유전자변형(living modified, LM) 작물의 개발은 과학기술의 발전과 함께 빠르게 발달해왔으며, 해충 저항성, 제초제 내성, 환경스트레스 저항성, 영양 강화 등 다양한 형질의 LM작물이 개발되었다. 이는 인구 급증에 따른 식량안보 및 경작의 용이성, 농업의 기후변화 대응 및 지속 가능성 등을 향상시키는데 중요한 역할을 하고 있다(Kumar et al. 2020; Oliver 2014). 2023년 세계적으로 재배된 LM 작물의 총 면적은 약 2억 6백만 헥타르에 달하며, 재배면적이 가장 큰LM 작물은 대두로 48.9%를 차지하고 있으며, LM옥수수 33.6%, LM면화 11.7%, LM카놀라 5.0% 순으로 재배되고 있다(AgbioInvestor GM Monitor 2024). 그러나 LM작물의 상업화를 위해서는 식품 및 환경 안전을 보장하기 위하여 개발사는 분자생물학적 특성평가, 독성 및 알레르기성 평가, 영양학적 평가, 환경 영향

평가 등 국가별 규제 당국이 요구하는 안전성 데이터를 제출하여야 하며, 각국의 규제 기관은 이에 대한 검토와 평가를 거쳐 승인을 하고 있다(Codex 2003; EFSA 2011; FAO/WHO 2000; Lim et al. 2023; LMO Act 2018). 또한 세계 각국의 규제 당국은 LMO(Living Modified Organism) 산물에 대한 표시 기준을 정하고 규제를 시행하고 있다. 우리나라는 식품과 사료에 3% 이상, 유럽연합은 식품과 사료에 0.9% 이상, 일본은 5% 이상인 경우 LM 표시제를 의무화하고 있다. 이는 소비자에게 명확한 정보를 제공하여 알 권리를 보장하고 시장의 투명성을 높일 수 있다. 또한 국제 무역의 일관성을 유지하고, 국가 간의 규제 충돌을 최소화하는데 중요한 역할을 한다.

우리나라는 ‘유전자변형생물체의 국가간 이동 등에 관한 법률(LMO법)’에 따라 농림축산업용 LM생물체를 연구 개발 및 이용함에 있어서 안전성 확보에 필요한 사항을 정하여 시행하고 있다(LMO Act 2018). 국내 수입을 위한 식용 및 사료용 LM작물은 식품안전성과 환경위해성 평가를 위한 시험보고서에 대해 정부 관계부처의 엄격한 심사과정을 거쳐야 한다. 또한 LM작물 개발사들은 국내 수입 승인을 받기 위해서 ⸢LMO법 통합고시⸥ 제 3-1조에 따라 검정 방법 심사에 필요한 심사 자료와 표준시료(LM, non-LM)를 제출하여야 한다. LM 표준시료의 검정 방법은 정성 검사와 정량 검사로 이루어지며, 국내외 LM 작물의 이동시 필수적으로 수행되어야 하는 법정의무이다. 현재 국내에 수입이 승인된 LM 작물 이벤트는 옥수수(Zea Mays L.) 89, 콩(Glycin Max L.) 30, 면화 (Gossypium hirsutum) 30, 카놀라(Brassica napus) 15, 알파파(Medicago sativa) 5, 감자(Solanum tuberosum L.) 8, 사탕수수(Beta vulgaris) 1개로 총 178 건이 있다(KBCH 2024). 또한 현재 매년 1천만톤의 농림축산용 LM작물이 국내로 수입되고 있으며, 용도별로 약 939만 톤(85%)이 동물사료용으로 사용되며, 약 165.3만 톤(15%)이 대부분 식용, 사료용 및 가공용으로 동시에 사용할 수 있도록 개발되었으며, 이중 옥수수가 90%를 차지하는 것으로 보고되었다(KBCH 2024).

