi.pku.edu.cn/go.php)을 이용하여 cut-off value를 FDR값 0.05 이하로 설정하여 다중 비교 검정을 보정하였다.

결과 및 고찰

MeJA 처리에 따른 글루코시놀레이트 함량 변화

MeJA 처리가 유묘기 TO1000DH3와 Early big의 글루코시놀레이트 함량 변화에 영향을 주는지 알아보기 위하여 3주 자란 유묘기 식물체에 MeJA를 분사하여 글루코시놀레이트 함량 변화를 검사하였다. TO1000DH3와 Early big 유묘기 식물체에서 알리패틱 글루코시놀레이트 3종류(progoitrin, sinigrin, gluconapin)와 인돌 글루코시놀레이트 3종류(glucobrassicin, 4-methoxyglucobrassicin, neoglucobrassicin)가 검출되었다(Fig. 1, Supplemental Table 1). 이 결과는 Robin et al. (2016)Bhandari et al. (2015)에서 보고한 양배추의 주요 글루코시놀레이트 성분과 일치하는 것으로 나타났다. 글루코시놀레이트 총 함량은 MeJA를 처리함으로써 TO1000DH3와 Early big에서 시간 별로 각각 1.3 (12 h) ~ 1.5배 (24 h), 1.3 (12 h) ~3.8배 (24 h) 증가하였는데, MeJA 처리 후 24시간 샘플에서 TO1000DH3는 25.646 ± 1.282 μmol/g dry wt., Early big은 32.366 ± 1.618 μmol/g dry wt.로 글루코시놀레이트 총 함량이 가장 많이 증가되었다(Fig. 1, Supplemental Table 1). MeJA를 처리하기 전 알리패틱 글루코시놀레이트 함량은 Early big (0.539 ± 0.027 μmol/g dry wt.)보다 TO1000DH3 (12.678 ± 0.633 μmol/g dry wt.)에서 약 23.5배 많았고, progoitrin과 gluconapin은 TO1000DH3에서만 검출되었다. 인돌릭 글루코시놀레이트 함량은 TO1000DH3 (3.255 ± 0.162 μmol/g dry wt.)보다 Early big (7.813 ± 0.390 μmol/g dry wt.)에서 약 2.4배 많았다. TO1000DH3에서 MeJA 처리에 의해 progoitrin 함량은 12시간 후 유의하게 19.2% 감소하였지만 48시간 후 처리 전보다 11.3% 증가하였다. Sinigrin의 함량 변화는 MeJA 처리에 의해 12시간째 TO1000DH3와 Early big에서 23.7%, 60.2% 증가하였다. 그러나 TO1000DH3에서는 MeJA 처리 후 24시간(7.7%), 48시간(29.0%) 후 지속적으로 감소하는 경향을 보였고, Early big에서는 MeJA 처리 후 24시간(8.9%), 48시간(58.8%) 증가하였다. TO1000DH3에서 gluconapin 함량 변화는 MeJA 처리 후 48시간 샘플에서 23.6% 유의하게 감소하였다. Glucobrassicin과 neoglucobrassicin 함량 변화는 MeJA 처리 후 24시간이 지났을 때 TO1000DH3와 Early big에서 공통적으로 가장 많이 증가하였다(Fig. 1). 특히 glucobrassicin 함량이 Early big에서 MeJA 처리에 의해 24시간째 3.4배로 크게 증가하였는데, glucobrassicin의 분해산물인 indole-3-cabinol은 사람 또는 동물 세포에서 항암 물질로 알려져 있다(Keck and Finley 2004; Kim and Milner 2005; Zhang and Talalay 1994). 4-methoxyglucobrassicin 함량은 TO1000DH3에서는 MeJA 처리 후 12시간 샘플에서 유의하게 40.4% 증가하였고, Early big에서는 MeJA 처리 후 24시간 샘플에서 57.8%로 가장 많이 증가하였다 (Fig. 1). 8일 자란 브로콜리, 순무, 적무 새싹에 6 종류의 biotic elicitor (25 μM methyl jasmonate, 150 μM jasmonic acid, 100 μM salicylic acid, 277 mM glucose, 146 mM sucrose, 5 mM methionine)를 처리한 결과 글루코시놀레이트 함량이 증가된 결과가 보고되었다 (Baenas et al. 2014). 보고된 연구에서는 MeJA와 JA에 의해 글루코시놀레이트 총 함량과 glucoraphanin (MeJA를 처리한 브로콜리와 적무), glucobrassicin (MeJA 처리한 순무) 함량이 증가됨을 보여줬다. 본 결과를 통해 200 μM MeJA 처리는 3주 자란 유묘기 TO1000DH3와 Early big의 글루코시놀레이트 총 함량과 각 성분들의 함량 증가에 영향을 주며, 함량 증가 정도는 두 계통에 다르게 나타나고, Early big에서 처리 전에 검출되지 않았던 progoitrin과 gluconapin은 처리 후 감소되는 경향을 보이는 것을 확인하였다.

