들깨(Perilla frutescens)는 꿀풀과(Lamiaceae)의 한해살이 식물로, 중국, 인도, 한국, 일본, 베트남 및 기타 아시아 지역에서 식품(Asif et al. 2012; Heci 2001) 또는 약용식물(Ahmed et al. 2018)로 널리 재배되어 왔다. 들깻잎과 종자에서 추출된 기름은 특별한 향을 가지고 있어서 소스(sauce), 과자, 치약 등의 향료로 이용되고 또한 강한 방부력을 가지고 있어 항곰팡이 재료로도 이용되고 있다(Hong et al. 1986). 들깨의 종자는 40~50%의 지방을 가지고 있고 그중 90% 이상이 올레산(18:1), 리놀레산(18:2), 리놀렌산(18:3) 등의 불포화 지방산이 차지하고 있다(Kim et al. 2019). 특히 들깨 지방산의 60%이상을 차지하고 있는 리놀렌산(α-linolenic, ALA)은 심장질환 예방, 알레르기 치료, 암예방 등에 효과가 있어 널리 연구되고 있으며 그 경제적 가치는 매우 높다(Huang et al. 2023; Kaur et al. 2014; Pressi et al. 2023).

한국에서 재배되는 주요 들깨 품종에는 남천, 다유, 동글2호, 늘보라, 일엽, 보라, 새엽실 들깨 등이 있다. 엽채용으로 많이 재배되고 있는 남천들깨의 잎에는 비타민 E와 칼슘의 함량이 높고 종자에는 스쿠알렌의 함량이 높다(Han et al. 2004; Jung et al. 1998; Um et al. 2013). 종유용(seed oil)으로 육성된 다유들깨(Dayu)는 표준품종인 새엽실들깨보다 기름함량이 높고 리놀렌산 또한 높은 함량을 가지고 있어서(Lee et al. 2011) 최근에는 다유가 많이 연구되고 있다(Ha et al. 2012; Kim et al. 2022).

식물의 캘러스 유도와 재분화는 식물재료의 유전형 및 절편체의 종류에 따라 식물생장호르몬의 조성에 차이가 있고 또한 연구자에 따라 다르게 보고되기도 한다(Kim et al. 1993; Kim and Lee 2007; Lee et al. 1994; Moon et al. 2002). 들깨의 경우 약(anther)은 NAA와 kinetin의 조성(Lee et al. 2003)이 재분화 효율이 좋았고 자엽과 하배축은 BA와 NAA의 조성이 효과적이었다(Jung 1999; Kim and Lee 2007). 현대 식물생명공학 연구는 형질전환기술과 유전자재조합기술을 기반으로 하는 과발현 혹은 유전자편집을 통해 이루어지고 있으며 형질전환의 효율은 대부분의 식물에서 조직배양체계의 확립과 식물 재분화 효율이 매우 중요하게 작용한다.

본 연구에서는 다유들깨를 가지고 하배축, 자엽, 본엽의 절편체를 재료로 조직배양을 시도하였고 다양한 조합의 식물생장호르몬이 배합된 배지 실험을 통해 재분화효율이 높은 배지 조성을 선발하였다.

들깨 품종 및 시료의 무균 처리

본 연구에 사용된 두 가지 들깨 품종, ‘다유들깨’(Perilla frutescens L. cultivar Dayu)와 ‘남천들깨’(P. frutescens L. cultivar Namcheon)의 종자는 농촌진흥청 국립식량과학원 남부작물부에서 제공받았다. 들깨 종자는 70% 에탄올에서 1분간 흔든 후 0.03% Tween20이 첨가된 1% NaClO용액에서 30분간 소독 후, 멸균수로 5회 세척하였다(Kim and Lee 2007). 표면 소독한 남천과 다유들깨의 종자를 MS 배지(Murashige and Skoog 1962)에 각각 파종하여 발아 후 성장한 10~15일된 유식물의 자엽, 하배축, 본엽을 각각 절취하여 실험에 이용하였다. 자엽과 본엽 절편의 길이는 모두 0.5 cm × 0.5 cm이고, 하배축의 길이는 1 cm이다.

