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Isolation and characterization of Auxin/indole-3-acetic acid 1 (Aux/IAA1) gene from poplar (Populus alba × P. glandulosa)
J Plant Biotechnol 2019;46:180-188
Published online September 30, 2019
© 2019 The Korean Society for Plant Biotechnology.

Eun-Kyung Bae ·Young-Im Choi ·Hyoshin Lee ·Ji Won Choi

Forest Biotechnology Division, National Institute of Forest Science, Suwon, 16631, Korea
Forest Bioinformation Division, National Institute of Forest Science, Suwon, 16631, Korea
Correspondence to: e-mail: baeek@korea.kr
Received August 10, 2019; Revised September 9, 2019; Accepted September 9, 2019.
cc This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract

Auxin plays a crucial regulatory role in plant growth and development processes. Three major classes of auxin-responsive transcription factors controlled by the Auxin/indole-3-acetic acid (Aux/IAA), Gretchen Hagen 3 (GH3), and small auxin up RNA (SAUR) genes regulate auxin signaling. Aux/IAA, in particular, encodes short-lived nuclear proteins that accumulate rapidly in response to auxin signaling. In this study, we isolated a PagAux/IAA1 gene from poplar (Populus alba × P. glandulosa) and investigated its expression characteristics. The PagAux/IAA1 cDNA codes for putative 200 amino acids polypeptide containing four conserved domains and two nuclear localization signals (NLSs). Utilizing Southern blot analysis, we confirmed that a single copy of the PagAux/IAA1 gene was present in the poplar genome. The expression of this gene is specific to leaves and flowers of the poplar. PagAux/IAA1 expressed in the early exponential growth phase of cell-cultured in suspension. PagAux/IAA1 expression level reduced in drought and salt stress conditions, and the presence of plant hormones such as abscisic acid. However, expression enhanced in cold stress, cambial cell division, and presence of plant hormones such as gibberellic acid and jasmonic acid. Thus, these results suggest that PagAux/IAA1 participates in cold stress response as well as developmental processes in the poplar.

Keywords : Abiotic stress, auxin, cambial cells, PagAux/IAA1, Populus alba × P. glandulosa, suspension cell culture
서 언

옥신(Auxin)은 식물의 생장과 발달 과정의 중요한 신호전달 물질로서 세포 분열, 확장 및 분화와 같은 세포 과정(cellular processes)에 영향을 미친다(Teale et al. 2006; Luo et al. 2018). 식물에서 알려진 초기 옥신 반응 유전자는 Auxin/indole-3-acetic acid (Aux/IAA), Gretchen Hagen 3 (GH3), 그리고 small auxin up RNA (SAUR)가 있다(Hagen and Guilfoyle 2002). 특히 Aux/IAA 유전자 패밀리는 여러 식물 종에서 발현되며, 도메인 구성에 따라 5개의 그룹으로 나누어진다(Wu et al. 2017).

Aux/IAA 단백질은 낮은 옥신 농도에서 초기 옥신 반응 유전자의 억제자로서 기능하고, 수명이 짧은 핵 단백질로서 4개의 보존된 도메인(Domain I~IV)과 2개의 nuclear localization signal (NLS) 서열을 가지고 있다. 특히 Aux/IAA 단백질의 도메인 III~IV에 옥신 반응 인자(auxin response factor, ARF)와 결합할 수 있는 아미노산 서열을 포함하고 있다(Abel et al. 1994; Dreher et al. 2006; Kim et al. 1997; Ulmasov et al. 1997b).

Aux/IAA 단백질과 ARF의 결합은 옥신 농도에 의해 조절된다. 세포 내 옥신 농도가 감소하면, Aux/IAA 단백질은 ARF 단백질에 결합하고 옥신 반응 유전자의 활성을 억제함으로써 전사 억제 인자로서 작용한다. 반대로 옥신 농도가 높아지면 Aux/IAA 단백질은 불안정해져 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 분해되고 ARF 단백질은 초기 옥신 반응 유전자를 활성화시킨다(Calderón Villalobos et al. 2012; Parry et al. 2009; Tan et al. 2007; Weijers et al. 2005). 따라서 식물 생장과 발달은 식물 조직의 종류와 발달 과정에서 옥신 농도의 변화에 반응하여 옥신 신호전달경로에 의해 조절된다(Liscum et al. 2002; Luo et al. 2018)

식물의 스트레스 반응과 관련하여 Aux/IAA 유전자는 옥신 유전자 조절 네트워크와 상호 작용한다(Shani et al. 2017). 애기장대, 벼 및 수수에서 일부 Aux/IAA 유전자의 발현이 억제 되었다(Du et al. 2013; Liscum et al. 2002; Jung et al. 2015; Song et al. 2009a; Wang et al. 2010). AtIAA5, AtIAA6AtIAA19 유전자가 발현 억제된 애기장대는 건조에 대한 민감성이 증가된 반면 OsIAA6 유전자가 과발현된 벼는 건조에 대한 내성이 증가 하였다(Jung et al. 2015; Shani et al. 2017). 그러나 건조, 염 및 저온과 같은 스트레스에 대한 Aux/IAA 유전자의 기능 분석 연구는 적어 더 많은 연구를 필요로 한다(Shani et al. 2017; Luo et al. 2018).