Summary of transcriptome sequencing

Sample Name Yield (Mb) No of Reads >=Q30 Bases (%) Mean quality Score (PF)
TO1000DH3 0 h 4,018 39,781,624 93.2 37.425
12 h 4,499 44,548,290 94.1 37.705
24 h 4,450 44,055,948 93.9 37.640
48 h 4,525 44,807,256 93.6 37.555
Early big 0 h 4,369 43,258,974 93.8 37.615
12 h 4,186 41,439,280 94.3 37.765
24 h 4,426 43,823,826 94.2 37.745
48 h 4,446 44,016,610 94.3 37.765

Fig. 1.

Glucosinolate contents (μmol/g dry wt.) in TO1000DH3 and Early big seedlings at 0, 12, 24, and 48 hours after 200 μM methyl jasmonate treatment. The seedlings were grown for three weeks. *, Significant differences between MeJA treatments at P < 0.05



TO1000DH3와 Early big의 유묘기 유전자 발현 차이

유묘기 TO1000DH3와 Early big 식물체에 MeJA 처리 후 12, 24, 48시간까지의 전사체 정보 생산을 수행하였다. TO1000DH3는 4.0~4.5 Gb, Early big은 4.1~4.4 Gb의 raw data를 생산하여, Q30 이상의 우수한 질의 전사체 정보를 선발하여 생산 데이터의 93.2~94.3%의 정보를 확보하였다(Table 1). 생산된 정보는 quality trimming 후 assembly하여 reference gene sequence에 매치된 유전자들 중 raw read counts (>150)와 FDR 값 (<0.01)을 만족시키는 전사체를 총 59,225개 선발하였다. 이 중 모든 샘플에서 FPKM값이 0인 전사체를 제외하여 40,503개를 선발하여 발현양 비교분석에 사용하였다. MeJA를 처리하기 전 TO1000DH3와 Early big의 발현양을 비교한 결과 TO1000DH3 특이적으로 발현하는 전사체는 1,672개, Early big 특이적으로 발현하는 전사체는 1,116개, 공통적으로 발현하는 전사체는 28,337개였다(Fig. 2A). TO1000DH3와 Early big 특이적으로 발현하는 전사체의 기능적 분류를 위하여 Plant Transcriptional Regulatory Map을 이용하여 GO 분석을 수행하였다. GO term은 세 개의 주된 category (biological process, cellular component, and molecular function)로 나눌 수 있으며, 총 39개의 sub-category로 GO enrichment 되었다 (Table 2). TO1000DH3 특이적으로 발현하는 1,672개 전사체의 GO 분석 결과 biological process의 하위로는 response to stress (GO:0006950), defense response (GO:0006952), lipid transport (GO:0006869), lipid localization (GO:0010876) 및 regulation of shoot system development (GO:0048831)가 enrich된 그룹이었다. Molecular function에서는 O-methyltransferaes activity (GO:0008171)가 가장 큰 그룹이었고, cellular component에서는 DNA-directed RNA polymerase I, II complex (GO:0005736, GO:0005665)에 enrichment 되었다 (Table 2). Early big특이적으로 발현하는 1,116개 전사체의 GO 분석 결과 biological process의 하위로는 purine nucleoside monophosphate biosynthetic process (GO:0009127), ATP biosynthetic process (GO:0006754)가 많은 비중을 차지하는 그룹이었다. Molecular function에서는 cation-transporting ATPase activity (GO:0019829), ATPase activity (GO:0042625, GO:0044769)가 가장 큰 그룹이었고, cellular component에서는 proton-transporting two-sector ATPase complex (GO:0016469)가 enrichment 되었다(Table 2). GO enrichment 분석 결과 MeJA 처리하기 전 TO1000DH3 특이적으로 발현하는 전사체는 주로 stress나 defense 반응에 관여하거나, 생장과 관련되었고, Early big 특이적으로 발현하는 전사체는 주로 nucleoside 또는 ATP 생합성 관련 기능으로 특징이 구분되었다.

GO enrichment results of TO1000DH3 and Early big seedling specific expressed transcripts (FDR<0.05). GO term enrichments were calculated with the Plant Transcriptional Regulatory Map (http://plantregmap.cbi.pku.edu.cn/go.php). BP, biological process; MF, molecular function; CC, cellular component

