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Gene expression and SNP identification related to leaf angle traits using a genome-wide association study in rice (Oryza sativa L.)
J Plant Biotechnol 2018;45:17-29
Published online March 31, 2018
© 2018 The Korean Society for Plant Biotechnology.

Me-Sun Kim, Yeisoo Yu, Kwon-Kyoo Kang, and Yong-Gu Cho

Department of Crop Science, Chungbuk National University, Cheongju 28644, Korea,
DNACARE, Seoul 06730, Korea,
Department of Horticultural Science, Hankyong National University, Ansung 17579, Korea
Correspondence to: e-mail: ygcho@cbnu.ac.kr
Received March 7, 2018; Revised March 15, 2018; Accepted March 15, 2018.
cc This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract

This study was conducted to investigate a morphological trait in 294 rice accessions including Korean breeding lines. We also carried out a genome-wide association study (GWAS) to detect significant single nucleotide polymorphism markers and candidate genes affecting major agronomic traits. A Manhattan plot analysis of GWAS using morphological traits showed that phenotypic and statistical significance was associated with a chromosome in each group. The significance of SNPs that were detected in this study was investigated by comparing them with those found previously studied QTL regions related to agronomic traits. As a result, SNP (S8-19815442), which is significant with regard to leaf angle, was located in the known QTL regions. To observe gene mutations related to leaf angle in a candidate gene, Os08g31950, its sequences were compared with sequences in previously selected rice varieties. In Os08g31950, a single nucleotide mutation occurred in one region. To compare relative RNA expression levels of candidate gene Os08g31950, obtained from GWAS analysis of 294 rice accessions and related to lateral leaf angle, we investigated relative levels by selecting 10 erect leaf angle varieties and 10 horizontal leaf angle varieties and examining real-time PCR. In Os08g31950, a high level of expression and various expression patterns were observed in all tissues. Also, Os08g31950 showed higher expression levels in the erect leaf angle variety group and higher expression rates in the leaf than in the root. The candidate gene detected through GWAS would be useful in developing new rice varieties with improved yield potential through future molecular breeding.

Keywords : GWAS, core-collection, rice, leaf angle, SNP
서언

차세대 염기서열 분석(NGS)은 유전체를 수많은 조각으로 나눈 뒤 각각의 염기서열을 조합하여 게놈을 해독하는 기술로써, 지난 십년간 그 분석기술이 비약적으로 발전해왔으며 식물육종분야에 있어서 새로운 혁명을 초래하고 있다(Perez-de-Castro et al. 2012; Blawid et al. 2017). NGS 장비의 발달은 많은 주요 작물들에 대한 게놈 정보의 해독을 가속화시키고 있으며, 다양한 작물에서 재래종, 야생종 등 resequencing 분석이나 GBS (genotyping by sequencing)등의 분석 방법으로 데이터를 대량 생산하고 있다. 또한, 벼 유전체 해독 프로젝트(IRGSP)에 의해 벼의 게놈 해독이 완료됨으로써 표준게놈을 기반으로 한 GWAS를 수행하여 SNP, InDel 등을 단기간에 개발할 수 있게 되었다(Huang et al. 2009; Nicolae et al. 2010; Kim et al. 2016). 한 예로, 중국에서는 재래종 벼를 이용한 교배집단에 대한 resequencing 분석을 통해 대량의 SNP를 탐색하여 GWAS를 이용하여 14개의 주요 농업형질에 연관된 유전자

를 보고하였다(Ma et al. 2016). 한편, 일본 Iwate 생물공학연구센터에서는 Iwate 현에 적합한 벼 품종을 개발하기 위해서 돌연변이 계통과 원품종과의 교배 후 F2 집단에서 돌연변이형을 가진 개체들의 DNA-bulk를 resequencing함으로써 표현형의 원인 유전자를 분리하는 MutMap 또는 MutMap-Gap 방법이 개발되었다(Abe et al. 2012; Takagi et al. 2013).

GWAS는 자연에 존재하는 개체나 계통을 대상으로 연속변이를 보이는 표현형과 연관을 나타내는 변이 게놈 전체에서 탐색하는 방법이다(Altshuler et al. 2008). GWAS가 수행되기 위해서는 최소 30,000개에서 최대 1,000,000개의 SNP가 요구되며, 인공적인 교배를 사용하지 않고 진화 과정에서 자연스럽게 발생하여 누적된 재조합 연관 분석을 실시하여 농업적으로 중요한 형질 관련 유전자를 동정할 수 있다(Hunter and Crawford 2008; Kruglyak 2008). 이러한 대규모 SNP마커 정보를 이용하여 복합적인 표현형 변이를 일으키는 유전적 변이들의 발견에 대해 많은 GWAS 연구들이 보고되어 왔다(Sladek et al. 2007; Weedon et al. 2007; Li et al. 2008; Wallace et al. 2008). 또한, 현재까지 발표된 변이는 표준 품종으로 자포니카인 Nipponbare를 기준으로 하였으나 IRRI의 생물정보팀에서는 Kasalath, IR64, DJ123 등 추가로 전장게놈에 대하여 유전변이지도를 작성함으로써 유전적 변이를 발굴하고 있다(Sakai et al. 2014; Schatz et al. 2014; Alexandrov et al. 2015).