나무의 경우, 유칼립투스 그란디스(Eucalyptus grandis), 테다 소나무(Pinus taeda) 및 트리코카파 포플러(Populus trichocarpa)에서 형성층과 목부 발달에 관여하는 Aux/IAA 유전자 패밀리의 발현 연구가 보고되었다(Goldfarb et al. 2003; Nilsson et al. 2008; Yu et al. 2015). 특히 트리코카파 포플러의 genome에서 35개의 Aux/IAA 유전자가 동정되었고, PtrIAA14.1 유전자가 식물의 형태 변화에 기여하는 것으로 보고되었다. 이 사실은 PtrIAA14.1을 애기장대에 과발현시켰을 때 잎의 관다발 형태를 변화시킴으로써 확인하였다(Kalluri et al. 2007; Liu et al. 2015). 그러나 나무의 Aux/IAA 유전자의 기능은 대부분 밝혀져 있지 않다.

본 연구에서는 나무에서 기능이 잘 알려지지 않은 Aux/IAA 유전자를 현사시나무(Populus alba × P. glandulosa)에서 분리하여 구조를 밝히고, 세포 생장, 형성층 발달, 비생물적 스트레스 및 식물호르몬 처리에 따른 발현 특성을 조사하였다. 이러한 결과를 토대로 Aux/IAA 유전자의 도입과 발현 조절을 통하여 바이오매스 증진 및 스트레스 저항성 나무 개발에 기여할 수 있을 것으로 기대한다.

재료 및 방법

식물재료

현사시나무(Populus alba × P. glandulosa)를 식물재료로 사용하였으며, 모든 시료는 채취 후 즉시 액체질소에 얼린 다음 -70°C에 보관하였다. 현사시나무 삽목묘는 1년생 줄기를 20 cm로 잘라 포트에 이식한 후 25°C, 광주기 16시간 조건의 온실에서 3개월 동안 생장시켰다. 잎, 줄기 및 뿌리는 1년생 삽목묘에서 각각 채취하였고, 꽃은 약 25년생의 현사시나무에서 3월에 채취하였다(Bae et al. 2009). 형성층 발달을 관찰하기 위하여 Druart et al. (2007)의 방법으로 시료를 준비하였다. 형성층은 포지에서 생육 중인 2년생 현사시나무의 줄기에서 4월 12일부터 4월 21일까지 3일 간격으로 채취하였다.

현탁배양세포 배양

현탁배양세포는 잎을 이용하여 현탁배양배지에서 유도하였다. 현탁배양세포의 세포 생장은 Lee et al. (2007)의 방법으로 준비한 현탁배양세포를 사용하여 계대 후 28일 동안 4일 간격으로 현탁배양세포를 수거하고 생중량을 측정하여 조사하였다. 현탁배양배지는 sucrose 30 g/L와 2,4-D 1.0 mg/L, NAA 0.1 mg/L, 6-BAP 0.01 mg/L가 첨가된 MS배지(Murashige and Skoog 1962)를 pH 5.8로 조절하였다. 그리고 121°C에서 15분간 고압멸균하였다(Lee et al. 2005). 배양 온도와 광 조건은 각각 22 ± 1°C와 20 μmol m2s-1이었고, 진탕배양 속도는 130 rpm이었다(Lee et al. 2005).

Total RNA 분리 및 cDNA합성

Total RNA는 acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform 추출 방법(Chomczynski and Sacchi 1987)에 따라 TRI Reagent (TR118, Molecular Research Center, USA)를 사용하여 분리하였다. 8일령의 현탁배양세포에서 분리한 1 μg의 total RNA를 주형으로 One Step RNA PCR kit (RR024, Takara, Japan)을 이용하여 매뉴얼에 따라 전장의 Aux/IAA cDNA를 합성하였다. 이 반응에 사용된 프라이머는 현탁배양세포 유래의 EST (expressed sequence tag) 분석(Lee et al. 2005)을 통해 선발한 Aux/IAA 유전자의 염기서열을 바탕으로 5’-AATATTGCAA CCCTTGCCCATCACC-3’ (Forward)와 5’-TGGCAGCAGCA AATCTAACAACATG-3’(Reverse)를 제작하였다.