  GO terms GO ID Count p-value Aspect
TO1000DH3 specific expressed transcripts
 Response to stress GO:0006950 116 0.00269 BP
 Defense response GO:0006952 63 0.00048 BP
 Lipid transport GO:0006869 14 0.00012 BP
 Lipid localization GO:0010876 14 0.00056 BP
 Regulation of shoot system development GO:0048831 14 0.00062 BP
 Regulation of leaf development GO:2000024 6 0.00071 BP
 Alkaloid metabolic process GO:0009820 5 9e-05 BP
 Alkaloid biosynthetic process GO:0009821 4 0.00024 BP
 Positive regulation of response to biotic stimulus GO:0002833 4 0.00209 BP
 Defense response to insect GO:0002213 4 0.00144 BP
 Regulation of leaf senescence GO:1900055 4 0.00174 BP
 Response to salt GO:1902074 3 0.0023 BP
 Entrainment of circadian clock by photoperiod GO:0043153 2 0.00189 BP
O-methyltransferase activity GO:0008171 8 4.5e-06 MF
 Amine-lyase activity GO:0016843 5 6.2e-05 MF
 Strictosidine synthase activity GO:0016844 5 2.3e-05 MF
 DNA-directed RNA polymerase I complex GO:0005736 4 0.0013 CC
 DNA-directed RNA polymerase II, core complex GO:0005665 4 0.0018 CC

Early big specific expressed transcripts
 Purine nucleoside monophosphate biosynthetic process GO:0009127 9 1.7e-05 BP
 Purine ribonucleoside monophosphate biosynthetic process GO:0009168 9 1.7e-05 BP
 Ribonucleoside monophosphate biosynthetic process GO:0009156 9 0.00011 BP
 ATP biosynthetic process GO:0006754 8 3.6e-06 BP
 Purine nucleoside triphosphate biosynthetic process GO:0009145 8 8.9e-06 BP
 Purine ribonucleoside triphosphate biosynthetic process GO:0009206 8 8.9e-06 BP
 Ribonucleoside triphosphate biosynthetic process GO:0009201 8 2.2e-02 BP
 Nucleoside triphosphate biosynthetic process GO:0009142 8 4.8e-05 BP
 energy coupled proton transport, down electrochemical gradient GO:0015985 7 5.4e-06 BP
 ATP synthesis coupled proton transport GO:0015986 7 5.4e-06 BP
 Energy coupled proton transmembrane transport, against electrochemical gradient GO:0015988 6 8.7e-05 BP
 ATP hydrolysis coupled proton transport GO:0015991 6 8.7e-05 BP
 Cation-transporting ATPase activity GO:0019829 9 3.6e-05 MF
 ATPase activity, coupled to transmembrane movement of ions GO:0042625 9 0.00011 MF
 ATPase activity, coupled to transmembrane movement of ions, rotational mechanism GO:0044769 7 2.5e-05 MF
 Proton-transporting ATP synthase activity, rotational mechanism GO:0046933 6 7.9e-06 MF
 Proton-transporting two-sector ATPase complex GO:0016469 7 0.00013 CC
 Proton-transporting ATP synthase complex, catalytic core F(1) GO:0045261 6 1.3e-07 CC
 Proton-transporting two-sector ATPase complex, catalytic domain GO:0033178 6 4.1e-06 CC
 Proton-transporting ATP synthase complex GO:0045259 6 6.1e-05 CC
 Mitochondrial proton-transporting ATP synthase complex GO:0005753 5 6.9e-05 CC
 Mitochondrial proton-transporting ATP synthase complex, catalytic core F(1) GO:0000275 4 3.3e-06 CC

Fig. 2.

Venn diagram represents the number of differentially expressed genes identified through pairwise comparisons. (A) Differentially expressed genes between TO1000DH3 and Early big. (B) Number of up-(red) and down-regulated (blue) transcripts in different pairwise comparisons under MeJA treatment