LM 작물의 혼입율 검정은 핵산 분석에 기반한 일반 정성PCR과 실시간 정량적 PCR(RT-qPCR)이 일반적으로 사용된다(Hübner et al. 2001; International Standard 2013a, 2013b). RT-qPCR를 통한 정량 분석방법은 시료의 LM이벤트 특이적 염기서열과 내재참조유전자(endogenous reference gene) 의 표준정량곡선을 필요로 한다. 표준정량 곡선은RT-qPCR 증폭 곡선의 지수 성장 단계(log exponential phase) 동안 임계 값의 사이클 수(Ct값)와 DNA 카피(copy)수를 이용하여 형성하며, 형광 프로브(probe) 방법이DNA형광 삽입 방법보다 목적(target) 검출 염기서열에 대한 특이성이 높기 때문에 더 바람직하다고 할 수 있다(ENGL 2015; International Standard 2013b). 이벤트를 특이적으로 검출하는 기법(이벤트 특이 검정)은 주로 도입유전자와 숙주 게놈 염기서열의 경계(junction) 부분을 검출할 수 있는 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머(primer) 쌍과 프로브를 이용하여 수행된다. 내재참조유전자로는 일반적으로 분류군(taxon) 특이적이며, 가능하면 반수체(haploid)에서 단일 카피 또는 적은 카피수를 보유하고, 품종 간 유전자 서열의 변이 및 카피수 변동이 없는 유전자를 사용하는 것이 바람직하다(ENGL 2015). 이러한 이유로 작물의 다양한 품종에서 사용할 수 있는 내재참조유전자를 개발하고 검증하는 연구가 진행되었다. RT-qPCR 분석법으로 주요 작물인 옥수수, 벼, 밀, 콩 등에서 여러 내재참조유전자에 대한 프라이머 및 프로브 비율 조절 등을 통하여 정밀성과 정확성 평가를 위한 연구가 수행되었다(Huang et al. 2013; Papazova et al. 2010; Venturelli et al. 2014; Xijuie et al. 2019).

최근에는 LM 작물의 검출 방법으로 신기술인 digital PCR(dPCR)을 적용하는 연구가 활발하게 진행되고 있다(Iwobi et al. 2016; Köppel et al. 2015; Pecoraro et al. 2019). dPCR은 일반 PCR과 달리 PCR 반응액을 수천 개의 오일방울(droplet)이나 마이크로챔버(microchamber)로 분리하여 독립적인 PCR 반응을 수행하는 기술로써, 현재 오일방울을 이용하는 droplet digital PCR(ddPCR)과 마이크로챔버를 이용하는 chamber digital PCR(cdPCR) 기술로 사용되고 있다. 이 분석 방법은 오일방울 또는 마이크로챔버에서 목적(target) 유전자의 증폭 여부에 따라 ‘양’(1)과 ‘음’(0)으로 디지털 시그널로 받아들여 계수하고, 푸아송 분포(Poisson distribution)를 통해 반응액에 존재하는 목적 유전자의 카피수를 정량 할 수 있다(Dong et al. 2015; Liu et al. 2003; Vogelstein and Kinzler 1999).

dPCR은 별도의 표준정량곡선을 작성할 필요가 없으며, qRT-PCR에 비하여 PCR반응 효율성의 영향이 적은 것으로 보고되었다. 또한 높은 민감성으로 낮은 DNA농도를 검출할 수 있어 정량 분석에 중요한 도구로 활용될 것이라 전망되고 있다(Bharuthram et al. 2014; Deng et al. 2019; Paternò et al. 2018; Wu et al. 2017). 이러한 장점으로 LM 작물에서 dPCR을 이용한 정량 분석 방법을 검증한 여러 연구가 보고되었다. Long 등(2022)은 듀플렉스 ddPCR을 이용하여5개의 주요 LM 콩 이벤트의 동적 범위(dynamic range) 및 최소검출한계, 최소정량한계를 측정하여 검증하였으며, LM 혼입율 0.1%까지 정확하게 정량 가능함을 보고하였다. Xu 등(2016)은 LM 옥수수의 zygosity ratio을 결정하는데 qRT-PCR과 ddPCR 방법을 비교한 결과, ddPCR이 절대 정량화 특성으로 qRT-PCR 보다 더 편리함을 보고하였다. dPCR방법을 이용한 LM 작물의 정량 분석 연구가 증가함에 따라 EURL GMFF(유전자변형식품 및 사료에 관한 유럽연합 참조연구소)는 dPCR 분석 방법 확립에 필요한 검증 요소 등에 대한 가이드라인을 제시하였다(Gatto et al. 2023).