Aux/IAA 유전자의 염기서열 분석

Aux/IAA cDNA의 염기서열을 결정한 다음 Vector NTI v.10.0 (Invitrogen, USA)을 이용하여 예상 아미노산 서열 및 분자량을 조사하였다. 예상 아미노산 서열의 상동성 분석은 NCBI의 BLAST를 이용하여 수행하였다(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). 예상 아미노산 서열을 이용한 세포 내 위치 예측을 위하여 iPSORT program (http://wolfpsort.org/)(Bannai et al. 2002)을 사용하였다. 이미 알려진 단백질 영역을 모아 놓은 PROSITE (http://prosite.expasy.org)를 이용하여 단백질에 존재하는 보존 영역을 조사하였다(Sigrist et al. 2005). 단백질의 상동성 분석은 Uniprot program (http://www.uniprot.org/align/)으로 ClustalW algorithm을 사용하였다. Phylogenetic trees는 MEGA4.1 (http://www.megasftware.net/index.html30)을 사용하여 Neighbor-Joining 방법으로 작성하였다.

Southern blot 분석

현사시나무 잎으로부터 MagaExtractor Plant Genome (NPK501, Toyobo, Japan)을 이용하여 매뉴얼에 따라 genomic DNA를 분리하였다. 10 μg의 genomic DNA를 10 U의 제한효소 BamHI, EcoRI, HindIII 및 XbaI를 이용하여 각각 완전히 절단하였다. 제한효소로 절단된 genomic DNA를 에탄올 침전 방법으로 회수하고 1% agarose gel에 전기영동하였다. DNA를 capillary transfer 방법으로 nylone membrane (Hybond-XL, Amersham-Pharmacia Biotech, UK)에 전이시켰다(Southern 1975). Probe로 사용할 cDNA의 방사능 표지를 위하여 Multiprime labelling kit (Amersham, USA)를 이용하여 매뉴얼에 따라 반응시켰다. Membrane을 10 ml의 1× PerfectHYB plus hybridization buffer (Sigma, USA)에 넣고 68°C, 1시간 동안 전 처리하였다. α-32P로 표지한 전장의 PagAux/IAA1 cDNA probe를 hybridization 반응액에 첨가하고 68°C에서 12시간 동안 hybridization하였다. 반응이 끝난 membrane은 0.2× SSC-0.1% SDS 용액으로 65°C에서 15분간 3회 세정하였다. Membrane을 X-ray 필름에 부착한 다음 -70°C에서 3일간 노출시킨 후 현상하였다(Lee et al. 2005).

비생물적 스트레스 및 식물호르몬 처리

건조와 염 스트레스 처리를 위하여 현탁배양세포에 250 mM mannitol과 150 mM NaCl 을 각각 처리한 다음 2시간과 10시간 동안 진탕배양하였다. 저온 처리는 현탁배양세포가 들어있는 삼각플라스크를 2°C 얼음 수조에 정치하고 2시간과 10시간 동안 진탕배양하였다. 그리고 현탁배양세포를 건조, 염 및 저온 처리한 시간에 따라 각각 회수하였다. 식물호르몬 처리를 위하여 현탁배양세포에 25 μM abscisic acid (ABA), 20 μM gibberellic acid (GA), 10 μM jasmonic acid (JA) 및 20 μM salicylic acid (SA)를 각각 첨가하고 0.5시간과 5시간 동안 배양한 후에 회수하였다. 모든 배양세포는 진공펌프를 이용하여 배지를 제거하고 액체질소에 얼린 다음 -70°C에 보관하였다(Bae et al. 2009).

Northern blot 분석

10 μg의 total RNA를 1.2% formaldehyde agarose gel에 전기영동한 다음 capillary transfer 방법을 이용하여 Hybond-XL nylone membrane에 전이시켰다. Probe 합성과 hybridization은 Southern blot 분석과 동일한 방법으로 실시하였다. Membrane을 X-ray 필름에 부착한 다음 -70°C에서 1일간 노출시킨 후 현상하였다. mRNA의 발현 정도를 ImageJ 1.4 software (http://rsb.info.nih.gov/ij)를 사용하여 산출하였다.