MeJA 처리에 의해 변화하는 Differentially expressed genes (DEGs) 분석

식물에 MeJA를 처리하면 에틸렌 생합성과 옥신 반응성 및 수송을 저해하고, 세포 내에서 이차대사계를 활성화시키는 것으로 알려져 있다(Gutjahr et al. 2005; Soto et al. 2012). TO1000DH3와 Early big에 MeJA를 처리하여 발현이 변하는 전사체를 분석하기 위하여, MeJA 처리 전 샘플과 비교했을 때 MeJA 처리에 의해 발현이 2배 이상 변하는 전사체를 TO1000DH3에서12,020개(up-regulated transcript 5,887개, down-regulated transcript 6,133개), Early big에서 13,510개(up-regulated transcript 6,955개, down-regulated transcript 6,555개)를 선발하였다(Fig. 2B). TO1000DH3와 Early big에서 MeJA 처리 후 12, 24, 48 시간에 따라 2배 이상 발현이 변한 전사체의 GO 분석을 수행하였다. Up-regulated된 전사체를 비교해보면 TO1000DH3와 Early big에서 공통적으로 response to stimulus (GO:0050896), response to chemical (GO:0042221), response to oxygen-containing compound (GO:1901700), response to acid chemical (GO:0001101) 및 oxidoreductase activity (GO:0016491)에 GO enrichment 되었다(Table 3). 2배 이상 발현이 증가한 전사체의 GO enrichment 결과 response to organic substance (GO:0010033), organic acid metabolic process (GO:0006082), oxoacid metabolic process (GO:0043436), tetrapyrrole binding (GO:0046906), oxygen binding (GO:0019825) 및 dioxygenase activity (GO:0051213)는 TO1000DH3에서만 확인되었다. 반면에 response to organic substance (GO: 0010033), response to jasmonic acid (GO:0009753), ion binding (GO:0043167), transferase activity (GO:0016740) 및 transcription factor activity (GO:0003700)는 Early big에서만 확인되었다 (Table 3). MeJA 처리에 의해 2배 이상 발현이 감소한 전사체의 GO enrichment 결과 single-organism process (GO:0044699), response to stimulus (GO:0050896), ribosome biogenesis (GO: 0042254), protein binding (GO:0005515), DNA binding (GO: 0003677), transcription factor activity (GO:0003700), protein dimerization activity (GO:0046983), transferase activity (GO:0016741), structural constituent of ribosome (GO:0003735), rRNA binding (GO:0019843) 및 snoRNA binding (GO:0030515)는 TO1000DH3와 Early big 공통적으로 enrichment 되었다(Table 4). MeJA 처리 후 2배 이상 발현이 감소한 전사체 중 TO1000DH3에서는 regulation of transcription (GO:0006355)과 binding 관련(ion binding, ADP binding), metabolic process (nucleic acid metabolic process, RNA metabolic process, ncRNA metabolic process, rRNA metabolic process) 관련 GO term이 주로 enrichment 되었다. Early big에서는 스트레스 관련(response to abiotic stimulus, response to organic substance, response to chemical, response to hormone), 광합성 관련(photosynthesis, plastid organization, carbon fixation), 펩타이드 합성 관련(amide biosynthetic process, translation) GO가 enrichment 되었다(Table 4).

GO enrichment results of up-regulated differentially expressed genes by MeJA treatment (FDR<0.05)

 GO terms GO ID TO1000DH3 Early big


12 h 24 h 48 h 12 h 24 h 48 h
Biological Process
 Single-organism process GO:0044699 1,859 963 2,107 1,270 1,083
 Single-organism cellular process GO:0044763 1,419 1,623 974
 Response to stimulus GO:0050896 1,238 649 569 1,357 770 708
 Single-organism metabolic process GO:0044710 964 528 1,064 652
 Response to stress GO:0006950 712 353 811 474 447
 Response to chemical GO:0042221 675 365 313 693 415 386
 Response to abiotic stimulus GO:0009628 477 548
 Response to organic substance GO:0010033 477 235
 Response to oxygen-containing compound GO:1901700 412 225 197 435 263 250
 Response to acid chemical GO:0001101 329 194 167 349 225 210
 Response to organic substance GO:0010033 503
 Response to endogenous stimulus GO:0009719 243 218 255
 Organic acid metabolic process GO:0006082 212
 Oxoacid metabolic process GO:0043436 211
 Response to wounding GO:0009611 75 63 75
 Secondary metabolic process GO:0019748 109 125 123
 Response to hormone GO:0009725 205 239
 Response to jasmonic acid GO:0009753 69

Molecular Function
 Catalytic activity GO:0003824 1,503 772 1,760 1,055
 Transporter activity GO:0005215 315 322 200
 Oxidoreductase activity GO:0016491 194 383 208 379 251 222
 Active transmembrane transporter activity GO:0022804 164 164 109
 Transmembrane transporter activity GO:0022857 131 275 280 179 157
 Tetrapyrrole binding GO:0046906 77 116 67
 Iron ion binding GO:0005506 64 65 77 73
 Drug transporter activity GO:0090484 43 30
 Ion binding GO:0043167 1,189
 Transferase activity GO:0016740 770
 Transcription factor activity, sequence-specific DNA binding GO:0003700 406 222
 Secondary active transmembrane transporter activity GO:0015291 115 65 121 79 80
 Heme binding GO:0020037 67 72 77
 Monooxygenase activity GO:0004497 57 59 66
 Oxygen binding GO:0019825 44 50
 Dioxygenase activity GO:0051213 32
 Drug transmembrane transporter activity GO:0015238 40 29

Cellular Component
 Intracellular GO:0005622 2,115
 Cytoplasm GO:0005737 1,365
 Membrane GO:0016020 1,345 1,467 828 699
 Intrinsic component of membrane GO:0031224 957 1,065 607 524
 Integral component of membrane GO:0016021 914 1,034 592 511
 Cell periphery GO:0071944 630 292 668 387
 Plasma membrane GO:0005886 514 553
 Vacuole GO:0005773 233 138 105 161 120
 Cell wall GO:0005618 85
 External encapsulating structure GO:0030312 85
 Endoplasmic reticulum lumen GO:0005788 13
 Anthranilate synthase complex GO:0005950 6 6 6
 ER body GO:0010168 6 6
 Integral component of plasma membrane GO:0005887 49 41
 Apoplast GO:0048046 51
 Extracellular space GO:0005615 24
 Lytic vacuole GO:0000323 13
 CCAAT-binding factor complex GO:0016602 7