본 연구는 국내 수입이 승인된LM콩 8개 이벤트와 LM 옥수수 12개 이벤트에서 개발사가 정량 검정을 위하여 사용한 분류군별 특이적 내재참조유전자 특성을cdPCR과 RT-qPCR 방법으로 분석하였다. 본 연구의 목적은 콩과 옥수수 분류군별 보편적으로 사용할 수 있는 내재참조유전자를 검증하여 분석 비용 및 시간을 절약하는 등LMO 검정 방법의 효율성을 높이고자 하였다. 콩의 내재참조유전자 검정은 Lectin유전자(Le1, XM_028337035) 염기서열의 각각 다른 부분을 검출할 수 있는 Le1-A와 Le1-B 검정을 사용하였으며, LM옥수수의 경우 High Mobility Group a (HMG, AJ131373.1)와 Alcohol Dehydrogenase 1 (ADH1, NM_00111939.2), Fructose-bisphosphate Aldolase (ALD, accession NC_050103) 유전자의 염기서열을 검출할 수 있는 HMG, ADH1, ALD 검정을 수행하였다. 내재참조유전자 검정의 적합성은 콩 또는 옥수수만 고유하게 식별하는 분류군 특이성을 보이는지, 그리고 검출하고자 하는 목적(target) 염기서열의 카피수와 표준정량곡선의 기울기(slope), 효율성(efficiency), 상관계수(R²)에 대한 허용범위 수준의 부합 여부로 평가하였다.

식물 재료 및 genomic DNA 순수 정제

종자 상태의 LM 이벤트 표준시료와 국내 콩 4 품종(광안, 소청자, 선풍, 풍원)과 옥수수 3 품종(흑미찰, 일미찰, 강일옥)의 알곡 시료는 막자 사발에 액체질소를 넣어 분말화하였다. Maxwell RSC PureFood GMO and authentication kit (Promega, USA) 실험방법으로 DNA를 분리 및 정제하였다. DNA의 순도와 정량은 Nano-drop One (Thermo Scientific, USA)으로 확인하였으며, Qubit 4 Fluorometer (Thermo Scientific, USA)으로 정확한 두가닥 DNA를 정량 한 후 RT-qPCR과 cdPCR 실험의 주형으로 사용하였다.

내재 유전자 및 이벤트 특이적 프라이머 및 프로브 제작

본 연구의 프라이머 및 프로브 염기서열은 LM 작물 개발사가 제출한LM 이벤트 표준시료의 정량 검정 시험 방법을 사용하였다. 내재참조유전자 검정에 대한 프라이머 및 프로브 염기서열과 증폭 산물 크기에 대한 정보는 Table 1에 제시하였으며, LM이벤트 특이적 검정에 대한 정보는 Table 2에 나타내었다. 본 연구에 사용된 프라이머 및 프로브의 염기서열은 바이오니아(Bioneer, South Korea)에 의뢰하여 제작하였다.

Table 1 . Primers and probes used in this study for endogenous genes.

