벼는 전 세계적으로 약 30억 명의 사람들에게 식량을 공급하는 주요 작물 중 하나로, 크게 형태학적 및 생리학적 특성이 서로 다른 자포니카형과 인디카형의 두 가지 아종으로 구분된다(Bu et al. 2021; Sun et al. 2020). 자포니카 벼는 주로 온대 지역에서 재배되며, 15°C 이하의 저온에서 일정 시간 동안 성장을 유지하고 생존할 수 있으나, 인디카 벼는 주로 열대 및 아열대 지역에서 재배되며 저온에 민감한 특징을 나타낸다(Gan et al. 2024). 벼의 냉해는 영양 단계와 번식 단계를 포

함한 모든 성장 단계에서 발생하며, 발아 및 출수 지연 등을 초래하여 생산성을 저해하는 중요한 재해 중 하나이다(Ijaz et al. 2019; Ma et al. 2015). 1980년대에 전국적으로 통일형 품종이 냉해 피해를 입으면서 사회적 문제로 대두되었으나, 여전히 통일형 품종의 내냉성 개선은 중요한 의제로 남아 있다(Chung and Heu 1991; Hyun et al. 2016; Won et al. 2014). 국내의 벼 육종은 자포니카 품종 개발에 집중되었으며, 인디카 품종은 주로 유용 유전자의 도입을 위한 유전자원으로 제한적으로 활용되어 왔다.

현재까지 약 4,500개의 벼 유전자가 분자생물학적 연구와 유전 육종학 연구 접근법을 통해 기능이 보고되었다(Huang et al. 2022). 이러한 유전자의 기능은 Nipponbare와 같은 특정 품종의 대립유전자를 과발현하거나 발현을 억제한 형질전환체 및 돌연변이체의 표현형 분석 연구를 통해 확인되었다. 벼의 내냉성 개선을 위한 분자생물학적 연구 또한 세계적으로 수행되어왔다. 벼의 내냉성은 다수의 유전자에 의해 조절되는 양적 형질로, 이들 개별 유전자의 기능을 이해하는 것은 내냉성 메커니즘을 이해하는데 중요한 의미를 가진다. 하지만 벼 육종에서 형질 개선을 위해서는 아종 또는 품종 간에 기능이 없거나 약한 대립유전자를 기능이 강한 대립유전자로 치환하는 것이 필요하다. 따라서 분자생물학적 유전자 기능 구명과 더불어 해당 유전자의 대립유전자 별 기능적 차이가 존재하는지가 중요한 고려사항이다. 이러한 이유로 많은 생명공학적 연구가 성공적으로 진전되었으나, 소수의 유전자만이 실제 벼 육종 현장에서 활용되고 있다. 대표적으로 활용되는 유전자는 Xa1(Yoshimura et al. 1998), Xa3(Yoshimura et al. 1992) 등의 흰잎마름병 저항성 유전자와 Sub1(Septiningsih et al. 2009; Xu and Mackill 1996; Xu et al. 2006)과 같은 침수저항성 유전자로 하나의 주동유전자에 의해 표현형이 개선될 수 있는 유전자들이다. 저온 및 가뭄 등과 같은 비생물학적 스트레스에 대한 저항성은 복잡한 신호전달 과정과 여러 하위 유전자에 의해 조절되므로, 다수의 대립유전자를 종합적으로 고려하여 육종에 적용하여야 하는 어려움이 있다(Mao et al. 2019).

통일형과 같은 인디카 품종은 저온에 매우 민감하기 때문에, 지난 수십 년 동안 여러 내냉성 신호전달 유전자와 하위 유전자가 분자생물학 연구를 통해 보고되었다. 또한 유전 육종학적 연구를 통해 내냉성을 부여하는 다수의 양적유전자좌(Quantitative Trait Locus, QTL)가 확인되었다(Li et al. 2022). 특히, 유전 육종학과 분자생물학의 융합 연구를 통해 벼 내냉성에 관여하는 LTG1과 COLD1, HAN1 등의 주동 유전자가 밝혀졌다. 이 유전자들은 각각 저온 스트레스에 대한 벼의 내성에 기여하여 저온 조건에서의 종자 발아와 유묘 생존율을 향상시킨다. LTG1와 HYPRP5, SAP16 유전자는 벼의 직접 파종에 필수적인 저온 발아 능력을 향상시키며 유묘기 성장을 촉진하는 중요한 역할을 한다(Lu et al. 2014; Shim et al. 2020; Wang et al. 2018). CTB2는 스테롤 대사를 조절하고(Li et al. 2021), CTB4a는 ATP 공급을 중재하며(Zhang et al. 2017), COLD1은 G-단백질 신호전달을 조절하는 방식으로(Ma et al. 2015) 저온 스트레스에 관여한다. FBK15는 유비퀴틴-프로테아좀 경로를 통해 단백질의 안정성 및 활성을 조절하고(Saito et al. 2010), HAN1은 산화 효소로써 자스몬산 매개 반응을 조절하여 내냉성을 부여한다(Mao et al. 2019). TAF2는 qCTS-9의 프로모터 영역에서 Indel 마커가 확인되었고, 과발현을 통해 내냉성이 향상됨이 밝혀졌다(Zhao et al. 2017). OsLTPL159는 벼의 비특이적 지질 전달 단백질로서 ROS 항상성과 엽록체 안정성 등 여러 세포 과정에 기여하여 내냉성에 영향을 미친다(Zhao et al. 2020). 이 외에도 TCD5 및 bZIP73 같은 내냉성 유전자들이 특성화 되었다. TCD5는 색소체 유래 RNA 중합효소(Plastid-encoded RNA polymerase, PEP)의 subunit과 상호작용하여 저온에서 엽록체를 보호하는 것이 돌연변이를 통해 밝혀졌으며(Sun et al. 2017), bZIP73은 자연적 변이를 통해 추운 지역에서 벼의 적응성을 향상시키는 것으로 확인되었다(Liu et al. 2018).