벼의 수량은 식물체의 광합성에 의해 동화산물이 생성되고 전류되는데 관여하는 능력인 source와 종실에 축적될 수 있는 잠재력인 sink의 상호작용으로서, 전 생육과정을 통해 이루어지는 건물생산과 그 분배과정의 최종적인 결과라고 할 수 있다(Park et al. 2015). 벼의 주요 기관을 통하여 수량과 관련한 다양한 유전자 및 QTL이 보고되었다. 인디카 Habataki 품종에서 유래한 Gn1a (Grain number 1a)는 1번 염색체 단완에 위치하면서 사이토키닌 산화효소를 암호화하며, Gn1a의 발현이 줄어들게 되면 이삭 분열조직에 사이토키닌이 축적되고 수당립수가 증가하게 된다(Ashikari et al. 2005). DEP1 (DENSE AND ERECT PANICLE1)은 9번 염색체에 존재하며 대립유전자의 말단 부위에 절단 변이가 발생하여 phosphatidylethanolamine-binding protein-like domain protein의 기능을 상실하게 되면 수당립수가 증가된 고밀도 직립 이삭형태를 가져오게 된다(Huang et al. 2009). 또한, 현재까지 반단간 유전자로 알려진 sd-1을 비롯하여 줄기와 관련된 유전자와 QTL을 활용하여 벼의 생산성과 도복 저항성이 우수한 품종을 육성(Asano et al. 2007)하는 등의 접근이 많이 이루어지고 있다.

벼 수량관련 형질뿐만 아니라 종자의 휴면과 수발아성은 다양한 유전자와 환경의 상호작용에 의해 조절되는 양적형질이다. 최근 유전지도 기반 유전자 분석(map-based cloning)을 통해서 qSD1-2/qPH1 유전자가 GA 생합성에 관여하는 OsGA20ox2 유전자라는 것이 규명되었다(Ye et al. 2015). 그 밖에 qLTG-3-1 (Fujino et al. 2014), Sdr4(Sugimoto et al. 2010), qSd1-2와 같은 종자 휴면 관련 QTL이 확인되었으며 이들은 종자 등숙, 종자 수명, 종자 발아 등 다양한 종자 형질과 밀접하게 관련되어 있을 뿐 아니라 출수기, 초장 등 종자 이외의 농업형질과 관련성이 있는 것으로 보고되었다.

본 연구에서는 전세계에서 수집한 벼 294개 유전자원 핵심집단을 대상으로 엽 형태 특성에 대한 조사를 수행하였고 GWAS 분석을 실시하여 형질 관련 SNP 마커를 탐색하고, 벼의 생육 및 수량 증대에 이용할 수 있는 유전자원들을 탐색하여 유전체 육종에 필요한 기초자료를 제공하고자 하였다.

재료 및 방법

실험재료 및 형태적 특성 조사

본 연구에서 이용한 벼 유전자원은 세계 각국에서 수집된 24,000여점의 유전자원 중 도입종(introduced), 국내에서 수집된 유전자원 중 육성종(breeding line), 잡초성벼(weedy) 및 IRRI(International Rice Research Institute) 자원을 이용하여 166점의 핵심집단을 선발하였다. 일부 국내에서 유래된 벼의 출수되지 않는 자원을 제외한, 실제 국내에서 육성되고 이용가치가 큰 육성종을 추가로 선발하여 최종적으로 294점의 벼 유전체재분석 집단을 공주대학교 박용진 교수팀에서 선발하여 resequencing에 사용하였다(Kim et al. 2016). 전체 벼 유전체재분석 집단 294점 중 국내 육성종(Korean breeding line)은 225점으로 인디카(Indica) 38점, 자포니카(Japonica) 178점, 열대자포니카(Tropicial Japonica) 9점으로 구성되어 있다(Table 1). 선발된 전체 294점의 벼 유전체재분석 집단은 2015년과 2017년에 충북대학교 실험농장에 재배하여 특성 조사 및 종자 증식을 수행하였으며, 엽 형태 특성에 대한 조사를 위하여 5반복으로 농촌진흥청 조사기준 및 국립종자원에서 규정한 벼 표준조사법에 따라 조사하였다.