식물조직배양 배지조성 및 배양환경

조직배양의 기본배지는 MS배지를 사용하였다. 최적의 캘러스 및 재분화를 위해서 이미 발표된 들깨 조직배양 논문을 참고하여 오옥신은 1-Naphthaleneacetic acid (NAA) 또는 Indole- 3-acetic acid (IAA), 시토키닌은 6-benzylaminopurin (BA)을 선택하였다(Hou and Jia 2005; Kim and Lee 2007; Lee et al. 2003; Tariq Hossain et al. 2010; Zhang 2007). 캘러스의 유도는 25 ± 2°C의 암조건과 장일조건(조명 1600~2000 lux, 명16시간/암8시간)에서 2주 동안 하였고, 재분화유도는 캘러스가 유도된 식물 절편체를 재분화를 위한 배지로 옮긴 후 장일조건의 환경에서 진행하였다. 각각의 실험에서 적용된 식물생장호르몬의 조합과 농도는 Table 1, 2, 3에 제시하였다. 캘러스의 유도는 치상 후 2주 후에 조사하였고, 신초의 형태 및 재분화율의 분석은 재분화배지로 옮긴 후 4주 혹은 5주 후에 조사하였다. 뿌리는 식물생장호르몬을 첨가하지 않은 1/2 MS배지에서 유도하였고, 기내에서 정상적으로 자란 식물체는 상토와 모래를 1:1로 석은 화분으로 옮겨 온실에서 순화시켰다.

Table 1 . Shoot regeneration rates from the hypocotyl explants of Perilla frutescens var. ‘Dayu’ cultured on media containing varying combinations of NAA and BA and under dark and long-day conditions.

Plant growth regulator (mg/L)		Shoot regeneration rate (%)
		Dark	Long-day
0.0 NAA	0.1 BA	0	0
	0.5 BA	0	0
	1.0 BA	0	0
0.1 NAA	0.1 BA	26.7 ± 9.4	56.7 ± 14.1
	0.5 BA	84.4 ± 9.4	86.7 ± 8.5
	1.0 BA	0	83.7 ± 9.3
0.5 NAA	0.1 BA	0	0
	0.5 BA	6.7 ± 1.4	46.7 ± 9.6
	1.0 BA	0	76.7 ± 9.8

Table 2 . Shoot regeneration rates from the cotyledon, hypocotyl, and leaf explants of Perilla frutescens vars. ‘Namcheon’ and ‘Dayu’ cultured on media containing various combinations of BA, BA/ NAA, or BA/IAA.

PGR (mg/L)			Shoot forming callus ratio (%)
BA	NAA	IAA	Cotyledon		Hypocotyl		Leaf
			Namcheon	Dayu	Namcheon	Dayu	Namcheon	Dayu
0.5	no	no	NT	NT	NT	90.0 ± 3.0	NT	NT
	0.01	no	NT	NT	NT	86.4 ± 3.4	NT	NT
	0.1	no	33.3 ± 3.3	11.1 ± 0.4	0	88.3 ± 2.7	13.9 ± 1.1	61.1 ± 7.2
	0.5	no	13.9 ± 1.3	0	0	50.0 ± 7.1	22.2 ± 5.4	22.2 ± 4.8
	no	0.1	0	27.8 ± 7.8	13.3 ± 3.3	81.7 ± 10.9	6.3 ± 2.5	27.8 ± 1.7
	no	0.5	0	5.6 ± 1.1	13.3 ± 0.4	55.2 ± 6.5	12.5 ± 3.5	11.1 ± 2.2
1.0	no	no	NT	NT	NT	86.4 ± 3.4	NT	NT
	0.01	no	NT	NT	NT	77.3 ± 11.3	NT	NT
	0.1	no	0	16.7 ± 7.8	68.0 ± 8.5	84.8 ± 0.4	5.6 ± 3.5	16.7 ± 1.3
	0.5	no	0	0	10.0 ± 3.6	76.7 ± 3.3	0	0
	no	0.1	0	44.4 ± 9.3	33.3 ± 3.3	87.8 ± 5.9	0	72.1 ± 4.9
	no	0.5	19.1 ± 4.1	5.6 ± 0.8	10.0 ± 2.5	35.0 ± 4.2	5.6 ± 0.8	50.0 ± 4.1

PGR: plant growth regulator; NT: not tested; no: not added.