Crop	Target gene	Assay	Lengtha (bp)	Primer/probe sequence (5ʹ-3ʹ)	Reference
Soybean	Lectin	Le1-A	74	F- CCA GCT TCG CCG CTT CCT TC. R- GAA GGC AAG CCC ATC TGC AAG CC. P- (6-FAM)-CTT CAC CTT CTA TGC CCC TGA CAC-(TAMRA).	MON87701,. MON94313,. DAS-44406-6,. SYHT0H2,. A5547-127.
		Le1-B	102	F- CTT TCT CGC ACC AAT TGA CA. R- TCA AAC TCA ACA GCG ACG AC. P- (VIC)-CCA CAA ACA CAT GCA GGT TAT CTT GG-(TAMRA).	FG72,. A2704-12,. GMB151.
Maize	HMG	HMG	79	F-TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCT GA. R-GCT ACA TAG GGA GCC TTG TCC T. P-(6-FAM)-CAA TCC ACA CAA ACG C-(MGB).	DP915635-4,. DP052291-2,. DP910521-2,. MON95275,. MON94804,. MON95379,. DAS01131-3,. DAS40278-9.
	ADH1	ADH1	135	F-CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC. R-CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC. P-(VIC)-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-(TAMRA).	MZIR098,. MZHGOJG. 5307.
	ALD	ALD	69	F-AGG GAG GAC GCC TCC CT. R-ACC CTG TAC CAG AAG ACC AAG G. P-(6-FAM)-TGA GGA CAT CAA CAA AAG GCTTGC CA-(TAMRA).	VCO-Ø1981-5

^aLength denotes the length of the amplicon in base pairs. In the primer/probe sequence, “F,” “R,” and “P” represent forward, reverse, and probe, respectively..

Table 2 . Primers and probes used in this study for LM event-specific sites.

Crop	Event name	Primer/probe sequence (5ʹ-3ʹ)	Lengtha (bp)
Soybean	MON87701	F- CGT TTC CCG CCT TCA GTT TAA A. R- TGG TGA TAT GAA GAT ACA TGC TTA GCA T. P- (FAM)- TCA GTG TTT GAC ACA CAC ACT AAG CGT GCC- (TAMRA).	150
	MON94313	F- GCT TTA ATC CAT CGT CCC TTA GTC. R- GGC CTA ACT TTT GGT GTG ATG AT. P- (FAM)- CTG ACT GGC TAC AAG AC - (MGBNFQ).	165
	DAS-44406-6	F- TTA TTG TTC TTG TTG TTT CCT CTT TAG G. R- CCT CAA TTG CGA GCT TTC TAA TTT. P- (FAM)- ATT CGGACC TCC ATG ATG ACC TTA CCG TT - (TAMRA).	145
	SYHT0H2	F- GGG AAT TGG GTA CCA TGC C. R- TGT GTG CCA TTG GTT TAG GGT. P- (FAM)- CCA GCA TGG CCG TAT CCG CAA - (BHQ).	140
	A554-127	F- GCT ATT TGG TGG CAT TTT TCC A. R- CAC TGC GGC CAA CTT ACT TCT. P- (FAM)- CCG CAA TGT CAT ACC GTC ATC GTT GT - (TAMRA).	150
	FG72	F- AGA TTT GAT CGG GCT GCA GG. R- GCA CGT ATT GAT GAC CGC ATT A. P- (FAM)- AAT GTG GTT CAT CCG TCT T - (MGB).	115
	A2704-12	F- GCA AAA AAG CGG TTA GCT CCT. R- ATT CAG GCT GCG CAA CTG TT. P- (FAM)- CGG TCC TCC GAT CGC CCT TCC - (TAMRA).	64
	GMB151	F- TCA AAT CAA CAT GGG TGA CTA GAA A. R- CAT TGT GCT GAA TAG GTT TAT AGC TAT GAT. P- (FAM)- CAG TAC TGG GCC CTT GTG GCG CT - (BHQ1).	143
Maize	BP-CV127-9	F- AAC AGA AGT TTC CGT TGA GCT TTA AGA C. R- CAT TCG TAG CTC GGA TCG TGT AC. P- (FAM)- TTT GGG GAA GCT GTC CCA TGC CC - (TAMRA).	116
	DP915635-4	F- GCA TCT AGG ACC GAC TAG CTA ACT AAC. R- CTT TGC ATC ATG TCT TGA ACA ATG. P- (FAM)- CGC CAT GAG GAG CAA - (MGB).	150
	DP051291-2	F- CGC AAT GTG TTA TTA AGT TGT CTA AGC. R- CAC GGT TAG CTG TAC CAA ATG C. P- (FAM)- TTT GTT TAC ACC ACA TAC ACG - (MGBNFQ).	150
	MON95275	F- GCG CAT GAA GTT TCA GGT CTG T. R- GTC GCT ACC TTA GGA CCG TTA TAG TT. P- (FAM)- CAG CCG GCC CGA TCA AAC ACT G - (TAMRA).	150
	MON94804	F- CTC TTC TAA TCC GGG CCA TCG. R- AGT TAG TCG CGC CAA ATC GTG. P- (FAM)- CTG GAT CCG AAG GAC GTG TCT ACA TTC AC - (TAMRA).	139
	MON95379	F- CCA AGA AGA ACG ATT GGC AAA C. R- GGC ACA GGC ACG CCT CTG. P- (FAM)- ATG GGT ATT ATG GGT AGG CAC ATG GGA ATA TAG - (TAMRA).	112
	DAS01131-3	F- CTA AGA GCT AAG ATT GCG CGG. R- TTC GGG CCT AAC TTT TGG TG. P- (FAM)- ACA TAT TTT TTG AGG ATA ACA GCA - (MGB).	150
	DAS40278-9	F- CAC GAA CCA TTG AGT TAC AAT C. R- TGG TTC ATT GTA TTC TGG CTT TG. P- (FAM)- AGC TAA CCT TCA TTG TAT TCC G - (TAMRA).	144
	VCO-Ø981-5	F- CCA CTA AAC GTC ACC AAG AAG A. R- GCC GCT ACT CGA GGG ATT TA. P- (FAM)- CAG TAC TCA AAC ACT GAT AG - (MGB).	151
	MZIR098	F- ATC TCA GAC ACC AAA CCG AGA TC. R- ACA CCG TTA GGC TAG TGC CAG T. P- (FAM)- CAA GTG ACA GCG AAC GGA GCT GGT TT - (BHQ1).	147
	MZHGOJG	F- CAA CTA GCT AGA TTA ATT AAC GCA ATC TG. R- ATT TGT TTG CAA GGT GTG GGA. P- (FAM)- TTA AGT TGT CTA AGC GTC AAT TTG - (BHQ1plus).	154
	5307	F- CAT GGC CGT ATC CGC AAT GTG. R- TGC ACC CTT TGC CAG TGG. P- (FAM)- ACC ACA ATA TAC CCT CTT CCC TGG GCC AG - (TAMRA).	149