List of 294 rice accessions used for GWAS analysis

No.Accession name EcotypeZ Origin  No. Accession name Ecotype  Origin  No. Accession nameEcotypeOrigin
1Namseon 52TeJKOR101SodujoTrJKOR201Heugkwang ByeoTeJKOR
2Suweon 159TeJKOR102SandoTrJKOR202Norinmochi 1TrJKOR
3Suweon 255I (T)KOR103Bori ByeoTeJKOR203Sangnambat ByeoTrJKOR
4Suwon 301TeJKOR104NaengjoTeJKOR204Anda ByeoI (T)KOR
5Suweon 347I (T)KOR105BikomAdNGA205Taebaeg ByeoI (T)KOR
6CT9993-5-10-1-MICOL106British Honduras CreoleTrJHND206Gaya ByeoI (T)KOR
7RathalAdLKA107CartunaTrJIDN207Baegyang ByeoI (T)KOR
8TchampaAuIRN108SahakAuPRI208Cheong Cheong ByeoI (T)KOR
9Jejubukjeju-2002-99TeJKOR109Taichung-Woo-TsanITWN209Jungwon ByeoI (T)KOR
10Jejubukjeju-2002-171IKOR110ZilanicaArRUS210Nampung ByeoI (T)KOR
11Jejubukjeju-2002-340TeJKOR111Xao Bai Mang Sue DaoTeJTWN211HangangchalI (T)KOR
12Jejubukjeju-2002-420TeJKOR112Di jiao wu jianITWN212GounTeJKOR
13Jejubukjeju-2002-521IKOR113Spin MereAuAFG213PungmiTeJKOR
14Incheonkanghwasujip-16TeJKOR114Norin 22TeJJPN214BoseogchalTeJKOR
15MuandoTeJKOR115Ssalbyeo 16TeJKOR215HanmaeumTeJKOR
16DadajoTeJKOR116Nian Chi ShiICHN216Hwasin 1TeJKOR
17OkcheongTeJKOR117Sung Pan TaoTeJCHN217OnnuriTeJKOR
18SandoTrJKOR118Tsong-Gan-ShunICHN218GangbaekTeJKOR
19BatnarakTrJKOR119San-Li-ShunICHN219HwangkeumnuriTeJKOR
20OridoTeJKOR120Yang-Sha-TsanICHN220DamiTeJKOR
21SaduchoIKOR121Chungdo 23IKOR221HongjinjuTeJKOR
22SeonIKOR122Chungdo Hwayang 12IKOR222SinmyungheugchalTeJKOR
23HanyangjoAuKOR123Chungdo Hwayang 14IKOR223HobanTeJKOR
24InbujidoTeJKOR124Sungju 3IKOR224HeugseolTeJKOR
25BeobpanhwaTeJKOR125Jangsung 1IKOR225DanmiTeJKOR
26JanmochalTeJKOR126Soonchun 5IKOR226NokwonchalTeJKOR
27PyodoTeJKOR127Daegu Damti 6-2TeJKOR227YounghojinmiTeJKOR
28YuljojoTeJKOR128Guechang 15TeJKOR228HonongTeJKOR
29SamgyeongjoTeJKOR129Danyang 9TeJKOR229JounTeJKOR
30BaekgognaIKOR130Chungsongaengmi 4TeJKOR230WolbaekTeJKOR
31MondonchalbyeoAdKOR131SuhyeonghandoICHN231GangchanTeJKOR
32AgbedeTrJNGA132Xiao zao huangTrJCHN232ShinbaegTeJKOR
33Anbaw C7TeJMMR133Namseon 34TeJKOR233GeongganghongmiTeJKOR
34BalaIIND134Namseon 126TeJKOR234SodamiTeJKOR
35BellardoneTeJFRA135Milyang 88TeJKOR235SukwangTeJKOR
36Chiem ChankIVNM136DudoTeJKOR236SeonhyangheukmiTeJKOR
37DharialAuNPL137IR40IPHL237PungokTeJKOR
38DularAuIND138Jinbu ByeoTeJKOR238Wase GingbouzuIU/N*
39IR38IPHL139Palgong ByeoTeJKOR239PalgoengTeJKOR
40MagnoliaTrJUSA140HopyungTeJKOR240JinheungTeJKOR
41MalaIBGD141Dongjin Chal ByeoTeJKOR241MilseongTeJKOR
42Mushkan 41ArPHL142GopumTeJKOR242YusinI (T)KOR
43PukhiAuPAK143UnkwangTeJKOR243Satbyeol ByeoI (T)KOR
44Red RiceIIRN144HaiamiTeJKOR244Milyang 42I (T)KOR
45Tun SartTrJVNM145SamgwangTeJKOR245DobongTeJKOR
46Victoria F.ATeJARG146HopumTeJKOR246Seolag ByeoTeJKOR
47Bai Cyue Hwa LueITWN147ChilboTeJKOR247Samnam ByeoTeJKOR
48YangmyeonITWN148Ilpum ByeoTeJKOR248Seomjin ByeoTeJKOR
49Belle PatnaIUSA149Chucheong ByeoTeJJPN249YoungdeokTeJKOR
50Pyeongbuk 3TeJPRK150Junam ByeoTeJKOR250SeohaeTeJKOR
51YupulTrJLBR151Shindongjin ByeoTeJKOR251MimyeonI (T)KOR
52Liman BelozernijTeJRUS152Odae ByeoTeJKOR252MS11TeJKOR
53KagiAuIND153Nam IlTeJKOR253KoshihikariTeJJPN
54HatadaniILKA154Hwaseong ByeoTeJKOR254Sobaeg ByeoTeJKOR
55Tai MochitoTrJTHA155BoramchanTeJKOR255Sangju ByeoTeJKOR
56WaikyakushiITWN156Hwayeong ByeoTeJKOR256Samcheon ByeoTeJKOR
57UplandTrJNGA157Dongjin ByeoTeJKOR257Munjang ByeoTeJKOR
58NewrexTrJUSA158Nakdong ByeoTeJKOR258Taebong ByeoTeJKOR
59Doan Guang Hwa LueTeJTWN159Giho ByeoTeJKOR259Dunnae ByeoTeJKOR
60Wu CyueITWN160HwacheongTeJKOR260SaesangjuTeJKOR
61BinatoIPHL161JopyeongTeJKOR261Manchu ByeoTeJKOR
62AvangardTeJUZB162ChinnongTeJKOR262Nongan ByeoTeJKOR
63DebzeraTeJUZB163HanareumI (T)KOR263Sura ByeoTeJKOR
64Hawm SupanITHA164Dasan ByeoI (T)KOR264BonggwangTeJJPN
65Ssal Byeo 22TeJKOR165Milyang 23I (T)KOR265Hwaseonchal ByeoTeJKOR
66UrasanTrJJPN166Samgang ByeoI (T)KOR266Dongan ByeoTeJKOR
67Xi Gua BaiICHN167NokyangTrJKOR267Daesan ByeoTeJKOR
68Yung Yuen Chuen ZimICHN168TongilI (T)KOR268Nongho ByeoTeJKOR
69Keng Chi JuTeJCHN169Unbong ByeoTeJKOR269Manguem ByeoTeJKOR
70Qua 77 Wuan-DauICHN170Sinunbong ByeoTeJKOR270SaegyehwaTeJKOR
71Chih-Tsao-HeICHN171Sambaek ByeoTeJKOR271Manweol ByeoTeJKOR
72Hsiang-Ha-TsanICHN172Junghwa ByeoTeJKOR272Hyangmi Byeo 1I (T)KOR
73Cheongdo-donggok-4IKOR173Geuru ByeoTeJKOR273HwangkeumboraTeJKOR
74Golyeong-2TeJKOR174Inwol ByeoTeJKOR274CheongaTeJKOR
75Golyeong-6TeJKOR175SangmibyeoTeJKOR275CheongdamTeJKOR
76Danyang-7TeJKOR176Geumo ByeoTeJKOR276KeunseomI (T)KOR
77Danyang-38TeJKOR177Jinbuol ByeoTeJKOR277SaenuriTeJKOR
78Hwaseong-5TeJKOR178Jinmi ByeoTeJKOR278HwanggeumnodeulTeJKOR
79Gou 405TeJJPN179Heugjinju ByeoTeJKOR279CheonganTeJKOR
80BaeksamiTeJCHN180Jeogjinju ByeoTeJKOR280DeuraechanTeJKOR
81AkaineTrJJPN181Naepung ByeoTeJKOR281JinbaekTeJKOR
82Syarebyeo-61-1-BTeJKOR182Donghae ByeoTeJKOR282CheongnamTeJKOR
83Syalebyeo-94-1-BTeJKOR183Seoan ByeoTeJKOR283SuanTeJKOR
84Syalebyeo-163-1-BTeJKOR184Gancheok ByeoTeJKOR284DongboTeJKOR
85Milyang 50I (T)KOR185Juan ByeoTeJKOR285SeolemiTeJKOR
86Yeongpung ByeoI (T)KOR186Yeonghae ByeoTeJKOR286JungsaenggoldTeJKOR
87Iri 336TeJKOR187Sobi ByeoTeJKOR287SaeilmiTeJKOR
88Mihyang ByeoTeJKOR188Haepyeong ByeoTeJKOR288SeokwangTeJKOR
89MoroberekanTrJGIN189Sinseonchal ByeoTeJKOR289SaenaraTeJKOR
90Jejubukjeju-2002-115TrJKOR190Daelip Byeo 1TeJKOR290PaldalTeJKOR
91Jejubukjeju-2002-550TeJKOR191Seolhyangchal ByeoTeJKOR291NongbaegTeJKOR
92Jejubukjeju-2002-561TeJKOR192Ilmi ByeoTeJKOR292Chupung ByeoI (T)KOR
93HuindadakTeJKOR193Nampyeong ByeoTeJKOR293Kwanak ByeoTeJKOR
94JotajoTeJKOR194Gyehwa ByeoTeJKOR294Seonam ByeoTeJKOR
95Pocheon Jangmang MebyeoTeJKOR195Yeongnam ByeoTeJKOR
96Dongo ByeoTeJKOR196Yangjo ByeoTeJKOR
97SeorianjeunbaengiTeJKOR197Aranghangchal ByeoTeJKOR
98Neul ByeoTrJKOR198Heugnam ByeoTeJKOR
99Jwiippari ByeoTeJKOR199Goamy ByeoTeJKOR
100JeongjonghwaTeJKOR200ManmiTeJKOR