Table 3 . Frequency of normal plant regeneration via callus induction from Perilla frutescens var. ‘Dayu’ cultured on media containing varying concentrations of BA and NAA.

Plant growth regulator (mg/L)		Plant regeneration (%)
		Normal	Abnormal
0.5 BA	no	70.5 ± 3.2	19.3 ± 8.0
	0.01 NAA	42.1 ± 8.1	42.3 ± 4.5
	0.1 NAA	25.0 ± 2.4	60.0 ± 9.4
1.0 BA	no	51.1 ± 1.5	37.8 ± 4.3
	0.01 NAA	31.8 ± 6.4	48.9 ± 1.6
	0.1 NAA	33.3 ± 4.7	48.3 ± 7.1

no: not added.

캘러스 유도

재분화율이 높은 다유들깨(종유용)의 식물조직배양체계를 확립하기 위해서 종자에서 발아된 유식물체를 잎, 자엽, 하배축으로 구분하여 캘러스 유도 및 재분화 실험을 수행하였다. 효율적인 캘러스 유도와 식물재분화 환경을 조성하기 위한 중요한 요소 중 하나는 오옥신과 시토키닌의 종류와 적정 농도의 선택이다. 본 연구에서는 캘러스 유도를 위하여 식물생장호르몬은 각각 2가지 농도(mg/L)의 NAA (0.1, 0.5)와 BA (0.1, 0.5)를 조합하여 총 4가지 조합을 암조건과 장일 조건에서 각각 14일 동안 배양하였다. 실험 결과, 7일 지났을 때 절단면에서 캘러스의 형성이 육안으로 관찰되기 시작하였다. 치상 후14일에 조사하였을 때 0.1 mg/L NAA와 0.5 mg/L BA 조합에서 배양된 하배축에서 육안으로 가장 건강한 캘러스가 형성되었고, 0.5 mg/L NAA에서는 0.1 mg/L NAA에서보다 조금 더 어두운 색조의 캘러스가 형성되었다(Fig. 1). 또한 암조건과 장일조건 모두 건강한 캘러스가 형성되었지만 장일조건에서 조금 더 밝은 색조의 캘러스가 형성되었다(Fig. 1). 또한 NAA 없이 0.1 mg/L 또는 0.5 mg/L BA만 첨가된 배지에서는 건강한 캘러스가 유도되지 않았고, 재분화 배지로 옮겼을 때 신초(shoot)가 유도되지 않았다. 따라서 다유들깨의 하배축에서 재분화 가능한 캘러스가 유도되기 위해서는 적정농도의 NAA와 BA가 요구된다. 일반적으로 식물조직배양의 캘러스 유도 단계에서 빛은 식물의 재분화에 부정적인 영향을 주지만 식물에 따라서 재분화를 촉진하는 경우도 있다(Long et al. 2022). 그러므로 암조건과 장일조건에서 유도된 각각의 캘러스 중 어느 쪽이 재분화율이 높은 지 알기 위해 Table 1에 제시된 NAA/BA 조합의 배지에서 재분화율 실험을 진행하였다. 실험결과, 전체적으로 모든 농도조합에서 암조건보다 장일조건에서 유도된 캘러스에서 재분화 빈도가 높은 것으로 조사되었다(Table 1). 암조건과 장일조건 모두0.1 mg/L NAA + 0.5 mg/L BA의 배지에서 재분화율이 가장 높았으며 장일조건에서 86.7%, 암조건에서 84.4%로 장일조건에서 조금 높게 조사되었다(Table 1). 일반적으로 빛에 의해 체세포배아(somatic embryos)의 형성이 방해 받아 재분화율이 낮아지는 경우가 많으므로 많은 식물에서 암조건에서 캘러스를 유도한다(Bhatia and Bera 2015; Long et al. 2022; Zenser et al. 2001). 그러나 오히려 빛에 의해 체세포배아의 형성이 촉진되어 재분화율이 높아지는 식물들도 보고 되었다(Siddique and Islam 2018; Yu et al. 2019). 본 연구에서 다유들깨의 경우, 캘러스 유도 단계에서 암조건보다 빛이 있는 장일조건에서 캘러스를 유도했을 때 재분화가 촉진되는 결과를 얻었다.