GO enrichment results of down-regulated differentially expressed genes by MeJA treatment (FDR<0.05)

 GO terms GO ID TO1000DH3 Early big


12 h 24 h 48 h 12 h 24 h 48 h
Biological Process
 Single-organism process GO:0044699 1,417 1,591
 Response to stimulus GO:0050896 864 942
 Regulation of transcription, DNA-templated GO:0006355 409
 Organic cyclic compound metabolic process GO:1901360 807
 Heterocycle metabolic process GO:0046483 763
 Heterocycle biosynthetic process GO:0018130 519
 Response to abiotic stimulus GO:0009628 351
 Response to organic substance GO:0010033 350 203
 Photosynthesis GO:0015979 71 78
 Plastid organization GO:0009657 70
 Carbon fixation GO:0015977 17
 Nucleic acid metabolic process GO:0090304 273 234
 RNA metabolic process GO:0016070 245 207
 Cellular component biogenesis GO:0044085 124
 Ribosome biogenesis GO:0042254 73 143 86
 ncRNA metabolic process GO:0034660 60
 rRNA metabolic process GO:0016072 48
 Ribosomal large subunit biogenesis GO:0042273 19
 Organonitrogen compound biosynthetic process GO:1901566 336 214
 Amide biosynthetic process GO:0043604 254
 Translation GO:0006412 249 158
 Peptide biosynthetic process GO:0043043 249 158
 Nucleobase-containing compound metabolic process GO:0006139 248
 Transcription, DNA-templated GO:0006351 156
 Cell cycle GO:0007049 49
 Response to endogenous stimulus GO:0009719 182
 Response to hormone GO:0009725 172
 Cell cycle process GO:0022402 40
 RNA biosynthetic process GO:0032774 158
 Nucleobase-containing compound biosynthetic process GO:0034654 169
 Response to chemical GO:0042221 249
 Nucleic acid-templated transcription GO:0097659 158
 Mitotic cell cycle process GO:1903047 28

Molecular Function
 Protein binding GO:0005515 896 987
 Ion binding GO:0043167 845
 DNA binding GO:0003677 410 149 390
 Transcription factor activity, sequence-specific DNA binding GO:0003700 306 105 283
 Molecular transducer activity GO:0060089 76
 Signal transducer activity GO:0004871 68
 ADP binding GO:0043531 44
 Catalytic activity GO:0003824 1,339
 Protein dimerization activity GO:0046983 55 117
 Transferase activity, transferring one-carbon groups GO:0016741 38 81
 Single-stranded RNA binding GO:0003727 23
 Structural constituent of ribosome GO:0003735 63 206 139
 rRNA binding GO:0019843 20 74 49
 snoRNA binding GO:0030515 12 9
 RNA binding GO:0003723 202
 Unfolded protein binding GO:0051082 22
 Large ribosomal subunit rRNA binding GO:0070180 10 7
 Poly-pyrimidine tract binding GO:0008187 9
 Poly(U) RNA binding GO:0008266 9
 C-22 sterol desaturase activity GO:0000249 4
 Motor activity GO:0003774 14
 Copper ion binding GO:0005507 34
 Microtubule binding GO:0008017 15
 Cytoskeletal protein binding GO:0008092 23
 Tubulin binding GO:0015631 16
 Antioxidant activity GO:0016209 22
 Xyloglucan:xyloglucosyl transferase activity GO:0016762 11
 Ribulose-bisphosphate carboxylase activity GO:0016984 4
 Xyloglucan endotransglucosylase activity GO:0080039 4

Cellular Component
 Intracellular GO:0005622 1,495
 Organelle GO:0043226 1,302
 Intracellular organelle GO:0043229 1,300
 Membrane-bounded organelle GO:0043227 1,250 1,617
 Nucleus GO:0005634 654 244
 Plasma membrane GO:0005886 389
 Plastid GO:0009536 590 559
 Chloroplast GO:0009507 577 546
 Plastid stroma GO:0009532 229
 Chloroplast stroma GO:0009570 218 217
 Intracellular non-membrane-bounded organelle GO:0043232 169
 Non-membrane-bound organelle GO:0043228 169 219
 Ribonucleoprotein complex GO:0030529 102 181
 Ribosome biogenesis GO:0042254 73
 Nucleolus GO:0005730 70
 Cytosolic part GO:0044445 58 173 132
 Cytosolic ribosome GO:0022626 57 173 131
 Ribosomal subunit GO:0044391 55 170
 Large ribosomal subunit GO:0015934 43
 Cytosolic large ribosomal subunit GO:0022625 36 66
 Ribosome GO:0005840 226 157
 Thylakoid GO:0009579 202
 Intracellular non-membrane-bounded organelle GO:0043232 219
 Cytoskeletal part GO:0044430 24
 Cytosolic small ribosomal subunit GO:0022627 46
 Kinesin complex GO:0005871 11