최근에는 국내 쌀의 안정적인 수급 조절과 국내 거주 외국인을 위한 장립종 인디카 품종 개발 요구가 증가하고 있다. 하지만 인디카 품종은 열대 및 아열대 지역에서 주로 재배되므로, 온대 지역인 국내에서 통일형을 포함한 인디카 품종을 안정적으로 재배하기 위해서는 내냉성 개선이 필수적이다. 보다 효율적으로 통일형 품종의 내냉성을 개선하기 위해서는 새로운 유전자의 기능 구명 연구도 필요하지만, 기존에 보고된 유전자 중 기능이 우수한 대립유전자(allele)의 도입으로 벼 육종의 효율을 높일 필요가 있다. 본 연구에서는 대립유전자 간의 기능이 보고된 11개의 내냉성 유전자를 문헌조사를 통해 확인하고, 벼 3K 유전체 정보를 기반으로 내냉성 유전자의 하프로타입을 분석하였다. 특히, 통일형 11개 품종의 유전체 정보를 활용하여 내냉성 유전자의 하프로타입을 탐색하고, 통일형 품종이 보유하고 있는 대립유전자를 확인하였다.

하프로타입 분석

하프로타입 분석은 bZIP73, OsLTPL159, SAP16 등 11종의 내냉성 관련 유전자를 대상으로 3K Rice Genome Project(3K-RG)의 3,024개 벼 유전체 정보를 이용하여 수행되었으며, Rice Functional Genomics and Breeding(RFGB, https://www.rmbreeding.cn/) 데이터베이스에서 synonymous variations를 포함하여 수행되었다. 하프로타입 분석을 위해 SNP는 다음과 같은 기준으로 필터링되었다: (1) MAF ≥ 0.01; (2) missing data < 0.4. 15개 미만(3,024개의 0.5%)의 샘플을 갖는 하프로타입은 제외되었다. Nonsynonymous variations는 RFGB 데이터베이스와 Rice Annotation Project Database(RAP-DB, https:// rapdb.dna.affrc.go.jp/index.html)의 유전자 서열을 통해 확인되었다. 각 유전자의 SNP 변이를 바탕으로 하프로타입을 구분하였으며, 이를 통해 인디카 품종과 자포니카 표준 품종 간의 하프로타입 차이를 비교 분석하였다.

식물 재료 및 DNA 추출

본 연구에서는 통일형 벼 품종의 전장 유전체 분석을 위해 금강1호, 한아름4호, 다산1호를 포함한 총 11개의 통일형 품종의 기본식물 종자를 사용하였다. 종자는 100% 에탄올에 2분간 처리한 후 NaClO 용액에 2분간 침지하여 소독하였으며, 이후 멸균수를 사용하여 5회 세척하였다. 3일간 멸균수에서 종자를 발아시킨 뒤, 유리온실에서 10일간 생장시켰다. 10일간 생장된 유묘의 잎을 전장 유전체 분석을 위한 시료로 사용하였다. 각 품종의 잎에서 DNA를 추출하기 위해 CTAB 방법을 활용하였다. 잎 시료는 액체 질소로 급속 냉동하여 막자사발로 분쇄한 다음, 65°C에서 35분간 CTAB 버퍼(5 mM Ascorbic acid, 4 mM Diethyl dithiocarbamic acid, 2% CTAB, 1.42 M NaCl, 2% Polyvinyl pyrrolidone, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0)와 반응시켰다. 그 후 페놀:클로로포름:아이소아밀 알코올(25:24:1) 혼합물로 단백질을 제거하고, 이소프로판올로 DNA를 침전시킨 후 70% 에탄올로 세척하여 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA는 멸균수에 용해하여 사용하였다.

NGS 기반 SNP 분석

내냉성 유전자 11종에 대한 SNP 분석을 위해 Next Generation Sequencing(NGS) 기술을 사용하였다. 추출한 게놈 DNA를 Illumina HiSeq 플랫폼을 이용해 시퀀싱하였다. 시퀀싱된 데이터는 품질 평가 후 FASTQ 파일로 정리하였다. 고품질의 시퀀싱 데이터는 Burrows-Wheeler Aligner(BWA)를 사용해 Nipponbare 참조 게놈에 매핑하였으며, 매핑된 bam 파일을Genome NCBI Workbench(NIH, USA) 프로그램을 이용하여 SNP 변이를 탐색하고, 염기서열 위치를 비교하여 하프로타입을 분석하였다.

내냉성 선발 유전자 염색체 정보 및 위치

본 연구에서는 벼 육종 이용성을 고려하여, 유전 육종학 및 분자생물학 연구 방법론을 통해 대립유전자 염기서열 변이에 따른 기능이 명확히 밝혀진 유전자를 선발하였다. 특히, 형질전환체를 이용하여 대립유전자에 따른 내냉성 표현형을 확인한 유전자들을 중심으로 문헌조사를 통해 선발하였다. 이 기준에 따라 LTG1/HBD2와 HYPRP5, CTB2, CTB4a, COLD1, FBK15, TCD5/TSV, SAP16, TAF2/BIP120, bZIP73, OsLTPL159 등 총 11개의 유전자가 선발되었다(Fig. 1, Table 1). 선발된 유전자 중 bZIP73은 돌연변이 연구를 통해 기능이 구명된 유전자이며, 다른 10개 유전자는 QTL 또는 GWAS 연구를 통한 연구와 기능 연구로 보고된 유전자들이었다. 선발된 유전자들은 G-protein signaling(COLD1)과 같은 신호전달과정에서부터 Sterol 3-beta-glucosyltransferase(CTB2)와 같은 지방산 대사효소까지 다양한 기능을 수행하는 것으로 확인되었다.