형성층의 해부학적 특성 조사

형성층의 해부학적 특성을 확인하기 위하여 채취한 줄기 시료를 0.5 × 0.5 cm 크기로 잘라서 고정액에 담아 48시간, 4°C에서 고정시켰다. 고정액은 2.5% glutaraldehyde와 1.6% paraformaldehyde를 포함하도록 제조하였다. 고정된 시료를 에탄올로 탈수한 다음 Technovit 7100 (Kulzer, Germany)을 침투시켜 블록을 제작하였다. 블록은 microtome (Leica RM 2165, Germany)으로 3 μm 두께로 잘라 슬라이드에 고정시켰다. 슬라이드는 0.1% periodic acid와 schiff 용액, toluidine blue O로 염색한 후에 광학현미경(Leica DMR, Germany)로 관찰하였다(Kang et al. 2004).

결과 및 고찰

PagAux/IAA1 유전자의 분리 및 아미노산 서열 특성 분석

현사시나무(Populus alba × P. glandulosa) 현탁배양세포 유래의 cDNA library (Lee et al. 2005)로부터 auxin 반응 유전자와 상동성을 나타내는 1개의 클론을 선발하였다. 이 유전자 서열을 바탕으로 840 base pair (bp)의 cDNA를 합성하여 염기서열을 결정하였다. 이 유전자는 603 bp의 open reading frame (ORF)을 가지는 200개의 아미노산으로 구성되며 아미노산의 예상 분자량은 22.7 kDa이다.

이 유전자의 아미노산 서열을 NCBI의 blastP를 이용하여 분석한 결과, 옥신 반응 유전자 중 Auxin/Indole-3-Acetic acid (Aux/IAA) 패밀리와 상동성이 높았다. 특히 P. trichocarpa의 Aux/IAA 도메인을 포함하는 기능이 알려지지 않은 PtAux22 (Potri.001G177500.1)와 99% 및 PtAux22.3 (Potri.003G056900.1)과 88%의 상동성을 나타내었다(Fig. 1A). 따라서 현사시나무에서 분리한 전장의 cDNA를 PagAux/IAA1 (Populus alba × PopulusglandulosaAuxin/Indole-3-Acetic Acid 1) (MN413593)으로 명명하였다.

Fig. 1.

Comparison of amino acid sequences in PagAux/IAA1 and other Aux/IAA homologues. (A) Phylogenetic tree based on PagAux/IAA amino acid sequence and Aux/IAA sequences from Populus trichocarpa (Pt ), Arabidopsis thaliana (At), Oryza sativa (Os), Zea mays (Zm), Ricinus communis (Rc), Glycine max (Gm), and Vigna radiata (Vr). (B) Multiple alignment of deduced amino acid sequences of PagAux/IAA1 with Aux/IAA homologues from Populus trichocarpa (PtAux22, PtAux/IAA22.3), Arabidopsis thaliana (AtIAA5, AtIAA6, AtIAA19), Glycine max (GmAUX22), and Ricinus communis (RcAUX22). Amino acid domains (I: repression domain, II: F-box binding domain, III-IV: Dimerization domain) are indicated as shaded portions



다른 식물 유래의 Aux/IAA 단백질과 상동성을 분석한 결과, PagAux/IAA1의 아미노산 서열은 아주까리(Ricinus communis)와 옥수수(Zea mays)의 Aux22에 각각 77%와 68%의 상동성을 나타내었다. 또한 애기장대에서 보고된 29개 IAA 유전자 중 AtIAA19의 아미노산 서열과 61%의 상동성을 나타내었다(Fig. 1A). 따라서 PagAux/IAA1 단백질은 Aux/IAA 유전자 패밀리에 속하는 Aux22와 유사하였다.

PagAux/IAA1 단백질은 기존에 알려진 Aux/IAA 유전자 패밀리에서와 같이 4개의 보존된 도메인(I∼IV)과 2개의 nuclear localization signal (NLS) 서열을 가지고 있었다(Fig. 1A). PagAux/IAA1 단백질의 도메인 I은 “TELxLxLPG” 모티프를 가지고 있었다(Fig. 1B). P. trichocarpa에서 보고된 PtIAA의 도메인 I은 “LxLxL” 또는 “TELxLxLPG”로 구성되며, 애기장대에서도 유사하였다(Kalluri et al. 2007). 특히 도메인 I에 포함된 “LxLxL” 모티프는 옥신 반응 인자(Auxin response factor, ARF)의 기능을 억제하는데 관여한다(Tiwari et al. 2004).