ZAd: Admixture, Ar: Aromatic, Au: Aus, I: Indica, I (T): Idica (Tongil type), J: Japonica, TeJ: Temperate japonica, TrJ: Tropical japonica;

*U/N: USDA/NGRL (Introduced)


DNA 추출 및 resequencing

벼 294점의 DNA 추출은 이앙 후 15일된 어린잎으로부터 0.5 g의 조직을 채취하여 CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide)법을 이용하였다(Kump and Javomik 1996; Cho et al. 1998). 추출한 DNA는 λDNA (100 ng/ul)와 함께 1% agarose gel에서 확인하였고 20 ng/ul로 정량하여 실험에 사용하였다(Abdula et al. 2013). 벼 유전자원의 resequencing은 HiSeq 2500 (Illumina) NGS (Next Generation DNA Sequencer)을 이용하여 short read sequence를 공주대학교 박용진 교수팀에서 생산하였다(Kim et al. 2016). 생성된 fastq형식의 raw data 파일은 Cutadapt, sickle 등의 분석 프로그램을 이용하여 adaptor, low quality reads를 제거하였으며, 변이분석은 벼의 표준유전체 염기서열인 IRSGP1.0 (International Rice Genome Sequencing Project)와 비교하여 분석을 수행하였다.

GWAS 분석 및 유전자 기능 분석

GWAS분석은 코넬대학교에서 개발한 식물의 양적 형질에 적용할 수 있으며 대용량의 데이터를 처리할 수 있는 GAPIT (Genomic Association and Prediction Integrated Tool) (Lipka et al. 2012) 및 GAPIT의 혼합선형모형(Zhang et al. 2010)을 이용하여 분석하였다. 후보유전자 영역에서 발견된 유전자들을 후보유전자로 선정하고, 각각의 유전자의 mRNA 전사체에 대한 cDNA 서열과 genomic DNA 서열을 Rice Genome Annotation Project와 NCBI database에서 검색하여 추출하였다. 선발된 위치상 후보유전자 내 SNP 마커들 간의 연관성을 보기 위해 Haploview version 4.2를 이용하였다.

RT-PCR을 이용한 유전자 발현 분석

RT-PCR을 통하여 목표유전자의 증폭량을 확인한 후, mRNA 발현량을 분석하기 위하여 qRT-PCR을 수행하였다(Table 2). PCR은 SYBR® Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo, Japan)와 Bio-Rad CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA)를 사용하였다. 모든 표본들은 실험의 정확성을 높이기 위하여 3 반복으로 진행하였으며 PCR 반응은 95°C에서 3분간 pre-denaturation을 시행한 후 95°C에서 10초간 denaturation, 55°C에서 20초간 annealing, 72°C에서 30초간 extension하고, scanning하는 과정을 50회 반복하였으며, melting curve 분석은 65 ~ 95°C에서 0.5°C씩 5초간 실행하였다.