Figure 1. The location of the cold tolerance-enhancing genes in the rice genome. The rice genome contains 12 chromosomes (2n = 24), and the chromosome numbers are indicated at the top of each bar. Each indicated gene has been reported to be involved in cold tolerance in rice

Table 1 . Summary of the QTLs and associated cold tolerance-enhancing genes in rice.

	QTLOrder	Gene	Gene-encoded product	Reference
1	LTG1	LTG1/HBD2	Casein kinase I	Lu et al.(2014)
2	qLTG3-1	HYPRP5	Protease inhibitor	Shim et al.(2020)
3	qCTB4-1	CTB2	Sterol 3-beta-glucosyltransferase	Li et al.(2021)
4	qCTB4-1	CTB4a	Receptor-like protein kinase	Zhang et al.(2017)
5	COLD1	COLD1	G-protein signaling regulator	Ma et al.(2015)
6	Ctb1	FBK15	F-box and kelch domain-containing protein	Saito et al.(2010)
7	(Mutant)	TCD5/TSV	Monooxygenase	Sun et al.(2017)
8	qLVG7-2	SAP16	C2H2 zinc finger protein	Wang et al.(2018)
9	qCTS-9	TAF2/BIP120	Transcription initiation factor TFIID subunit	Zhao et al.(2017)
10	-	bZIP73	bZIP transcription factor	Liu et al.(2018)
11	qCST10	OsLTPL159	Protease inhibitor	Zhao et al.(2020)

LTG1/HBD2와 HYPRP5, TCD5/TSV, SAP16, OsLTPL159, HAN1 유전자는 각각 2번 염색체와 3번 염색체, 5번 염색체, 7번 염색체, 10번 염색체, 11번 염색체에 위치하였다. 그리고 bZIP73과 TAF2 유전자는 9번 염색체 장완(Long arm)에 위치하였으며, CTB2과 CTB4a, COLD1, FBK15 유전자는 4번 염색체의 장완과 단완(Short arm)에 각각 2개씩 존재하였다. 특히 4번 염색체 단완에 위치한 CTB2과 CTB4a, 그리고 장완에 위치한 COLD1과 FBK15 유전자는 서로 위치가 가까워 내냉성 개선을 위한 육종 과정에서는 유전적 염색체재조환 거리(cM)와 유전적 연관성을 고려하여 두 유전자의 대립유전자를 동시에 활용하는 것이 보다 효율적인 내냉성 형질 개선에 도움이 될 것으로 판단된다.

저온 성장성 조절 LTG1 유전자 하프로타입

자포니카 품종인 Nipponbare를 표준 품종으로한 RAP-DB 염기서열을 바탕으로 3K-RG 프로젝트에서 보고된 3,024개의 벼 유전체 정보를 활용하여 11개 유전자의 하프로타입을 확인하였다. 특히 SNP 염기서열에 따른 아미노산 잔기 변화가 있는 nonsynonymous variation을 주요하게 고려하여 분석하였다. 15개 이하의 품종에서 발견되는 하프로타입은 염색체 염기서열분석의 오류 또는 소수 대립유전자로 판단하여 본 분석에서는 제외하였다.

먼저, 기존 내냉성 증진 유전자로 동정된 LTG1(Low Temperature Growth 1, LOC_Os02g40860)은 2번 염색체에 위치하여 casein kinase I을 암호화하고, 옥신 의존적 과정을 통해 벼의 저온 성장에 영향을 미친다. LTG1의 코딩영역에서 기능적인 뉴클레오티드 다형성이 확인되었으며, 이는 단일 아미노산 치환(I357K)을 유발하고 벼의 생장률, 출수기 및 수확량과 연관되어있다고 보고되었다(Lu et al. 2014). 3K-RG 코딩 영역에서 5개의 nonsynonymous variation과 8개의 synonymous variation이 발견되었으며, 이 염기서열 다양성을 바탕으로 LTG1의 15가지 주요 하프로타입이 식별되었다(Fig. 2). 그러나 Hap14와 Hap15는 2번 엑손의 S32G 변이와 7번 엑손의 564번 염기서열 오류로 인해 발생한 결과로, 이들 하프로타입은 Hap1과 같은 그룹에 속할 수 있을 것으로 판단되었다. Nonsynonymous variation를 기준으로 LTG1의 하프로타입을 분석하였을 때, Lu et al.(2014) 보고와 같이 I357K의 아미노산 변이는 Hap4 그룹에 속하며 222개의 인디카 품종에서 발견되어 중요한 SNP로 판단되었다. 또한 Hap3 그룹에서 발견되는 S32G 변이는 인디카 품종에서 압도적으로 높은 빈도를 보이는 것이 확인되었다. 따라서 대부분 자포니카 품종이 속한 Hap1과 Hap2는 내냉성 향상을 위해 중요할 것으로 예측되며, 육종에서 두 타입의 하프로타입을 도입하기 위해서는 S32G와 I357K로의 아미노산 치환을 유발하는 SNP를 탐색할 수 있는 분자표지를 개발할 필요가 있을 것이다. 추가적으로 Hap8에도 28개 자포니카 품종이 속하므로, M57I의 아미노산 변이에 대한 내냉성 기능도 확인이 필요하다. 국내 내냉성 대표 품종인 Jinbu 등을 포함한 23개의 자포니카 품종이 Hap12에 포함되었으나, 아미노산 변이를 유발하는 nonsynonymous SNP는 발견되지 않아 유전자 기능적인 역할은 Hap1과 동일할 것으로 예측되었다. 하지만 프로모터의 염기서열 변이에 따른 유전자 발현량 차이에 대해서는 추가적인 분석이 필요할 것으로 판단된다.