PagAux/IAA1은 “VGWPPV” 모티프를 가지고 있었다(Fig. 1B). Aux/IAA 단백질의 안정성과 관련된 도메인 II는 주로 “VGWPPV” 또는 “VGWPPI” 모티프를 가지고 있다. “VGWPPV”를 포함하는 13개의 degron 서열을 가진 단백질은 SCF E3 ubiquitin ligase 복합체의 표적이 되어 분해되는 것으로 알려져 있다(Dharmasiri et al. 2003; Reed 2001; Sato and Yamamoto 2008). 따라서 Aux/IAA 단백질의 분해율 감소와 옥신 반응은 잘 보존된 도메인 II의 변이와 관련이 있다(Ramos et al. 2001). 도메인 III과 IV는 Aux/IAA 단백질 또는 옥신 반응 인자들과 동형이합체화 또는 이형이합체화에 관여한다. 옥신 반응 유전자의 프로모터에는 옥신 반응 cis-element를 가지고 있다. 따라서 옥신 반응 인자에 결합하여 옥신 반응 유전자의 발현을 조절하게 된다(Kim et al. 1997; Ulmasov et al. 1997a; Ulmasov et al. 1997b).

PagAux/IAA1 단백질은 2개의 NLS를 가지고 있다. NLS중 하나는 Aux/IAA 도메인 I/II 사이의 변하지 않는 KR쌍과 도메인 II에 걸쳐져 있고, 다른 하나는 Domain IV에 위치하였다(Fig. 1B). 이 결과는 목화, 토마토를 포함하는 다양한 식물체의 Aux/IAA 도메인을 분석한 결과와 유사하였다(Han et al. 2012; Wang et al. 2005; Wu et al. 2017).

Southern blot analysis

PagAux/IAA1 유전자의 copy 수를 확인하기 위하여 Southern blot 분석을 실시하였다. 현사시나무의 잎에서 분리한 genomic DNA를 제한효소 BamHI, EcoRI, HindIII 및 XbaI로 완전히 절단한 후 전장의 PagAux/IAA1 cDNA를 probe로 사용하였다. 그 결과 BamHI에서는 1개의 band가 나타났고 EcoRI, HindIII 및 XbaI에서는 3개의 band가 나타났다(Fig. 2). PagAux/IAA1의 cDNA 염기서열 상에 제한효소 EcoRI과 HindIII는 622~627 nt와 774~779 nt에 위치하였다.

Fig. 2.

Genomic Southern blot analysis of PagAux/IAA1 gene in the hybrid poplar (Populus alba × P. glandulosa). Genomic DNAs digested with BamHI (B), EcoRI (EI), HindIII (H) or XbaI (X) were fractionated by electrophoresis on a 1.0% agarose gel and transferred onto a positively charged nylon membrane. 32P-labeled full-length PagAux/IAA1 cDNA hybridized the nylon membrane



PagAux/IAA1 유전자와 높은 서열 상동성을 보인 P. trichocarpaAux/IAA (Potri.0001s17780.1)와 PtAux22.3 (Potri. 003G056900.1)은 포플러 염색체 상에 single copy로 존재하며 인트론 부위에 제한효소 HindIII 자리를 각각 2개와 5개를 가지고 있다. 반면 제한효소 EcoRI과 XbaI은 P. trichocarpaAux/IAA에서만 확인되었다. 이상의 결과는 PagAux/IAA1 유전자가 현사시나무의 genome 상에 single copy로 존재하는 것을 의미한다.

PagAux/IAA1 유전자의 조직 특이적 발현

PagAux/IAA1 유전자의 조직 특이적 발현을 확인하기 위하여 현사시나무의 잎, 줄기, 뿌리 및 꽃으로부터 total RNA를 분리하여 northern blot 분석을 실시하였다. 그 결과 PagAux/IAA1은 잎과 꽃에서 발현되었다(Fig. 3). Aux/IAA 유전자 패밀리의 발현이 조직에 따라 차이를 보이는 것이 강낭콩, 대두, 목화, 벼 및 애기장대에서 보고되었다(Abel et al. 1995; Ainley et al. 1988; Han et al. 2012; Song et al. 2009b, Yamamoto et al. 1992). 특히 Aux/IAA 유전자는 애기장대에서 측근 형성, 정아 우세 및 잎의 형성과 관련이 있었다(Fukaki et al. 2002; Leyser et al. 1996; Rogg and Bartel 2001; Tian and Reed 1999; Timpte et al. 1995). 교잡종 사시나무(Populus tremula L. × Populus tremuloides Michx.)의 경우, 옥신을 처리하지 않은 어린 잎과 성숙 잎에서 PttIAA 유전자의 발현이 낮았다. 그러나 잎의 발달 단계에 따른 옥신 반응성을 분석한 결과, 대부분의PttIAA 유전자들은 옥신을 처리한 어린 잎에서 발현이 증가되었으나 성숙 잎에서 발현이 억제되었다(Moyle et al. 2002). 이러한 결과는 Aux/IAA 유전자의 발현 조절이 조직 특이적 발현과 함께 발달 과정에서 옥신 신호전달경로의 반응 매커니즘의 조절과 관련되어 있음을 의미한다.