유묘기 TO1000DH3와 Early big에 MeJA를 처리하였을 때 글루코시놀레이트 함량과 연관되어 발현이 변화하는 전사체를 선발하기 위하여, 글루코시놀레이트 분석 결과 유의하게 함량이 증가하거나 감소한 샘플에서 MeJA 처리 전보다 발현이 2배 이상 증가 또는 감소하는 전사체를 선발하였다 (Fig. 3). MeJA에 의해 glucobrassicin, neoglucobrassicin 함량과 연관되어 발현이 2배 이상 증가한 434개의 전사체는 secondary metabolic process (GO:0019748), glucosinolate metabolic process (GO:0019760), response to wounding (GO:0009611) 및 response to jasmonic acid (GO:0009753)에 enrichment되었다. 특히 인돌릭 글루코시놀레이트 생합성과 관련된 MYB34 (Bo7g098110), IGMT2 (Bo8g070650), CYP81D1 (Bo6g056440), CYP81D4 (Bo7 g118500), CYP81F4 (Bo1g004730, Bo01007s020), CYP81G1 (Bo4g154660), CYP83B1 (Bo8g024390)및 CYP91A2 (Bo1g003710)가 MeJA에 의해 발현이 TO1000DH3와 Early big에서 모두 증가하였다. 산화를 통해 핵심구조 (core structure)를 형성하는 Cytochrome P450 (CYP)는 heme을 prosthetic group으로 갖는 superfamily 효소군으로 환경 자극이나 외부 물질에 대해 산화 대사 작용을 수행하는 필수 촉매 효소로 알려져 있다 (Schlichting et al., 2000). BrCYP79F1은 청색광과 적색광에 노출된 배추 유묘에서 발현이 유도되었으며 글루코시놀레이트 합성을 촉진시킬 수 있다는 연구 결과가 보고되었다 (Moon et al., 2015). Glucobrassicin, neoglucobrassicin 함량과 연관되게 MeJA 처리 후 모든 샘플에서 발현이 2배 이상 감소한 전사체 10개는 intracellular signal transduction (GO:0035556), phosphorelay signal transduction system (GO:0000160) 및 cytokinin-activated signal pathway (GO:0071368)에 enrichment 되었다(Fig. 3). 4-methoxyglucobrassicin 함량이 유의하게 변한 TO1000DH3의 24시간 샘플과 Early big 24, 48시간에서 발현이 증가한 전사체 808개는 주로 chemical에 반응하는 전사체였고(GO:0042221, GO:0001101), 발현이 감소한 218개 전사체는 호르몬에 반응하고(GO:0009725), cytokinin-activated signaling pathway (GO: 0009736)에 포함되며 carbon fixation (GO:0015977)에 관련된 기능을 하였다. TO1000DH3에만 분포하는 gluconapin 함량과 관련하여 발현이 증가한 전사체 166개는 regulation of nitrogen compound metabolic process (GO:0051171), regulation of shoot system development (GO:0048831) 및 transcription factor activity (GO:0003700)에 관련되었고, 발현이 감소한 395개 전사체는 세포분열(GO:0051301, GO:0000280, GO:1903047)과 protein-disulfide reductase activity (GO:0047134)에 enrichment 되었다. Sinigrin 함량과 관련하여 발현이 증가한 28개 전사체는 phosphorelay signal transduction system (GO:0000160), ethylene-activated signaling pathway (GO:0009873) 및 calcium ion binding (GO:0005509) 기능을 하였고, 발현이 감소한 6개 전사체는 신호전달 (GO:0044700, GO:0007154)과 protein binding (GO:0005515)에 관련되었다. Progoitrin 함량과 연관되게 발현이 증가한 76개 전사체는 glyphosate metabolic process (GO:0018920), 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase activity (GO:0003866)에 enrichment 하였고, 발현이 감소한 175개 전사체는 cell cycle (GO:0007049), nucleic acid metabolic process (GO:0090304), nuclear division (GO:0000280), maintenance of inflorescence meristem identity (GO:0010077), organelle fission (GO:0048285), organic cyclic compound metabolic process (GO:1901360), meiotic chromosome segregation (GO:0045132) 및 protein dimerization activity (GO: 0046983) 기능에 관련되었다.

Fig. 3.