Sequence information of primers used in RT-PCR for expressional analysis

Primer Candidate gene  Orientation Sequence (5’-3’) Tm (°C) 
LLA1Os08g31950FwGAGGAGGAGGAGGATCAGG59
RvCTACGACGAGCTTCCACTCC59
PL1Os04g19540FwCGCAAGCAATGATGAAAGAA57
RvAAGTCAAATTCAAGGGCCCT57
ActinactinFwCCAGCAAGGTCGAGACGAA56
RvTGTATGCCAGTGGTCGTACCA56

결과 및 고찰

벼 유전자원의 지엽각 특성

벼 294점의 유전자원 중 국내에서 출수가 진행되지 않은 자원 21점을 제외한 273점 유전자원의 지엽각에 대한 기초통계량 수치를 비교 분석하기 위하여 표현형을 분도기를 이용하여 조사한 결과는 Table 3과 같다. 이삭을 기준으로 지엽의 각도가 0 ~ 10°는 직립형, 11 ~ 30°는 반직립형, 31°이상의 각도를 보이는 것은 수평형으로 분류하였다.

Basic statistical values and number of lateral leaf angles with 294 rice accessions

Statistical focus Statistic Lateral leaf angle (°) No. of accession 
Total294Erect (0 - 10)39
Maximum (°)83.5
Minimum (°)5Semierect (10 - 30)188
Average (°)22.61
Standard deviation 14.46Horizontal (31 < x)46
CV 0.64

* Accession names are provided in Supplementary Table 1


벼 273점 유전자원 중에서 인디카(Indica) 14점, 자포니카(Japonica) 25점으로 총 39개 품종이 직립형으로 나타났고, 열대자포니카(Tropocial Japonica) 9점을 포함한 209개 품종이 반직립형으로 나타났으며, 수평형을 나타내는 품종은 46개 품종이 조사되었다(Table 3). 구간별 분포도 조사 결과, 15° < x ≤ 20° 이하의 지엽각 구간에서 가장 높은 분포도를 보였으며, 273개 품종 중 베트남에서 기원된 TUN SART이 83.5°로 가장 큰 지엽각을 나타냈고 큰섬이 5°로 가장 작은 지엽각을 나타내었다(Fig. 1).

Fig. 1.

Phenotypic distribution and statistics of lateral leaf angle (°)


Jung 등(2008)의 연구에 따르면 자포니카 품종과 인디카 품종의 영양생장시기가 서로 다르며 잎에서 감광성 유전자의 발현에 차이를 보인다고 하였고, Fan et al. (2007)은 높은 CO2 조건하에 자포니카 품종의 지엽각과 인디카 품종의 지엽각이 서로 다른 형태를 나타낸다고 보고하였다. 본 연구에서 지엽각의 분포도가 다르게 나타난 것은 품종별로 유전자의 조성이 다르고 식물의 주요 canopy structure인 지엽에서 생태형별로 일장 및 CO2와 같은 외부환경 변화에 서로 다르게 반응함으로 인한 것으로 사료된다.

GWAS 분석에 의한 SNP 마커 개발

벼 resequencing 유전자원 294점에 대한 형질 관련 특이적 SNP들의 선별을 위한 기준을 선정하기 위하여 quality control을 수행하였다. 총 6,243,699개의 SNP들 중, read depth가 4× 이상, 200× 이하이며 MAF > 0.05, genotyping quality ≥ 20, Hardy-Weinberge equilibrium(P-value ≤ 0.001)를 만족시키는 1,842,515개(전체 SNP의 29.50%)의 SNP를 확인할 수 있었다. 벼 273점에 대한 지엽각 표현형 데이터를 이용하여 GWAS를 실시하였으며, GWAS의 Manhattan plot 결과 분석을 통해, 각 집단에서 염색체를 대상으로 지엽각과 통계적 유의도를 나타내 연관성을 보이는 SNP를 발굴하였다.

지엽각에 대한 연관분석으로 나온 유의적인 SNP들의 –logP 값을 토대로 Manhattan과 QQ plot은 Figure 2에 나타낸 바와 같다. Manhattan plot에서 –logP > 8을 기준으로 볼 때 유의적인 SNP가 탐지됨을 확인할 수 있었으며 벼 염색체 8번에 위치한 해당 SNP(S8_19815442)가 어떤 SNP보다도 유의적인 SNP임을 알 수가 있었다(Table 4). 또한, QQ plot에서는 x축의 기대값 P-value보다 유의적으로 나타난 SNP들에서 관측된 P-value가 더 높은 형태를 취하고 있었으며 이는 발굴된 SNP들이 유의적이라고 볼 수 있으며 해당 형질을 잘 표현하고 있다는 것을 의미한다.

Fig. 2.

Manhattan plots and high associated peaks of lateral leaf angle using 294 rice accessions. The -log10(P) value from a genome-wide scan are plotted against the position on each of 12 chromosomes


SNP locations associated with lateral leaf angle in 294 rice accessions

Chr.SNPLocation (bp)P-value MAFR2*R2FDR adjusted P-values
8S8_1983008619,830,0867.99×10-5 0.152015  0.319690902  0.35982231 4.18×10-1
8S8_1981538119,815,3817.18×10-60.1721610.3196909020.3720920352.51×10-1
8S8_1981544219,815,4425.22×10-90.120880.3196909020.4107685078.58×10-3
8S8_1981722019,817,2201.11×10-40.1080590.3196909020.3581780764.54×10-1
8S8_1981722819,817,2284.90×10-50.1007330.3196909020.3622818524.10×10-1
8S8_1981781419,817,8142.96×10-50.1263740.3196909020.3648334493.89×10-1
8S8_1982855319,828,5531.93×10-40.1117220.3196909020.3554074344.89×10-1
8S8_1981186619,811,8661.70×10-40.1318680.3196909020.3560414674.73×10-1
8S8_1983024019,830,2403.16×10-40.1904760.3196909020.3529881535.35×10-1
8S8_1983051019,830,5103.68×10-40.1318680.3196909020.3522352085.57×10-1
8S8_1983853519,838,5351.19×10-40.2161170.3196909020.3578190344.59×10-1
8S8_1985166819,851,6683.35×10-40.1172160.3196909020.3526936545.41×10-1
8S8_1987951319,879,5131.79×10-50.1245420.3196909020.3673835563.51×10-1
8S8_1989930519,899,3052.61×10-40.4377290.3196909020.353937415.11×10-1
8S8_1989936019,899,3605.02×10-50.4377290.3196909020.3621635544.10×10-1

Chr., Chromosome; MAF, minor allele frequency

*R square of model without SNP.