Figure 2. Coding region haplotype analysis of the LTG1 gene located on chromosome 2. Gray represents synonymous variations, while yellow represents nonsynonymous variations (which alter the amino acid sequence). Nipponbare (standard variety) and Jinbu (domestic cold-tolerant variety) were found to possess Hap1 and Hap12 of the LTG1 gene, respectively

저온 임실율 증진 HYPRP5 유전자 하프로타입

HYPRP5(Hybrid proline- or glycine-rich protein 5, LOC_Os03g01320)는 3번 염색체에 위치하며, 벼의 저온 종자 발아율을 향상시키는 qLTG3-1의 유전자 동정을 통해 확인되었다(Fujino et al. 2008). HYPRP5는 저온에서 bZIP71-bZIP73 heterodimer에 의해 활성화되어 꽃가루에서 꽃밥으로 가용성 당의 전달을 강화함으로써 pollen grain 번식력, 종자 세팅 속도 및 곡물 수확량을 향상시킨다(Liu et al. 2019). HYPRP5는 하나의 엑손으로 이루어진 유전자로, Shim et al.(2020)에 따르면 벼 98개 품종의 염기서열 분석을 통해 3개의 변이와 71 bp가 삭제된 다섯 가지 하프로타입이 존재하는 것을 확인하였으며, 이 하프로타입에 따라 종자 발아율이 차이를 보이는 것으로 밝혀졌다.

본 연구에서는 총 6개의 하프로타입으로 구분되었다(Fig. 3). 이들 하프로타입 중에 자포니카 품종들은 대부분 Hap2, Hap3, Hap6에 속하였다. 약 80%의 자포니카 품종이 Hap2에 속하였으며, S62G 아미노산 변이를 야기하는 2개의 SNP가 인디카와 자포니카 품종에서 중요한 역할을 하는 것으로 판단되었다. 또한, 122개 품종에서 발견된 Hap3과 33개 품종에서 나타난 Hap6도 중요한 SNP로 판단되었다. Hap6에서 확인된 220,116 위치의 염기서열 삭제는 분석의 오류 가능성이 있으므로, S62G과 H17L 아미노산 변이를 유발하는 SNP를 탐색할 수 있는 분자표지를 통해 인디카 품종이 보유하고 있는 HYPRP5 유전자 하프로타입을 자포니카 하프로타입으로 효과적으로 치환할 수 있을 것으로 보인다.

Figure 3. Coding region haplotype analysis of the HYPRP5 gene located on chromosome 3. Gray represents synonymous variations, while yellow represents nonsynonymous variations. Nipponbare (standard variety) and Jinbu (domestic cold-tolerant variety) were found to possess Hap3 and Hap6 of the HYPRP5 gene, respectively

저온 장애형 냉해 개선 CTB2 유전자 하프로타입

CTB2(Cold tolerance at booting stage 2, LOC_Os04g04254)는 4번 염색체에 위치하며, UDP-glucose sterol glucosyltransferase (UDPGT)를 암호화하여 벼의 생식생장기에서 내냉성을 부여한다. 자포니카 54개 품종과 인디카 67개 품종을 이용한 하프로타입 분석을 통해 보존된 UDPGT domain에서의 아미노산 치환(I408V)이 내냉성에 중요한 역할을 한다고 보고되었다(Li et al. 2021). 본 연구에서 3K 품종의 염색체 염기서열을 기반으로 하프로타입을 분석한 결과, 총 31개의 하프로타입으로 구분되었으며, 이는 염기서열 다양성이 높은 유전자로 확인되었다(Fig. 4). 하지만 Hap6에서 나타난 W477L과 P378A 아미노산 변이를 야기한 SNP는 염색체 분석 오류 가능성이 높았다. 기존 보고에서 구명된 I408V 변이는 본 분석에서 탐색되지 않았다. 이러한 오류 가능성에도 불구하고, 자포니카 품종과 인디카 품종간 명확한 차이를 보이는 E108K와 L110I, D118H, S158P, D164H와 같은 5개 아미노산 변이는 내냉성과 연관이 있을 것으로 판단된다. 따라서 3번 엑손을 중심으로 품종 간 내냉성 표현형과 염기서열 변이 연관성을 분석하면 저온 장애형 냉해를 보다 효율적으로 개선해 나갈 수 있을 것이다.