GO enrichment of DEGs correlated with glucosinolate content changes following MeJA treatment (FDR<0.05). GO term enrichments were analyzed using the Plant Transcriptional Regulatory Map (http://plantregmap.cbi.pku.edu.cn/go.php)



MeJA 처리에 따른 글루코시놀레이트 생합성 경로 관련 유전자 발현 profiling

TO1000DH3와 Early big에서 글루코시놀레이트 생합성 경로 관련 유전자를 선발하기 위하여 Arabidopsisthaliana에서 보고된 글루코시놀레이트 생합성 관련 유전자 110개의 염기서열의(Wang et al. 2011) ortholog 전사체 104개를 선발하였다(Fig. 4). Transcription factor 중 MeJA를 처리하기 전 MYB28의 발현양이 가장 많았고, Bo2g161590Bo9g014610은 TO1000DH3와 Early big에서 공통적으로 MeJA를 처리 후 12시간째 발현양이 각각 4.7배, 3.3배 감소하였고, 이후 발현양은 다시 증가하는 경향을 보였다. Bo7g098590은 반대로 MeJA 처리 후 12시간이 지나면서 TO1000DH3와 Early big에서 발현양이 1.4배, 4.1배 증가하였다. MYB29 (Bo9g175680), MYB34 (Bo2g161180, Bo2g161170, Bo7g098110, Bo9g014380), MYB51 (Bo8g067910, Bo8g104300), MYB122 (Bo6g118350), Dof1.1 (Bo8g010700, Bo8g112940)의 발현양은 MeJA 처리 후 12시간째 가장 높았다. Dof1.1 (Bo5g008360)은 TO1000DH3보다 Early big에서의 발현양이 3.4~9.0배 많이 발현하여 MeJA 처리에 의해 Early big 특이적으로 발현하는 transcription factor로 분석되었다. Side-chain elongation 기능을 하는 대부분의 전사체가 TO1000DH3와 Early big에서 공통적으로 MeJA 처리 후 12시간에 발현양이 증가하는 경향을 보였다. 그러나 BCAT3 (Bo8g078930)의 발현은 TO1000DH3에서는 MeJA 처리 후 1.6~3.4배 증가하였지만, Early big에서는 오히려 MeJA 처리에 의해 발현이 1.3~1.5배 감소하였다. Core structure formation과 관련된 전사체 다수가 MeJA 처리에 의해 발현이 증가하였고, UGT74C1 (Bo4g177540)은 Early big 특이적으로 발현하였으며 MeJA 처리 후 12시간에 8.0배 증가하였다. Side chain modification 관련된 전사체 중 AOP1, IGMT1, IGMT2, CYP81F1CYP81F2의 발현은 매우 낮았다. AOP3 (Bo9g006220, Bo9g006240)는 TO1000DH3 특이적으로 MeJA 처리에 의해 발현이 증가하였고, GSL-OH (Bo4g173560, Bo4g173550, Bo4g173530)은 Early big 특이적으로 발현하였다. Co-substrate pathway에 해당하는 전사체대부분 MeJA 처리에 의해 발현이 증가하였으며 특히 12시간 후 발현양이 가장 높았다. Early big에서 MeJA 처리에 따라 함량 증대가 가장 컸던 glucobrassicin의 상위 유전자인 APK1 (Bo9g022580, Bo3g088400)의 발현은 MeJA 처리 후 24시간이 지나면서 TO1000DH3에서는 3.2~4.3배 증가하였고, Early big에서는 5.2~5.4배 증가하였다. 이러한 전사체의 발현양 증가는 MeJA 처리에 의한 글루코시놀레이트 함량 증가에 영향을 줄 수 있는 것으로 여겨진다. 글루코시놀레이트 분해 산물 형성과 관련된 myrosinase 중 TGG1 (Bo14804s010)은 TO1000DH3에서만 MeJA에 의해 1.1~1.5배 증가하였고, TGG4는 TO1000DH3와 Early big에서 발현양이 매우 적었다(Fig. 4). 브로콜리 새싹에서 글루코시놀레이트 breakdown product 함량과 myrosinase의 발현양이 연관되어 있음이 보고되었고(Gao et al. 2014), Arabidopsisthaliana에서 ABA와 MeJA signaling에 의해 크게 증가한 TGG1의 발현양이 공변세포 조절과 관련되었음이 보고되었다(Zhao et al. 2008; Islam et al. 2009). 본 실험 결과 양배추에서 메틸자스메노이트 처리에 의해 증가한 글루코시놀레이트 함량과 myrosinase 발현양 변화가 관련되어 있음을 생각해볼 수 있다. Epithioester protein 중 NIT1 (Bo2g013450), PEN3 (Bo6g 079920), ESM1 (Bo5g130540) 및 MVP1 (Bo6g050840)은 MeJA 처리에 의해 TO1000DH3와 Early big에서 공통적으로 발현이 증가하였다(Fig. 4). 유묘기 TO1000DH3와 Early big에서 공통적으로 MeJA 처리에 의해 글루코시놀레이트 함량이 증가한 결과(Fig. 1)와 마찬가지로, 대부분의 글루코시놀레이트 생합성 경로 관련 전사체의 발현 또한 MeJA 처리에 따라 증가하는 경향을 보였다. Transcription factor 중 MYB29, TFL2, Dof1.1은 MeJA 처리 후 발현이 증가하였고, MYB28, MYB51은 감소하였으며, MYB34, MYB122는 MeJA 처리 후 12시간에서 증가하였다 감소하는 패턴을 보였다. Side change elongation, core structure formation 및 co-substrate pathway 관련 전사체들은 TO1000DH3와 Early big에서 모두 MeJA 처리 후 12시간에 발현이 증가하였다 감소되는 패턴을 보였다. Side chain modification 관련 전사체 중 FMOGS-OX1, IGMT2, CYP81F4, GSL-OH는 MeJA 처리 후 12시간에서 가장 많이 증가 후 감소하였다. Myrosinase 중 TGG1은 TO1000DH3 특이적으로 발현이 증가했으며, epithiester protein 중 NIT1, MVP1은 MeJA 처리 후 12시간에서 증가하였다 감소하는 패턴을 보였다. PEN3는 12시간에서 감소 후 증가하는 경향을 보였고, ESM1은 증가하였다. 본 연구에서 전사체 분석을 통해 얻어진 유묘기 TO1000DH3와 Early big에서 MeJA 처리 시간에 따라 증가 또는 감소되는 전사체 및 글루코시놀레이트 생합성 경로 관련 전사체의 발현 및 정보는 기능성 물질 함량이 증대된 양배추 소재 개발에 기초 자료가 될 것으로 사료된다.