R square of model with SNP.


본 연구에서 지엽각과 연관성을 보이는 SNP를 탐색한 결과 벼 염색체 8번에 위치한 SNP(S8_19815442)가 지엽각의 발현과 연관이 있는 유의적인 SNP로 밝혀졌다(Fig. 3). 이 결과와 관련하여 Kobayashi 등(2003)에 따르면 RIL 집단의 지엽 형질과 관련한 QTL 분석 결과, 9번 염색체를 제외한 11개 염색체에서 총 64개의 QTL이 탐색되었으며 그 중 8번 염색체에서 LOD 4.1로 RFLP 마커인 XNpb187과 XNpb135사이의 엽각 관련 QTL이 발굴되었다. 또한 Cai et al. (2015)에 따르면 ‘인디카/자포니카’ 조합 DH 집단을 이용한 유전자 지도 작성에서 총 30개의 QTL이 탐색되었으며 1번, 2번, 6번, 7번, 8번, 9번, 12번 염색체에서 각각 LOD 값 2 이상의 엽각 관련 QTL이 발굴되었다. 이와 관련하여 본 연구에서는 ‘S8-19815442’ SNP가 이미 확인된 QTL region(17.44 Mbp ~ 26.91 Mbp)에 유사하게 위치하는 것을 확인하였다.

Fig. 3.

(A) Phenotypic distribution and statistics of lateral leaf angle (°), (B) Regions of the genome showing strong association signals near previously lateral leaf angle-related genes. Top of each panel shows a chromosome region of the peak SNP (SNP with the lowest P value), whose position is indicated by a vertical red line. Bottom of each panel shows a 5-kb region on each side of the peak SNP, with annotated genes indicated by color boxes


Fig. 4.

Haplotype analysis of the sequence covering the candidate gene Os08g31950 on chromosome 8 coding regions in 294 rice accessions and phenotypic variation among different haplotype


지엽각 연관 후보 유전자 동정

본 연구에서 발굴된 유의적인 SNP들 중 –logP > 8 에 해당하는 SNP들에 대해 주변 지역에서 NCBI data base를 통하여 후보유전자를 탐색하였고, 그 중 관련 있는 후보유전자들을 선발하였다. 지엽각에 대하여 유의성이 높은 SNP S8_19815381 및 SNP S8_19879513 사이의 약 64 Kb 구간에서 13개의 유전자가 관찰되었다. 그 부위에서 Os08g31950.1 (Basic helix-loop- helix proteins (bHLHs)) 및 Os08g31970.1 (NHL(Ncl-1, HT2A, Lin-41)-repeat-containing protein), Os08g31970.2 (NHL(Ncl-1, HT2A, Lin-41)-repeat-containing protein), Os08g31980.1 (Trehalose- 6-phosphate synthase) 등 4개의 후보유전자가 선발되었다(Table 5).

Candidate gene information included Os08g31950 gene between 19,815,381-19,879,513 (64 Kb) on chromosome 8

No.Name CDS Coordinates (5’-3’) Nucleotide length (bp) Predicted protein length Description
1Os08g31950.119,814,56219,814,81625585Basic helix-loop-helix proteins (bHLHs)
2Os08g31960.119,823,38119,826,388813271Uncharacterized protein
3Os08g31970.119,826,77519,829,6751,263421NHL (Ncl-1, HT2A, Lin-41)-repeat-containing protein
4Os08g31970.219,826,77519,829,675828276NHL (Ncl-1, HT2A, Lin-41)-repeat-containing protein
5Os08g31980.119,836,08719,830,3282,589863Trehalose-6-phosphate synthase
6Os08g31990.119,843,58619,842,03424983Uncharacterized protein
7Os08g32000.119,852,08819,852,35426789Uncharacterized protein
8Os08g32010.119,859,45319,858,390333111Hypothetical protein
9Os08g32020.119,862,75419,865,7952,346782Retrotransposon protein
10Os08g32030.119,869,34319,866,4102,217739Retrotransposon protein
11Os08g32040.119,870,46419,869,598867289Retrotransposon protein
12Os08g32050.119,872,53419,871,4161,119373Retrotransposon protein
13Os08g32060.119,875,26619,877,6992,073691Spotted leaf 11

Trehalose는 비환원당으로 널리 다양한 개체에 존재하며, 이 당의 경우 에너지와 탄소원, 그리고, 비생물학적 스트레스에 대항하는 보호분자 역할을 한다(Garg et al. 2002). Basic- helix-loop-helix(bHLH) 인자는 동·식물에서 다양한 역할을 하는 중요 전사인자로 알려져 있으며, 특히 Jang et al. (2017)에 따르면 bHLH 인자는 식물의 꽃과 줄기 등 측생기관의 형태 진화에서 매우 핵심적인 기능을 한다고 보고한 바 있다.

벼 resequencing 294점에 대한 GWAS 분석 결과를 통해 얻은 후보유전자에 대하여 hyplotype 분석을 실시하였으며, haplotype 분석 시 Nipponbare (Tempera Japonica) 염기서열을 기준으로 하였다. Hyplotype 분석결과 및 표현형 데이터를 비교 분석하여 벼 농업 형질과 후보유전자 간의 관련 여부에 대해 검정하였다.