Fig. 3.

Tissue-specific expression of PagAux/IAA1. Northern blot analysis of total RNA extracted from mature leaves (L), stems (S), roots (R), and flowers (F) of the hybrid poplar. We used full-length PagAux/IAA1 cDNA as the probe, and ethidium-bromide stained ribosomal RNA (rRNA) served as a loading control



현탁배양세포의 생장 주기에 따른 PagAux/IAA1 유전자의 발현

현사시나무 현탁배양세포의 생장 주기에서 PagAux/IAA1 유전자의 발현 양상을 확인하기 위하여 각 시기별 현탁배양세포로부터 total RNA를 분리한 다음 northern blot 분석을 실시하였다(Fig. 4). Fig. 4A에서 현사시나무의 현탁배양세포는 S자형 생장 곡선을 나타내었다(Lee et al. 2007). 그리고 Fig. 4B에서 PagAux/IAA1 유전자는 현탁배양세포의 계대일로부터 12일까지 발현되었으나 12일 이후에는 발현이 감소하였다.

현탁배양세포에서 PagAux/IAA1 유전자는 세포 분열과 세포벽 형성이 활발히 이루어지는 유도기와 초기 대수증식기에 발현이 높게 나타났다. 옥신에 의해 유도된 Aux/IAA 단백질이 ARF 그리고 TIR-AFB와 복합체를 이루면 Aux/IAA 단백질의 분해가 시작되고 내분열기(endocycle)에서 유사분열기(mitotic cycle)로 전환되어 세포 분열이 이루어진다(Calderón Villalobos et al. 2012; Ishida et al. 2010; Parry et al. 2009; Tan et al. 2007; Weijers et al. 2005). 반면, 세포 분열이 정지하거나 노화가 진행되는 안정기에는 발현이 되지 않았다. 이와 유사한 결과로 담배와 애기장대 잎의 노화 과정에서 대부분의 IAA 유전자의 발현이 감소된다는 것이 보고되었다(van der Graaff et al. 2006; Zhao et al. 2018). 따라서 PagAux/IAA1 유전자가 현사시나무의 세포 분열을 조절하는데 중요한 역할을 수행할 것으로 판단된다.

Fig. 4.

Expression levels of PagAux/IAA1 in hybrid poplar cells during the normal growth phase in suspension culture. (A) Growth kinetics of the hybrid poplar cells during suspension culture. We analyzed the fresh cellular mass by 28 days. (B) Northern blot analysis of total RNA extracted from cells at the indicated times. We used full-length PagAux/IAA1 cDNA as the probe, and ethidium-bromide stained ribosomal RNA (rRNA) served as a loading control. Image J 1.4 software calculated the expression levels of the PagAux/IAAI



비생물적 스트레스 처리에 따른 PagAux/IAA1 유전자의 발현

PagAux/IAA1 유전자가 건조, 염 및 저온과 같은 비생물적 스트레스에 반응하여 발현되는지 확인하기 위하여 northern blot 분석을 실시하였다. 그 결과 PagAux/IAA1 유전자는 건조 및 염 처리구 10시간에서 발현이 거의 나타나지 않은 반면 저온 처리구 10시간에서 발현이 1.7배 증가하였다(Fig. 5A). 이와 유사한 결과가 건조와 염 스트레스를 처리한 벼와 수수에서 보고되었다(Song et al. 2009a; Wang et al. 2010). 벼에서 식물호르몬과 스트레스 처리에 따른 유전자 발현을 분석한 결과 OsIAA6OsIAA7이 IAA, GA 및 JA에 의해 발현이 증가하였으나 건조와 염 스트레스 반응은 다르게 나타났다. OsIAA6는 건조 처리에 의해 발현이 증가한 반면 OsIAA7는 염 처리에 의해 발현이 감소하였다(Song et al. 2009a). 그리고 ABA 처리에 의해 발현이 감소한 OsIAA4, OsIAA21, OsIAA31은 건조와 염 스트레스에 다르게 발현되었다. OsIAA4OsIAA21은 건조 처리에 의해 발현이 증가하고, OsIAA21은 염 처리에 의해 발현이 감소하였다. 특히 OsIAA31은 건조와 염 처리 모두에서 발현이 감소하였다(Song et al. 2009a). 수수에서 보고된 SbIAA 유전자 대부분은 건조 처리에 의해 발현이 감소하였다. 그러나 SbIAA8, SbIAA11, SbIAA22SbIAA23은 건조 처리한 잎에서 발현이 증가하였고, SbIAA26은 건조 처리한 뿌리에서 증가하였다(Wang et al. 2010). 그리고 저온 처리한 애기장대의 뿌리에서 옥신 농도가 증가하고 GUS로 표지된 auxin responsive marker AtIAA2의 발현이 증가하면서 뿌리 생장이 저해되었다(Shibasaki et al. 2009). 따라서 PagAux/IAA1 유전자가 건조, 염 및 저온 스트레스에 반응하여 다르게 조절되고 현사시나무의 생장을 조절하는데 관여할 것으로 판단된다.