Figure 4. Coding region haplotype analysis of the CTB2 gene located on chromosome 4. Gray represents synonymous variations, while yellow represents nonsynonymous variations. Nipponbare (standard variety) and Jinbu (domestic cold-tolerant variety) were found to possess Hap4 and Hap3 of the CTB2 gene, respectively

저온 등숙성 향상 CTB4a 유전자 하프로타입

CTB4a(Cold tolerance at booting stage 4A, LOC_Os04g04330)는 4번 염색체에 위치하며, ATP 합성효소 beta subunit와 상호작용하는 보존된 leucine-rich repeat receptor-like kinase를 암호화하여 ATP 합성효소 활성과 ATP 함량을 증가시키고, 저온에서 종자 세팅 속도와 수확량을 향상시킨다. CTB4a는 2개의 엑손으로 구성된 약 3.5kbp 길이의 상당히 긴 유전자로, Zhang et al.(2017)에 따르면 9개의 하프로타입이 보고되었으나, 본 연구에서는 15개의 하프로타입으로 구분되었다(Fig. 5). 유전자 염기서열 전체에 걸쳐 5개의 nonsynonymous SNP가 발견되었으며, 자포니카 품종에서 특이적으로 나타난 SNP는 Hap4번과 Hap5, Hap8을 기준으로 A96P와 A1,035T 아미노산 변이를 유발하는 SNP가 중요할 역할을 할 것으로 판단되었다. 이와 함께 A141V 아미노산 변이를 야기하는 SNP도 중요하게 고려되어야 할 것이다.

Figure 5. Coding region haplotype analysis of the CTB4a gene located on chromosome 4. Gray represents synonymous variations, while yellow represents nonsynonymous variations. Nipponbare (standard variety) and Jinbu (domestic cold-tolerant variety) were found to possess Hap4 and Hap5 of the CTB4a gene, respectively

주요 하프로타입인 Hap1, Hap2, Hap3에는 각각 275개, 25개, 2개의 자포니카 품종이 포함되어 있으나, 주로 인디카 품종이 이 하프로타입을 보유하였다. 해당 하프로타입은 공통적으로 염색체 4번의 2,038,140bp 위치에 A를 나타냈으며 Hap4 등의 많은 자포니카 품종들과는 차이를 나타내었다(Fig. 5). 자포니카 표준 품종인 Nipponbare는 Hap4에 속하고 내냉성 대표 품종인 Jinbu는 Hap5를 나타내었으며, 두 품종 모두 A1,035T 아미노산 변이를 야기하는 SNP에서 염기서열 G를 보유한 것으로 확인되었다. 그리고 Zhang et al.(2017)에 따르면, 프로모터 부위를 포함한 하프로타입 분석에서 내냉성이 가장 높은 하프로타입은 2,036,871bp 위치에 S687F 아미노산 변이를 야기하는 염기서열 T를 보유하고 있었다. 이는 내냉성 대표 품종인 Jinbu가 보유한 Hap5가 해당 위치에 염기서열 T를 가진다는 분석과 일치한다. 따라서 벼 육종에서 2,036,871 위치의 C/T 및 2,038,140bp 위치의 G/A 염기서열 변이를 분자표지로 활용하면, 내냉성 품종을 보다 효율적으로 선발 할 수 있을 것으로 판단된다.

저온 신호전달과정 조절 COLD1 유전자 하프로타입

COLD1(Chilling tolerance divergence 1, LOC_Os04g51180)는 4번 염색체에 위치하며, 원형질막과 소포체에서 RGA1과 상호작용하여 Ca²⁺ 채널을 활성화하고 G-protein GTPase 활성을 촉진하여 내냉성을 부여한다. 특히 COLD1의 4번째 exon에서 Lys¹⁸⁷을 나타내는 자포니카 품종과 달리, 단일 염기 변이에 따라 Met¹⁸⁷/Thr¹⁸⁷을 나타내는 인디카 품종에서는 내냉성이 부족함이 보고되었다(Ma et al. 2015). 본 연구에서는COLD1 유전자에서 3개의 nonsynonymous SNP가 확인되었다(Fig. 6). 기존 보고와 같이 Lys¹⁸⁷에서 Met¹⁸⁷/Thr¹⁸⁷로의 아미노산 변이를 야기하는 염기서열이 주요 SNP로 분석되었으며, 특히 Lys¹⁸⁷가 확인된 Hap3과 Hap10에는 주로 자포니카 품종이 포함되었다. 따라서 기존 보고와 같이 K187M의 아미노산 변이가 저온 신호전달과정에 중요한 SNP로 추측되었다. 이와 더불어 Hap3을 제외하면 대부분의 자포니카 품종이 Hap4와 Hap7에서 발견되기 때문에 A322S아미노산 변이도 저온 신호전달과정에서 중요한 역할을 할 것으로 예측된다. 보다 효과적인 분자표지 개발을 위하여 K187M와 A322S 변이에 따른 내냉성 정도 비교분석 연구가 필요할 것이다.

Figure 6. Coding region haplotype analysis of the COLD1 gene located on chromosome 4. Gray represents synonymous variations, while yellow represents nonsynonymous variations. Both Nipponbare (standard variety) and Jinbu (domestic cold-tolerant variety) were found to possess Hap3 of the COLD1 gene, respectively

단백질 분해대사를 통해 내냉성을 향상시키는 FBK15 유전자 하프로타입

FBK15(F-box-type E3 ubiquitin ligase K15, LOC_Os04g52830)는 4번 염색체에 위치하며, F-box 단백질을 암호화하여 저온에서 ubiquitin-proteasome 경로를 통해 내냉성을 부여하는 것으로 보고된 바 있다(Saito et al. 2010). 3K 염색체 정보를 기반으로 한 엑손 영역의 SNP 분석 결과, 4개의 synonymous variation이 발견되었으며, 이를 기반으로 8개의 하프로타입이 식별되었다(Fig. 7). 이 중 Hap2에는 704개의 자포니카 품종이 포함되었으나, synonymous variation은 아미노산의 변이는 발생하지 않으므로 이들 8개의 하프로타입은 기능적으로 동일하다고 할 수 있다. 이 결과는 프로모터 염기서열에 따라 내냉성 하프로타입을 구명한 Guo et al.(2020)의 연구 결과와 일치한다. 즉, FBK15 유전자는 SNP 변화에 따른 기능적 차이보다는 프로모터 부위의 변이에 의한 유전자 발현량에 따라 내냉성의 정도가 달라진다고 할 수 있다. 따라서 FBK15유전자의 기능을 명확히 규명하기 위해서는 프로모터 -2,000bp 구간을 추가적으로 분석하여 하프로타입을 구분하는 것이 필요할 것이다.