벼 염색체 8번체의 high peak 위치를 기준으로 하여 선발된 후보유전자는 Os08g31950으로 haplotype 분석을 실시한 결과, Os08g31950 유전자는 3개의 그룹으로 나뉘었으며 각 그룹의 지엽각 평균은 22.94 °, 21.15 °, 43.00 °으로 나타났다. 높은 지엽각을 보인 Os08g31950-Hap1과 Os08g31950-Hap3 그룹은 exon 부분에서 Nipponbare와 유사한 염기를 갖는 반면, 낮은 지엽각을 보인 Os08g31950-Hap2 그룹은 exon 부분에서 Nipponbare의 염기와 비교하였을 때 해당 exon부위가 위치하는 벼 8번 염색체 상의 19,814,759번 위치에서 C에서 T로 변환되었으며 Alanine(GCG)에서 Valine(GTG)으로 아미노산 서열이 바뀌었다. Os08g31950-Hap1 그룹에 속하는 품종은 220개로 지엽각의 범위가 6° ~ 86.5°의 범위였으며, Os08g31950- Hap2 그룹에 속하는 품종은 72개로 지엽각의 범위가 5° ~ 75° 로 나타났다(Fig. 3). Os08g31950의 경우 GCG에서 GTG 부분으로 염기가 바뀌게 됨으로 인하여 아미노산 배열이 Alanine에서 Valine으로 치환이 되는 nonsynonymous SNP이다. Os08g31950은 bHLH의 전사인자로 Toledo-Ortiz et al. (2003)에 따르면 bHLH는 전사를 조절하는 메커니즘에서 G-박스 DNA sequence motif CACGTG에 특이적으로 결합할 수 있는 이종 및 동종 이합체의 배열 구성을 형성한다. 또한, Peng 등(2014)은 벼에서 qPC1 유전자의 ORF (Open Reading Frame) 부분의 SNP에서 valine으로 치환되는 nonsynonymous SNP 유전자의 발현이 이루어지는 중요한 영역을 밝힌 바와 같이 Os08g31950의 기능에 관심을 가질 필요성이 있다고 여겨진다.

지엽각 연관 후보 유전자의 발현 분석

벼 resequencing 294점에 대한 GWAS 분석 결과를 통해 얻은 후보유전자의 형질별 유전적 변이 및 연관성을 분석하기 위하여, 본 연구를 통해 조사된 직립형 지엽각 품종군과 수평형 지엽각 품종군을 각각 10개씩 선정하여 염기서열 분석을 수행하였다. 지엽각 형질 연관 후보유전자 Os08g31950에 대해 연관 유전자 변이를 관찰하기 위해서 직립형 지엽각 품종군과 수평형 지엽각 품종간 사이의 염기서열을 비교한 결과는 Figure 5와 같다.

Fig. 5.

Nucleotide sequence comparison of Os08g31950 gene in twenty different varieties. The conserved sequences are shown as dots. Sequence variation is represented by corresponding nucleotides. The consensus sequence is indicated at the bottom of the alignment. Group 1, erect lateral leaf angle (x < 5°) varieties; Group 2, horizontal lateral leaf angle (x > 60°) varieties


염기서열 비교를 통하여 특정 염기의 삽입(Insert), 결실(Deletion), 치환(Substitution)을 확인한 결과, 직립형 지엽각 품종군과 수평형 지엽각 품종군의 특정 염기서열 부위에 염기치환이 확인되었다. Os08g31950의 직립형 지엽각 품종군에서의 염기서열 비교를 보면, 봉광 및 큰섬, Yusin, 수원 347호, 영덕 등 총 5개 품종에서 단일염기서열이 치환된 것을 확인할 수 있었으며 이들 중 대부분은 인티카(Indica) 생태형을 지닌 것으로 나타났다. Os08g31950의 수평형 지엽각 품종군에서의 염기서열 비교를 보면, 직립형 지엽각 품종군과는 다르게 TAI MOCHITO 1개 품종에서만 단일염기치환이 관찰되었으며 TAI MOCHITO의 생태형은 열대자포니카(Tropical Japonica)인 것으로 관찰되었다. 상기와 같이 발굴된 1개 SNP (S8_19814759)는 아미노산 합성에 직접적인 영향을 주는 coding 영역에 위치하는 것으로 확인되었다. 이와 같이 coding 영역에 위치한 SNP는 아미노산 합성뿐만 아니라 RNA splicing, nucleosome 형태, requlatory motif 등에 영향을 주어 유전자 발현을 조절하며(Castillo-Davis et al. 2002; Shabalina and Spiridonov, 2004; Cheong et al. 2006), 다른 유전자의 causative mutation과 연관되어 유전자 발현에 영향을 미칠 가능성이 있으므로(Li et al. 2008; Su et al. 2016), 이에 대한 분석 연구가 필요할 것으로 사료된다.

벼 294점에 대한 GWAS 분석 결과를 통해 얻은 지엽각 형질 관련 후보유전자 Os08g31950에 대해 조직별 발현 양상을 정량적으로 비교하기 위해 real-time PCR을 수행한 결과는 Figure 6과 같다.

Fig. 6.

RNA expression patterns in two organs (leaf and root) for Os08g31950 gene in 20 selected rice accessions based on real-time PCR analysis using LLA1 and actin primers. Group 1, erect lateral leaf angle (x < 5°) varieties; Group 2, horizontal lateral leaf angle (x > 60°) varieties


직립형 지엽각 품종군 및 수평형 지엽각 품종군의 모든 조직에서 Os08g31950의 발현을 확인할 수 있었으며 조직별로 다양한 발현 양상을 관찰할 수 있었다. Os08g31950의 잎에서의 발현 양상을 보면, 직립형 지엽각 품종군이 수평형 지엽각 품종군보다 유전자의 발현량이 상대적으로 높았으며 가장 높은 발현율을 나타낸 품종은 Yusin으로 나타났고 가장 낮은 발현율을 나타낸 품종은 동안벼로 나타났으며 두 품종 모두 직립형 지엽각 품종군에 포함되어 있는 것으로 관찰되었다. 한편, Os08g31950의 뿌리에서의 발현 양상을 보면, 직립형 지엽각 품종군에 속해 있는 대부분의 품종이 수평형 지엽각 품종군에 속해 있는 품종들보다 높은 발현량을 나타내었다. 반면 잎에서와는 다르게 가장 높은 발현율을 나타내는 품종은 CARTUNA로 나타났고 가장 낮은 발현율을 나타내는 품종은 BIKOM으로 나타났으며 두 품종 모두 수평형 지엽각 품종군에 포함되어 있는 것으로 관찰되었다.