Figure 1. The calli induced from the hypocotyl explants of Perilla frutescens var. ‘Dayu’, cultured on MS media containing varying concentrations (mg/L) of NAA and BA under dark and long-day conditions. Scale bars are 2 mm

고효율의 재분화 조건 확립

건강한 캘러스 유도를 위한 식물생장호르몬의 조합을 결정한 후 고효율의 신초 형성을 위해 다음과 같은 식물생장호르몬 조합 실험을 전개하였다. 2가지 농도(mg/L)의 BA (0.5, 1.0)와 2가지 농도(mg/L)의 NAA (0.1, 0.5) 또는 IAA (0.1, 0.5)를 조합하여 총 8가지의 배지에서 남천들깨와 다유들깨의 자엽, 하배축, 잎에서 각각 신초 재분화율을 조사하였다(Fig. 2). 3가지 시료(자엽, 하배축, 잎) 모두 남천들깨보다 다유들깨에서 신초의 재분화율이 현저하게 높았다(Table 2). 또한 남천들깨와 다유들깨 모두 자엽이나 잎에 비해 하배축에서 신초 재분화율이 매우 높았으며 모든 조합의 실험 중 약 90%의 재분화율을 보여준 NAA 없이 0.5 BA (mg/L)만 첨가한 배지의 다유들깨가 가장 높은 재분화율을 보여 주었다(Table 2). 본 연구에서 사용된 품종과 시료 가운데 재분화율이 가장 높게 나온 다유들깨의 하배축을 정단부, 상부, 중간부, 기부의 4부분으로 절단하여 하배축의 위치별로 재분화율을 조사하였다. 실험 결과, 정단부에서 재분화율이 가장 높았으며(97.6%) 기부(92.3%), 중간부(79.8%), 상부(70.8%)의 순서로 조금씩 낮아지는 것으로 조사되었다(Fig. 3). Tariq Hossain 등(2010)은 본 실험결과와 마찬가지로 하배축의 정단부에서 64.3%로 가장 재분화율이 높게 나왔다고 보고하였다. 그러나 본 실험의 결과와는 달리 기부에서 가장 낮은 1.33%의 재분화율을 보였고 상부에서15.6%, 중간부에서 4%의 재분화율을 보였다고 보고하였다.

Figure 2. Shoot regeneration from the cotyledon, hypocotyl, and leaf explants of Perilla frutescens vars. ‘Namcheon’ and ‘Dayu’ cultured on MS media with varying concentrations (mg/L) of either BA and NAA or BA and IAA

Figure 3. Plant regeneration efficiency of explants taken from different positions along the hypocotyl of Perilla frutescens var. ‘Dayu’. (a) Four hypocotyl explants, including the apical end, top, middle, and bottom from a Dayu seedling. (b) Shoot regeneration from the apical end, top, middle, and bottom explants. (c) Shoot regeneration rates of the four explants. The vertical bars represent the standard deviation