Fig. 5.

Expression levels of PagAux/IAA1 under various treatment conditions. (A) PagAux/IAA1 expression in response to treatment with mannitol (250 mM), NaCl (150 mM), and cold temperature (2°C) for 2 and 10 h. Untreated control cells (Control) incubated for the same period. (B) PagAux/IAA1 gene expression after exogenous application of plant hormones including ABA (25 μM), GA (20 μM), JA (10 μM), and SA (20 μM) for 0.5 and 5 h



식물호르몬 처리에 따른 PatgAux/IAA1 유전자의 발현

식물호르몬 처리에 따른 PagAux/IAA1 유전자의 발현 변화를 조사하기 위하여 abscisic acid (ABA), gibberellic acid (GA), jasmonic acid (JA) 및 salicylic acid (SA)를 처리한 현탁배양세포에서 분리한 total RNA를 사용하여 northern blot 분석을 실시하였다. PagAux/IAA1 유전자의 발현은 ABA와 SA 처리 5시간에서 대조구에 비해 0.6배와 0.3배 감소하였다(Fig. 5B). 반면 PagAux/IAA1 유전자의 발현은 GA 처리 5시간에서 대조구에 비해 2.5배 증가하였고, JA 처리 30분과 5시간에서 대조구에 비해 4.9배와 3.5배 증가하였다(Fig. 5B).

저온 스트레스에 반응하는 유전자와 달리 건조와 염 스트레스에 반응하는 유전자는 ABA 신호전달경로에 의해 조절된다(Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki 2000). 이와 관련하여 PagAux/IAA1 유전자의 발현을 분석한 결과 건조와 염 스트레스뿐만 아니라 ABA 처리에 의해서도 발현이 감소하였다. Du et al. (2013)에 따르면 애기장대에서 건조, 저온 및 열 스트레스에 반응하여 내인성 옥신 및 JA가 다르게 조절된다. 애기장대는 건조 스트레스에 반응하여 옥신 농도가 감소한 반면 저온 및 열 스트레스에 반응하여 옥신 농도가 증가하였다. JA 농도는 건조와 저온 스트레스에 반응하여 증가한 반면 열 스트레스에 반응하여 감소하였다. 그리고 옥신 생합성 또는 대사 관련 유전자의 발현은 저온과 열 스트레스에 의해 상향 조절되지만 건조 스트레스에 의해 억제 되었다(Du et al. 2013). 또한 애기장대에 methyl jasmonic acid을 처리하면 뿌리에서 옥신 수송 단백질 및 생합성 유전자가 조절되어 옥신이 축적되고 측근이 유도되었다(Sun et al. 2009). 따라서 비생물적 스트레스 및 JA 처리에 따른 PagAux/IAA1 유전자의 발현 차이는 옥신 신호전달경로와 관련이 있을 것으로 판단된다.

PagAux/IAA1 유전자는 GA 처리에 의해 발현이 증가한 반면 SA 처리 및 노화된 현탁배양세포에서 발현이 감소하였다. GA는 애기장대의 뿌리와 교잡종 사시나무(Populus tremula L. × tremuloides Michx.; clone T89)의 형성층에서 PIN의 발현을 자극시켜 줄기 내 옥신 농도를 증가시킨다(Björklund et al. 2007; Willige et al. 2011). 반면 SA는 애기장대에서 Aux/IAA 단백질을 안정화시키면서 옥신의 신호전달경로를 방해하여 생장을 저해한다(Reitz et al. 2015; Wang et al. 2007). 따라서 현사시나무의 세포 생장과 관련하여 PagAux/IAA1 유전자의 발현 차이는 옥신 신호전달경로의 조절과 관련이 있을 것으로 판단된다.

형성층에서 PagAux/IAA1 유전자의 발현

형성층 발달에 따른 PagAux/IAA1 유전자를 분석하기 위하여 줄기의 형성층이 발달하기 시작하는 4월에 샘플을 채취하였다. S1 단계에서 형성층 세포의 분열이 시작되고 S2 단계 이후 형성층 세포 수가 증가하였다(Fig. 6A). 특히 PagAux/IAA1은 3개월 동안 생장한 삽목묘 줄기에서 발현이 나타나지 않는 반면 포지에서 생장한 2년생 줄기에서 형성층 세포가 발달함에 따라 발현이 증가하였다(Fig. 3Fig. 6B).