^aLength denotes the length of the amplicon in base pairs. In the primer/probe sequence, “F,” “R,” and “P” represent forward, reverse, and probe, respectively..

정성 PCR 반응

일반 PCR은 Kang 등(2021)의 방법을 약간 변형하여 수행하였다. 시료당 총 반응액은 20 µl으로 하여, 50-100 ng의 genomic DNA, 2X Safe dry Multiplex PCR premix (CellSafe, South Korea), 10 pM의 프라이머 쌍(정방향, 역방향) 용액을 첨가하여 수행하였다. PCR 반응 조건은 95°C에서 5분간 실시한 후, 95°C 30초, 63°C 30초, 72°C 20초를 총 30 cycle 반복하였으며, 마지막 단계로 72°C에서 5분간 신장(extension)하였다(SimpliAmp Therma Cycler, Applied Biosystems, USA, MA). PCR 산물은 2.5% agarose gel상에서 전기영동하고, 이미지 분석장치(Davinch Gel MC2000, Davinch-K Co., Ltd, South Korea)를 이용하여 확인 한 후, 4채널 자동 모세관 전기영동장치 Qsep 400(BiOptic Inc, Taiwan)의 gel view와 Electropherogram(peck)으로 PCR 산물의 정확한 크기를 확인하였다.