Figure 7. Coding region haplotype analysis of the FBK15 gene located on chromosome 4. Gray represents synonymous variations. Both Nipponbare (standard variety) and Jinbu (domestic cold-tolerant variety) were found to possess Hap1 of the FBK15 gene

엽록소 대사를 통한 내냉성 증진 TCD5 유전자 하프로타입

TCD5(Thermo-sensitive chloroplast development 5, LOC_Os05g34040)는 5번 염색체에 위치하는 색소체 산화환원효소로, 돌연변이를 통해 저온에서 벼의 엽록체를 보호하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. TCD5는 PEP의 하위 단위인 OsTrxZ를 안정화시켜 정상적인 엽록체 발달과 엽록소 합성을 보장하는 방식으로 저온에 대한 내성을 부여한다(Sun et al. 2017). TCD5 하프로타입은 4개의 nonsynonymous variation과 2개의 synonymous variation에 의해 네 가지로 구분되었다(Fig. 8). 대부분의 인디카 품종은 Hap1에, 자포니카 품종은 Hap2와 Hap3 하프로타입에 포함되었다. Hap4는 소수의 인디카 품종과 대부분의 남아시아에서 재배되는 Oryza sativa indica var. Aus 품종이 포함되었다. Hap2와 Hap3 하프로타입을 탐색하기 위해서는 P593T 또는 S620A를 유도하는 DNA 염기서열 변이를 탐색하여 Hap1과 구분한 후 A169D 또는 I613V을 탐지할 수 있는 분자표지를 이용한다면 하프로타입을 명확하게 구분할 수 있을 것이다. 또한 Nipponbare와 Jinbu는 모두 Hap 2에 속함이 확인되었다. 아직 TCD5의 하프로타입에 따른 내냉성 정도에 대한 명확한 기능 연구는 부족하지만, 대부분의 인디카 품종이 Hap1에 포함된다는 점에서 분자 표지 개발 및 활용에 활용하는 데는 큰 문제가 없을 것으로 판단된다.

Figure 8. Coding region haplotype analysis of the TCD5 gene located on chromosome 5. Gray represents synonymous variations, while yellow represents nonsynonymous variations. Both Nipponbare (standard variety) and Jinbu (domestic cold-tolerant variety) were found to possess Hap2 of the TCD5 gene

저온 발아율 증진 유전자 SAP16 하프로타입

SAP16(Stress associated protein gene 16, LOC_Os07g38240)는 7번 염색체에 위치하며 zinc-finger domain protein을 암호화한다. SAP16이 어떤 방식으로 저온 발아를 조절하는지는 아직 보고되지 않았지만, SAP16의 기능 상실은 저온에서 발아를 감소시키는 반면 발현 증대는 높은 발아율을 나타내는 것이 확인되었으며, 발현 수준에 따라 저온 발아율을 조절하는 유전자임이 보고되었다(Wang et al. 2018). 본 연구에서는 코딩 영역의 2개의 nonsynonymous variation과 2개의 synonymous variation에 의해 결정된 5개의 주요 하프로타입이 식별되었다(Fig. 9). Hap5는 50개의 품종이 속하지만, 염색체 염기서열 분석의 오류에 의하여 구분되는 하프로타입일 가능성이 높아 제외하였다. SAP16의 하프로타입은 벼 아종에 의해 명확하게 분포되지 않는 특성을 나타내었다. 하지만 두개의 nonsynonymous variation을 기준으로 Hap1과 Hap2으로 집단화할 수 있으며, Nipponbare와 Jinbu 품종이 Hap1과 Hap4에 각각 포함되어 기능적으로는 Hap1과 동일하다고 말할 수 있을 것이다(Table 2). SAP16 유전자가 동정 되었으나, 하프로타입에 따른 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단되었다.

Figure 9. Coding region haplotype analysis of the SAP16 gene located on chromosome 7. Gray represents synonymous variations, while yellow represents nonsynonymous variations. Nipponbare (standard variety) and Jinbu (domestic cold-tolerant variety) were found to possess Hap1 and Hap4 of the SAP16 gene, respectively

Table 2 . Haplotype analysis of the cold tolerance-enhancing genes in Tongil-type varieties.