고농도의 오옥신은 신초가 자라는 대신 캘러스를 촉진시키고(Skoog and Miller 1965), 소량의 오옥신을 첨가하면 비정상적인 신초가 자라는 것을 감소시키는 효과가 있다(Lee et al. 2003). 본 실험에서도 재분화된 신초 중에는 정상적인 식물체로 자라지 못하는 비정상 신초들이 많이 포함되어 있었으므로 사용된 모든 시료 중 가장 재분화율이 높았던 다유들깨의 하배축을 가지고 몇 가지 농도의 식물생장호르몬 조합에서 정상식물체와 비정상식물체를 구분하여 재분화율을 조사하였다. 실험 결과, 정상적인 식물체의 재분화를 위해서는 NAA 농도 조절이 매우 중요하며 NAA 없이 0.5 BA 만 첨가했을 때 정상 식물체의 출현율이 가장 높았고(70.5%) NAA의 농도가 높아질수록 비정상 식물체의 출현율이 높아지는 경향을 보였다(Table 3).

들깨의 조직배양에서 뿌리의 유도는 식물생장호르몬의 첨가 없이 MS 기본배지 만으로 충분한 것으로 보고 되었다(Hou et al. 2005; Kim et al. 2004; Zhang et al. 2005). 따라서 본 실험에서도 식물생장호르몬의 추가 없이 1/2 MS 기본배지 만으로 뿌리를 유도하였으며, 1/2 MS 배지로 옮긴 신초는 10~15일 후에 뿌리가 관찰되었고 30일 후에는 대부분의 신초가 완전한 식물체로 성장하였다(Fig. 4).

Figure 4. Overview of the experimental procedure from hypocotyl explant to shoot and root regeneration via callus induction in Perilla frutescens var. ‘Dayu’. (a) Explant on callus induction medium. (b) Callus induction following culture for 15 days on 0.1 NAA and 0.5 BA (mg/L). (c) Shoot formation following culture for 20 days after transferring the callus from (b) into 0.5 BA (mg/L) without NAA. (d) Rooting and entire plant regeneration following transfer of the shoot from (c) to 1/2 MS medium without NAA and BA

본 연구는 종유용 들깨 품종인 다유들깨’의 유식물체에서 캘러스 유도를 통한 고효율의 재분화 체계를 구축하기 위해 수행되었고 이미 보고된 바 있는‘남천들깨’와 함께 연구를 진행하였다. 캘러스는 잎, 자엽, 하배축 중 0.1 mg/L NAA와 0.5 mg/L BA가 첨가된 배지에서 배양된 다유들깨의 하배축에서 가장 건강한 캘러스가 형성되었다. 암상태와 장일조건에서 각각 캘러스를 유도한 후 신초 재분화를 유도했을 때 모든 조건에서 남천들깨보다 다유들깨가 재분화율이 월등하게 높았다. 또한 0.1 mg/L NAA와 0.5 mg/L BA 배지의 암상태와 장일조건에서 다유들깨 하배축의 신초 재분화율은 각각 86.7%와 84.4%로 두 조건 간 차이는 낮은 것으로 조사되었지만 전체적으로 암조건에 비해 장일조건에서 유도된 캘러스의 재분화 빈도가 높았다. 본 연구에서 다유들깨의 하배축으로부터 고효율의 재분화 조건을 확립하기 위해 다양한 식물생장호르몬 조합실험을 수행한 결과 NAA 없이 0.5 mg/L BA 만 첨가된 배지에서 가장 높은 90%의 재분화율을 보여 주었으며 이 중 정상적인 식물체가 70.5% 와 비정상적인 식물체가 19.3%로 조사되었고 NAA가 첨가되거나 농도가 높아질수록 비정상 식물체의 출현율이 높아졌다. 정상적으로 재분화된 신초는 1/2 MS 배지로 옮긴 후 10~15일 후에 뿌리가 관찰되었고 30일 후에는 완전한 식물체로 성장하였다. 본 연구에서 확립된 다유들깨 하배축을 이용한 재분화 체계는 지금까지 보고된 다른 들깨 품종들의 재분화 체계에 비해 재분화 효율이 높았으며 향후 들깨에서 조직배양과 형질전환에 의존하는 유전자편집 등의 분자육종 분야에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

이 논문은 2023년도 교육부의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업임(No. 2019R1A6A1A11052070).