chamber digital PCR 반응

듀플렉스(duplex) cdPCR를 이용하여 두개의 내재참조유전자 검정 또는 LM 이벤트 특이적 검정과 내재참조유전자 검정을 동시에 수행하였다. cdPCR은 미세유체역학 어레이 플레이트(MAP)를 이용하는 Quantstudio Absolute Q™ digital PCR system (Applied Biosystems by Thermos fisher)으로 수행하였으며, 반응액 및 cdPCR 조건은 제조사의 매뉴얼을 참고하여 확립하였다. cdPCR 반응액은 총 10 µl로 하고, 2 µl Absolute Q™ DNA digital PCR Master Mix (5X), 5 µl DNA, 10 pM 의 프라이머 쌍의 혼합액 0.9 µl (최종 900 nM), 10 pM probe 0.25 µl (최종 250 nM), 1.85 µl 멸균 증류수를 혼합하였다. 반응액에서의DNA 양은 콩의 경우 2 ng을, 옥수수는 5 ng을 사용하였다. 최종 반응액의 9 µl를 MAP 16 digital PCR plate (Thermo fisher Scientific, A52688)의 각 홈(well)에 분주한 후, 그 위에 분리 용액(Thermo fisher Scientific, A52730)15 µl 를 첨가하고, 개스킷(gasket)을 장착하였다. MAP 16 digital PCR plate의 한 홈은 20,480개의 고정된 마이크로챔버로 이루어졌다. cdPCR 은 96°C에서 5분간 반응 후, 96°C 5초, 60°C 15초 조건에서 40 cycle로 수행하였다.

Real-time PCR 반응

LM이벤트의 경우 개발사가 제출한 100% LM 및 non-LM 표준시료로부터 추출한 LM DNA와 non-LM DNA를 사용하여LM DNA 10%가 혼합된 시료(S1)을 준비하였다. 멸균 증류수를 이용하여 DNA 시료S1(약 200 ng)을 순차적으로 S2, S3, S4, S5농도로 희석하여 RT-qPCR (QuantStudio 1 Realtime Instrument, Applied Biosystems by Thermos fisher)을 수행하였다. RT-qPCR 반응액은 2X Qplex Master Mix (CellSafe, South Korea) 12.5 µl, 프라이머 쌍, 프로브, DNA 10 µl, 멸균 증류수를 혼합하여 최종 볼륨25 µl 로 사용하였으며, 95°C에서 10분간 반응 후, 95°C 15초, 95°C 60초 45 cycle로 수행하였다. 이들 조건은 CellSafe가 제공하는 실험방법을 기본으로 하였다. 프라이머 및 프로브 농도는 이벤트 및 품종에 따라 실험법 최적화를 위해 조정되었다. 각 이벤트 및 품종 당 5개의 DNA 농도에서 증폭곡선의 Ct 값과 DNA 농도를 변환한 유전자 카피수를 이용하여 표준정량곡선을 형성하였다.

콩 및 옥수수 내재 유전자 특이성 검증

LM 콩 이벤트의 정성 및 정량 분석을 위하여 내재참조유전자로 Lectin 유전자를 사용하였으며, 이 유전자 내에 각기 다른 염기서열 부위를 검출할 수 있는 Le1-A와 Le1-B 검정을 수행하였다. 본 연구에서 사용한 8개의 콩 LM 이벤트 중 LM 작물 개발가 Le1-A 검정을 이용한 이벤트는 5개(MON87701, MON94313, DAS-44406-6, SYHTOH2, BP-CV127-9)였으며, Le1-B 검정은 3개(FG72, A2704-12, GMB151) 이벤트에서 사용되었다. Le1-A검정의 종간 특이성을 확인하기 위하여 국내 수입 승인된 콩(MON94313), 옥수수(DAS01131-3), 카놀라(GT73), 면화(COT102), 감자(SPS-X17), 알파파(KK179) LM이벤트에서 정제한 genomic DNA를 주형으로 일반 PCR을 수행하고, 그 산물을2.5% agarose gel 전기 영동으로 확인하였다. 그리고 PCR산물의 좀더 정확한 크기를 확인하기 위하여 4채널 모세관 전기 영동을 활용하였다(Fig. 1). Le1-A와 Le1-B 검정은 LM콩 MON94313에서만 각각 74 bp (Fig. 1a)와 102 bp (Fig. 1b) 크기의 PCR 산물을 증폭한 반면 다른 작물의LM이벤트에서는 비특이적인 PCR 산물이 검출되지 않았다(Fig. 1a, b). 이로써 Le1-A와 Le1-B 검정은 콩 검정의 고유한 마커로 활용될 수 있음을 확인하였다.