Gene	Ref	Jinbu	TI	MY23	NC	SG	DS	DS1	HAR	HAR2	HAR4	KG	KG1
LTG1	Hap1	Hap12	Hap1	Hap4	Hap4	Hap4	Hap4	Hap4	Hap4	Hap4	Hap4	Hap4	Hap4
HYPRP5	Hap3	Hap6	Hap4	Hap3	Hap3	Hap1	Hap3	Hap2	Hap2	Hap2	Hap3	Hap3	Hap2
CTB2	Hap4	Hap3	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1
CTB4a	Hap4	Hap5	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1
COLD1	Hap3	Hap3	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1
FBK15	Hap1	Hap1	Hap4	Hap2	Hap2	Hap2	Hap2	Hap2	Hap2	Hap2	Hap2	Hap2	Hap2
TCD5	Hap2	Hap2	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap2	Hap2	Hap2
SAP16	Hap1	Hap4	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap2	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1
TAF2	Hap2	Hap2	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1
bZIP73	Hap2	Hap2	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1
OsLTPL159	Hap2	Hap2	Hap2	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1	Hap1

생육초기 저온 신장성 증진 유전자 TAF2 하프로타입

TAF2(Transcription initiation factor TFIID subunit 2, LOC_ Os09g24440)는 벼의 내냉성과 관련된 주요 유전자 중 하나로, 특히 qCTS-9라는 QTL에 위치해 있다. TAF2 유전자의 프로모터 영역에서 발견된 다수의 SNP와 Indel(삽입 및 결실) 변이가 내냉성에 중요한 역할을 한다고 보고되었다. 특히 5개의 SNP와 1개의 Indel 변이가 RIL(재조합 근친 교배 계통) 집단에서 내냉성과 유의한 연관성을 갖는 것으로 확인되었다. 이러한 변이들은 TAF2의 유전자 발현을 조절하여 내냉성 향상에 기여하는 것으로 보고되었다(Zhao et al. 2017). 본 연구의 유전자 엑손을 기반으로 한 하프로타입 분석에서 2개의 nonsynonymous variation과 1개의 synonymous variation이 탐색되었고, 이를 바탕으로 6개의 주요 하프로타입이 존재하는 것으로 분석되었다(Fig. 10). Nipponbare와 Jinbu을 포함한 829개의 자포니카 모두 Hap 2를 보유하고 있는 것으로 나타났다. 각 하프로타입의 분포를 살펴보면, GJ 집단에서 Hap 2가 압도적으로 많은 것으로 나타났다. I1,471T 변이를 가진 Hap3은 대부분의 Aus 품종과 일부 XI 집단에서 확인되었다. Hap4와 Hap5, Hap6는 염색체 분석의 오류로 판단되어 실질적인 TAF2 유전자의 하프로타입은 3개로 고려되었다. 추후 분자표지 개발은 이들 3개의 SNP와 더불어 프로모터 부위 변이를 동시에 고려하여 개발한다면, 벼 내냉성 개선을 위한 분자육종에 보다 효율적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Figure 10. Coding region haplotype analysis of the TAF2 gene located on chromosome 9. Gray represents synonymous variations, while yellow represents nonsynonymous variations. Both Nipponbare (standard variety) and Jinbu (domestic cold-tolerant variety) were found to possess Hap2 of the TAF2 gene

저온 임실율 개선 유전자 bZIP73 하프로타입

bZIP73(bZIP transcription factor 73, LOC_Os09g29820)은 주로 벼의 생식기 동안의 저온 환경에서 수분 수송 및 꽃가루의 생존성을 개선하는 전사인자로 bZIP71과 이합체를 형성하는 것으로 알려져 있다. 특히bZIP73과 bZIP71을 동시에 과발현시킨 벼 변형체는 자연 저온 스트레스 하에서 종자 결실률과 수확량이 크게 증가되었다. bZIP73은 qLTG3-1과 상호작용하여 저온에 의해 유도된 당 분포를 개선하고, 수분 생존력을 증가시킨다. 유전자원을 이용한 하프로타입에 따른 내냉성 개선 연구는 없으나 자포니카 품종인 Zhonghua 11(ZH11)와 인디카 품종인 Kasalath을 이용한 과발현형질전환 연구를 통해 명확하게 아종 간 기능 차이가 있는 것으로 보고되었다(Liu et al. 2019). bZIP73 은 하나의 엑손으로 구성된 유전자로, 본 연구에서 bZIP73의 하프로타입을 분석한 결과 2개의 nonsynonymous variation 에 의해 네 가지 하프로타입이 식별되었다(Fig. 11). Nipponbare와 Jinbu등 내냉성이 상대적으로 강한 자포니카 품종은 대부분 Hap2에 포함되었다. 기능적 차이는 아직 구명되지 않았지만, Hap4도 자포니카 특이적 하프로타입이라 판단되었다. 내냉성 증진을 위한 분자표지 개발을 위해서는 E171K 위치의 SNP변이와 I173N 위치의 SNP변이를 이용할 수 있으나, 자포니카 품종에서 특이적으로 나타나는 E171K 위치의 SNP변이를 활용한다면 인디카 품종과 구분을 할 수 있을 것으로 판단된다.

Figure 11. Coding region haplotype analysis of the bZIP73 gene located on chromosome 9. Yellow represents nonsynonymous variations. Both Nipponbare (standard variety) and Jinbu (domestic cold-tolerant variety) were found to possess Hap2 of the bZIP73 gene