Fig. 4.

Expression patterns of glucosinolate biosynthesis pathway transcripts in response to MeJA treatment. The heat map was generated using FPKM values of the selected transcripts. Columns represent samples from different points in time after MeJA treatment, and colors represent the expression profile


적 요

본 연구의 목적은 유묘기 TO1000DH3와 Early big에서 MeJA 처리에 의해 글루코시놀레이트 함량 변화 및 유전자의 발현 변화를 분석하기 위하여 수행되었다. 200 uM 농도의 MeJA를 처리하여 글루코시놀레이트 함량을 분석한 결과, 글루코시놀레이트 총 함량이 처리 전보다 TO1000DH3에서 1.3~1.5배, Early big에서 1.3~3.8배 증가하였다. 알리패틱 글루코시놀레이트인 progoitrin과 gluconapin은 TO1000DH3에서만 검출되었으며, neoglucobrassicin 성분의 함량 변화가 MeJA 처리 48시간 후 TO1000DH3와 Early big에서 가장 크게 증가되었다. 전사체 분석을 통해 TO1000DH3에서는 stress나 defense 반응에 관여하거나, 생장과 관련된 전사체가 특이적으로 발현하고, Early big에서는 nucleoside 또는 ATP 생합성 관련 전사체가 특이적으로 발현하는 것을 알 수 있었다. MeJA를 처리함에 따라 발현이 2배 이상 변한 전사체를 TO1000DH3에서 12,020개, Early big에서 13,510개를 선발하여 GO 분석한 결과 stimulus, chemical에 반응하는 전사체의 발현이 공통적으로 증가하였고, single-organism 및 ribosome 합성 관련 전사체의 발현이 공통적으로 감소하였다. 특히 glucobrassicin, neoglucobrassicin 함량과 연관되어 발현이 증가한 인돌릭 글루코시놀레이트 생합성 관련 전사체의 발현이 모두 증가하였다 (MYB34 (Bo7g098110), IGMT2 (Bo8g070650), CYP81D1 (Bo6g056440), CYP81D4 (Bo7g118500), CYP81F4 (Bo1g004730, Bo01007s020), CYP81G1 (Bo4g154660), CYP83B1 (Bo8g024390)및 CYP91A2 (Bo1g003710)). 글루코시놀레이트 생합성 경로 관련 유전자를 대표하는 전사체 104개를 선발하여 발현 양상을 분석한 결과 transcription factor에 속하는 MYB28, MYB51의 발현은 MeJA 처리 전에 비해 처리 후 발현양이 감소하였지만, 대부분의 전사체의 발현은 MeJA 처리에 의해 증가하였다. MeJA 처리에 의해 AOP3 (Bo9g006220, Bo9g006240), TGG1 (Bo14804s010)는 TO1000DH3에서만 특이적으로 발현이 증가하였고, Dof1.1 (Bo5g008360), UGT74C1 (Bo4g177540), GSL-OH (Bo4g173560, Bo4g173550, Bo4g173530)는 Early big 특이적으로 발현이 증가하였다. MeJA 처리 전 두 계통에서 발현이 가장 높은 글루코시놀레이트 생합성 관련 유전자는 GSTU20이었고, MeJA 처리에 의해 12시간 후 TO1000DH3에서 CYP79B2 (Bo7g118840), Early big에서는 CYP79B3 (Bo4g149550)의 발현이 가장 많이 증가하였다.

사 사

본 연구는 농림축산식품부 Golden Seed 프로젝트(213007-05-1-SB610)와 한국생명공학연구원 연구사업의 지원에 의해 수행되었다.

Supplementary
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