Figure 1. Taxon specificity verification of endogenous reference genes for soybean and maize through conventional qualitative PCR via capillary electrophoresis. (a) Le1-A primers amplifying the expected 74 bp fragment. (b) Le1-B primers amplifying the expected 102 bp fragment. (c) HMG primers amplifying the expected 79 bp fragment. (d) ADH1 primers amplifying the expected 135 bp fragment. (e) ALD primers amplifying the expected 69 bp fragment. Lane M, DNA size marker: 1, soybean Mon94313; 2, Maize DAS01131-3; 3, Canola GT73; 4, Cotton COT102; 5, Potato SPS-X17; 6, Alfafa KK179

본 연구에서 사용한 12개의 옥수수 LM 이벤트 중 LM 작물 개발사가HMG 검정을 이용한 이벤트는 8개(DP915635-4, DP052291-2, DP910521-2, MON95275, MON94804, DAS01131-3, DAS40275-9, MON95379)였으며, ADH1 검정은 3개(MZIR098, MZHGOJG, 5307) 이벤트에서, ALD 검정은 1개(VCO-Ø981-5) 이벤트에서 사용되었다. HMG및 ADH1, ALD 검정의 옥수수 특이성을 조사한 결과, LM옥수수 이벤트 DAS01131-3에서만 각각 79 bp (Fig. 1c), 135 bp (Fig. 1d), 69 bp (Fig. 1e) 크기의 PCR 산물이 증폭되었으며, 다른 작물의LM이벤트에서는 관찰되지 않았다(Fig. 1c-e). 이 결과로 HMG및 ADH1, ALD 검정은 옥수수의 고유한 마커로 사용될 수 있음을 확인하였다. 이들 검정의 PCR 산물 크기는 각 유전자의 염기서열에서 예측한 값과 동일하였다.

cdPCR을 이용한 콩 및 내재참조유전자 검정의 카피수 비교

Quantstudio Absolute Q™ digital PCR system의 MAP 16 digital PCR plate의 한 홀은 20,480개의 고정된 마이크로챔버로 이루어져 있다. dPCR에서는 시료가 분획되는 오일방울 또는 마이크로챔버 수가 적은 경우 결과 값의 오차가 큰 것으로 보고되었다(Huggett et al. 2013; Pecoraro et al. 2019). 본 연구 결과에서cdPCR 반응이 일어난 총 챔버 수는 거의 20,400 개 이상으로 반응액이 마이크로챔버로 고르게 분주 되었음을 알 수 있었다(Table 3-5). 프로브의 형광물질 FAM 또는 VIC에서 발산되는 형광 신호의 세기가 임계값 이상일 때 그 챔버는 ‘양’으로 분류되었으며, 임계값 이하일 경우 cdPCR 반응이 유효하지 않은 ‘음’으로 분류되었다. Fig. 2에서 형광물질 FAM과 VIC의 ‘양’의 신호를 각각 파란색과 녹색으로, ‘음’의 경우 모두 회색으로 나타내었다. 일반적으로 cdPCR 반응의 최적화 정도는 ‘양’과 ‘음’의 신호 사이의 뚜렷한 구분과 두 신호 사이에 고르게 분포하고 있는 신호인 ‘rain’의 수에 의해 판단된다(Demeke and Dobnik 2018; Huggett et al. 2013; Pecoraro et al. 2019). ‘양’과 ‘음’ 사이의 간격은 결합(annealing) 온도에 따른 변이를 보였으며, ‘rain’ 정도는 주형 DNA의 복잡한 구조 등에 영향을 받는 것으로 보고되었다. Huggett 등(2013)과 Xu 등(2016)은 제한효소를 처리한 DNA에서 ‘rain’의 수가 감소하였음을 보여주었다. 본 연구의 cdPCR 반응 결과는 ‘양’과 ‘음’의 형광 신호가 명확하며 ‘rain’ 수가 적어 반응이 최적화되었음을 시사하였다(Fig. 2).