Os08g31950의 조직간 발현 양상을 보면, 잎에서의 유전자 발현량이 뿌리에서의 발현량보다 전체적으로 높게 나타났으며 잎에서 최고 발현량을 나타낸 Yusin의 발현율이 뿌리에서 최고 발현량을 나타낸 CARTUNA의 발현율보다 약 2배가량 높게 나타났다. 또한 Os08g31950 유전자의 품종간 발현 양상을 보면, 수원347호 및, 영덕, 동안, 새누리, TUN SART, CARTUNA, VICTORIA F.A, KENG CHI FU 등 총 8개 품종을 제외한 나머지 12개 품종은 모두 잎에서 유전자의 발현량이 높게 나타났다.

본 연구에서 지엽각과 연관성을 보이는 SNP를 탐색한 결과 벼 염색체 8번에 위치한 SNP(S8_19815442)가 지엽 형질과 관련이 있는 QTL region에 유사하게 위치하는 것을 확인하였다(Kobayashi et al. 2003; Cai et al. 2015). 또한, Hu et al. (2012)은 전엽처리에 따른 수량을 높이기 위해 자포니카 품종을 이용하여 QTL을 분석한 결과 QTL qFLA8이 지엽의 크기 및 각도에 관여한다고 하였으며, Dong et al. (2004)에 따르면 8번 염색체에서 지엽의 형태 발달에 관여하는 QTL qDEF-8의 좌위를 확인하였다.

식물에서 bHLH (basic/Helix-Loop-Helix) 단백질은 세포의 증식에서 다양성을 조절하는 전자 네트워크에서 중요한 조절 요소로 알려져 있다(Grandori et al. 2000; Massari and Murre 2000). Feng et al. (2016)에 따르면 HLH 단백질인 OsBUL1은 lamina joint 부위에서 발현하여 잎의 형태에 관여함으로써 종실의 크기 및 수량성에 기여한다고 보고한 바 있으며, ILI1 (Increased laminar inclination 1) 및 PGL1 (Positive regulator of grain length 1)과 같은 HLH 형태의 단백질들이 lamina 부위에서 발현함으로써 잎의 각도에 직접적으로 관여하는 것으로 나타났다(Tanaka et al. 2009; Zhang et al. 2009; Heang and Sassa 2012).

이러한 결과들을 종합해 볼 때 벼 resequencing 294점에 대한 GWAS 분석 결과를 통해 얻은 후보유전자 Os08g31950의 exon 영역의 SNP 유저자형은 지엽의 형태 발달에 관여하는 QTL 좌위와 유의적 연관성이 있는 것으로 추정되고 있으며, 직립형 지엽각 품종군 및 수평형 지엽각 품종군에서 Os08g 31950의 서로 다른 발현 양상으로 미루어 볼 때 품종간 지엽각 차이에 상당한 영향을 줄 가능성이 있다고 판단된다.

따라서, 본 연구를 통하여 벼 유전자원 집단의 다양한 농업 형질과의 관련성 분석 및 유전적 지표인자 발굴에 도움이 될 것이며 이를 통해 분자유전학적 기법을 이용한 광합성 효율과 관련된 지엽(Cho et al. 1975)의 벼 육종전략을 확립하는데 기초 자료가 되는 것은 물론 유전자원 보존 및 분자육종학적인 연구에 기초 자료로서 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

적요

본 연구에서는 국내외에서 수집한 벼 294개 유전자원 핵심집단을 대상으로 벼의 지엽각 특성에 대한 조사를 수행하였고, GWAS를 이용하여 지엽각 연관 유전자를 추출 및 분석하였다. 표현형 데이터를 이용한 GWAS의 Manhattan plot 결과 분석을 통해, 각 집단에서 염색체를 대상으로 표현형과 통계적 유의성을 나타내 연관성을 보이는 SNP를 발굴하였다. 지엽각 관련 특성에 대하여 선행 연구된 QTL region과의 비교를 통하여 본 연구에서 발굴된 SNP간의 유의성을 조사한 결과, 지엽각과 유의성이 있는 SNP (S8-19815442)가 이미 확인된 QTL region에 위치하는 것으로 나타났으며, 후보유전자 Os08g31950 대해 연관 유전자 변이를 관찰하기 위해서 형질 특이적 품종군 간의 염기서열을 비교한 결과 1개의 지역에서 단일염기변이가 검출되었다. Os08g31950의 조직별 RNA의 상대적 발현량 수준을 비교한 결과, Os08g31950 유전자는 모든 조직에서 높은 발현량을 확인할 수 있었으며 조직별로 다양한 발현 양상을 관찰할 수 있었다. 또한, 모두 직립형 품종군에서 상대적으로 발현량이 높게 나타났으며 뿌리보다 잎에서의 발현율이 높게 나타났다. 본 연구를 통해 동정된 지엽각 연관 후보유전자 Os08g31950는 벼 생육 및 수량 증대에 이용할 수 있는 마커제작 및 육종의 기초자료가 될 것으로 기대된다.

사사

본 논문은 농촌진흥청 차세대바이오그린21사업(식물분자육종사업단 과제번호: PJ01320701)의 지원을 받아 이루어진 결과이며, 벼 294 점 핵심집단유전체재분석 데이터를 제공한 공주대학교 박용진 교수에게 감사드립니다.

Supplementary Table 1

Frequency distribution of flag leaf angle according to the measured value in 273 rice accessions

JPB-45-017_Suppl1.pdf
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