Fig. 6.

PagAux/IAA1 expression induced during cambial cell division. (A) A transverse section of the differentiation of cambium in hybrid poplar stems. We observed an increasing number of cell layers in the cambium (S1-S4). Ph: Phloem, C: cambium, Xy: xylem. Double yellow arrows indicate cambial cell layers. (B) Northern blot analysis of total RNA extracted from the cambium in hybrid poplar stem (S1-S4)



교잡종 사시나무(Populus tremula L. × Populus tremuloides Michx.)의 형성층 발달에 관한 연구에 따르면 옥신은 수층분열(anticlinal division)에 관여한다(Björklund et al. 2007; Moyle et al. 2002; Nilsson et al. 2008). 그리고 PttIAA1-PttIAA8의 8개의 유전자는 형성층 및 형성층 발달 과정에서 각각 특이적으로 발현하였다(Moyle et al. 2002). PttIAA 유전자는 형성층이 활성 상태에서 휴면 상태로 전이 될 때 발현이 감소하였다. 그리고 PttIAA5를 제외한 PttIAA 유전자는 분열 세포를 가지는 형성층과 세포 분열과 팽창이 일어나는 목부 조직에서 발현이 증가하였다. 특히 PttIAA3는 줄기의 피층, 섬유세포 및 사부 세포에서 발현이 나타나지 않았다(Moyle et al. 2002). 옥신 유도성 PttIAA의 조직 특이적 발현 차이 및 휴면 전이 동안의 발현 변화는 옥신 및 목부 발달에 대한 형성층 반응을 매개하는데 이들 유전자들이 관여하는 것을 의미한다(Moyle et al. 2002). 따라서 형성층 세포가 분열할 때 발현이 증가하는 PagAux/IAA1 유전자는 형성층 발달에 관여할 것으로 판단된다.

이상의 결과와 연구사례들은 Aux/IAA 유전자가 다양한 비생물적 스트레스 및 식물호르몬에 대하여 다르게 반응하고 식물의 생장과 발달 과정을 조절하는데 기여하는 것을 보여주었다. 특히 현사시나무에서 세포 생장과 형성층 발달 그리고 저온 스트레스에 반응하여 PagAux/IAA1 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 생장 조절 및 저온 스트레스 반응과 관련된 PagAux/IAA1 유전자의 조절 기작을 구명하기 위해서는 PagAux/IAA1 유전자의 발현이 조절된 형질전환체를 이용한 기능 분석이 필요하다. 이는 향후 PagAux/IAA1 유전자의 발현 조절을 통하여 저온 스트레스 내성 증진 및 바이오매스가 증가된 임목을 개발하는데 도움을 줄 것으로 기대된다.

적 요

옥신은 식물의 생장과 발달 과정에서 중요한 조절자로서 기능한다. 옥신 신호전달 과정은 3개의 주요 옥신 반응 전사인자인 Auxin/indole-3-acetic acid (Aux/IAA), Gretchen Hagen 3 (GH3), 그리고 small auxin up RNA (SAUR) 유전자에 의해 조절된다. 특히, Aux/IAA는 옥신 신호에 반응하여 빠르게 축적되는 수명이 짧은 핵 단백질이다. 이 실험에서 우리는 현사시나무(Populus alba × P. glandulosa)로 부터PagAux/IAA1 유전자를 분리하고 발현 특성을 분석하였다. PagAux/IAA1 cDNA는 4개의 보존된 도메인과 2개의 nuclear localization sequence (NLS)을 포함한 200개의 아미노산을 암호화하고 있다. Southern blot 분석으로 현사시나무 genome에 PagAux/IAA1 유전자가 single copy로 존재하는 것을 확인하였다. PagAux/IAA1 유전자는 잎과 꽃에서 특이적으로 발현되었다. 그리고 PagAux/IAA1 유전자는 현탁배양세포의 생장 과정에서 초기 지수생장기에 발현되었다. PagAux/IAA1 유전자의 발현을 분석한 결과, 건조와 염 스트레스 및 식물호르몬인 ABA 처리에 의해 발현이 감소된 반면 저온 스트레스, 형성층의 세포 분열 과정 그리고 식물호르몬인 GA와 JA 처리에서 발현이 증가하였다. 따라서 PagAux/IAA1 유전자가 현사시나무에서 저온 스트레스 반응뿐 아니라 생장 과정에 관여할 것으로 판단된다.

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