지질 세포막 안정화를 통한 저온 발아율 개선 유전자 OsLTPL159 하프로타입

OsLTPL159(Nonspecific lipid transfer protein 2.11, LOC_Os10g36160)는 벼의 저온 내냉성 증진에 중요한 역할을 하는 지질전달 단백질(LTP)을 암호화하는 유전자로, 저온 스트레스에 직면했을 때 세포막의 유동성을 유지하고, 세포막 손상을 방지함으로써 벼 저온 발아율을 높이는 것으로 보고되었다(Zhao et al. 2020). 인디카와 자포니카 OsLTPL159 유전자의 염기서열을 분석하였을 때, 24개의 SNP와 15bp의 InDel이 발견되었으나, 22개의 자포니카 품종 내에서는 변이가 관찰되지 않은 것으로 보고되었다(Zhao et al. 2020). 하지만 3K 유전체 정보를 바탕으로 한 본 연구에서는 자포니카의 대부분 품종은 Hap1과 Hap2, 그리고 Hap3에 분포되었으며, 8개 품종이 Hap4 대립유전형을 보유한 것으로 분석되었다(Fig. 12). 이 중에서 Nipponbare와 Jinbu 등 544개의 자포니카 품종이 특이적으로 Hap2 유전형을 보유한 것으로 판단되었다. OsLTPL159는 하나의 엑손으로 구성된 유전자로 Hap2가 특이적으로 보유하고 있는 V7A와 D28N의 SNP변이가 주요 기능적 차이를 설명할 수 있는 가능성이 높을 것으로 추측된다. Hap2의 OsLTPL159 대립유전자 도입을 위하여 이들 SNP 변이를 활용한다면 효율적으로 저온 발아성을 개선할 수 있을 것으로 판단된다.

Figure 12. Coding region haplotype analysis of the OsLTPL159 gene located on chromosome 10. Gray represents synonymous variations, while yellow represents nonsynonymous variations. Both Nipponbare (standard variety) and Jinbu (domestic cold-tolerant variety) were found to possess Hap2 of the OsLTPL159 gene

통일형 품종이 보유한 내냉성 유전자 11종의 하프로타입 분석

통일형 품종 전장 유전체 정보를 바탕으로 11종의 내냉성 유전자에 대한 하프로타입을 분석하였다(Table 2). LTG1 유전자의 경우, 자포니카 표준 품종인 Nipponbare는 Hap1, 내냉성 품종인 Jinbu는 Hap12 하프로타입을 보유한 반면, 통일벼를 제외한 10개 통일형 품종은 모두 Hap4를 보유하고 있었다. 그러나 통일벼는 Nipponbare와 동일하게 Hap1을 보유하였다. HYPRP5는 밀양23호 남천을 포함한 5개 통일형 품종이 Nipponbare과 동일한 Hap 3의 하프로타입을 보유하고 있었다. TCD5 는 금강과 금강이 유전적 배경인 한아름4호와 금강1호가 Nipponbare 및 Jinbu와 동일한 Hap2를 나타내었다. SAP16은 다산 1호를 제외한 모든 통일형 품종이 Nipponbare와 같은 Hap1에 속하였으나, 내냉성 품종인 Jinbu의 하프로타입인 Hap4와는 구별되었다. OsLTPL159은 통일벼만이 Nipponbare와 동일한 Hap2를 보유하고 있어 다른 통일형 품종과 차이를 나타냈다.

통일형 품종이 인디카 품종의 내냉성이 일부 개선된 것으로 보고되었으나, 기존 보고된 11종의 유전자 하프로타입을 분석하였을 때 다산1호는 Nipponbare와 동일한 하프로타입이 하나도 존재하지 않았으며, Nipponbare와 동일한 하프로타입을 가장 많이 보유한 품종은 통일과 금강으로, 이들은 내냉성 대립유전자를 각각 3종씩 보유하고 있었다. 다수의 통일형 품종이 Nipponbare와 동일한 하프로타입을 가진 SAP16 유전자를 포함하여, 통일은 LTG1과 OsLTPL159 유전자, 금강은 HYPRP5와 TCD5 유전자가 Nipponbare와 같은 하프로타입으로 분석되었다. 또한 내냉성 대비 품종인 Jinbu가 보유하고 있는 유전자 중 HYPRP5와 CTB2 등을 포함한 다섯 가지는 염기서열 표준 품종인 Nipponbare와 비교하여 명확히 다른 대립유전자를 보유하고 있는 것으로 확인되었다. 따라서 앞으로 통일형 품종의 내냉성 개선을 위해서는 일반적인 자포니카 품종이 보유한 하프로타입의 도입과 더불어 내냉성 대비 품종인 Jinbu가 보유한 하프로타입에 대한 연구를 통해, 보다 안정적인 내냉성 향상이 필요할 것으로 판단된다.

초다수성 통일형 품종의 내냉성을 증진하기 위해, 내냉성 유전자로 보고된 11종의 유전자에 대한 하프로타입을 분석하고 통일형 품종 11점의 유전형을 검정하였다. 검정된 통일형 품종의 하프로타입은 자포니카 표준 품종인 Nipponbare 및 국내 내냉성 품종인 Jinbu와 비교 분석 하였다. 통일형 품종은 HYPRP5, TCD5 및 SAP16을 제외한 대부분의 내냉성 유전자에서 주로 인디카 품종이 보유한 하프로타입을 보유하고 있어, 자포니카 품종인 Nipponbare 및 Jinbu와 상이한 결과를 나타냈다. 통일형 품종이 기존 인디카 품종보다 내냉성이 개선된 것으로 보고되었으나, 보다 안정적인 내냉성 개선을 위해서는 하프로타입 정보를 바탕으로 분자표지를 활용하여 저항성 유전자에 대한 대립유전자를 도입할 필요가 있을 것이다.

본 연구는 농촌진흥청 연구사업(세부과제명: 영남지역벼 재배 안정성 향상을 위한 저항성 육종 소재 개발, 세부과제번호: PJ014774052024)과 2024년도 농촌진흥청(국립식량과학원) 전문연구원 과정 지원사업에 의해 이루어진 것임.