Figure 2. Amplification plots of duplex cdPCR using the reference gene Le1-A and Le1-B assays in soybean A2704-12 (a) and the reference gene HMG, ADH1, and ALD assays in maize VCO-Ø1981-5 (b, c, and d). Two different primers and probe sets were included in the reaction mixture to amply the target gene, respectively. Probes were tagged with either FAM or VIC labeled with a TAMRA or MGB quencher. Blue represents positive PCR products detected by FAM fluorescence; green represents positive PCR products detected by VIC fluorescence; gray indicates negative PCR products

Table 3 . Ratio of copy numbers of endogenous genes in two LM soybean maize events determined by chamber digital PCR.

	Assays	Total	Target	Conc.cp/µl	SD	CV%	Positive	Ratio
Soybean	A2704-12
	Le1-A/Le1-B	27467	Le1-A	806.8	5.81	0.72	6023	1.00
			Le1-B	803.8	5.09	0.63	6005
	DAS-44406-6
	Le1-A/Le1-B	20466	Le1-A	723.3	8.38	1.16	5492	1.00
			Le1-B	717.2	7.44	1.04	5453
Maize	VCO-Ø1981-5
	HMG/ADH1	20445	HMG	1334.9	62.8	4.7	8956	1.14
			ADH1	1175.9	38.4	3.3	8142
	ALD/HMG	20433	ALD	2376.3	46.5	2.0	13112	1.78
			HMG	1337.5	18.9	1.4	8967
	ALD/ADH1	20440	ALD	2339.3	54.9	2.3	12998	1.99
			ADH1	1175.1	22.7	1.9	8137
	DAS01131-3
	HMG/ADH1	20456	HMG	823.7	42.3	5.14	6123	1.18
			ADH1	699.0	17.1	2.44	5331
	ALD/HMG	20440	ALD	1330.4	66.4	4.99	8931	1.60
			HMG	830.5	44.9	5.4	6160
	ALD/ADH1	20436	ALD	1282.8	42.3	3.68	8693	1.91
			ADH1	672.6	23.5	3.5	5152

Conc.cp/µl, concentration of copies/µl; SD, standard deviation; CV%, % of coefficient variation..

Table 4 . Zygosity ratio determination of LM soybean events through chamber digital PCR.

Event	Target	Chamber detection		Poisson statistics (copies)			Zygosity ratio
		Total	Positive	Conc.cp/µl	SD	CV%
MON87701	LM	20447.5	5773	767.9	8.6	1.1	1.00
	Le1-A		5763	766.3	11.2	1.5
MON94313	LM	20472.8	5321	767.9	5.2	0.7	1.01
	Le1-A		5260	687.3	5.7	0.8
DAS-44406-6	LM	20468.5	5730	760.2	8.6	1.1	1.01
	Le1-A		5693	754.4	7.3	1.0
SYHT0H2	LM	20462.8	5532	729.6	4.6	0.6	0.97
	Le1-A		5675	751.9	7.1	0.9
FG72	LM	20459.3	5269	689.2	6.7	0.6	1.01
	Le1-B		4370	556.0	7.8	1.4
A2704-12	LM	20453.5	4509	576.4	5.6	1.0	0.99
	Le1-B		4486	572.7	4.6	1.8
GMB151	LM	20459.3	5269	689.2	4.3	0.6	0.99
	Le1-B		5306	695.0	6.7	1.0
BP-CV27-9	LM	20471	4440	566.0	2.2	0.4	0.99
	Le1-A		4486	572.7	10.3	1.8

Conc.cp/µl, concentration of copies/µl; SD, standard deviation; CV%, % of coefficient variation..

Table 5 . Zygosity ratio determination of LM maize events through chamber digital PCR.

Event	Target	Chamber detection		Poisson statistics (copies)			Zygosity ratio
		Total	Positive	Conc.cp/µl	SD	CV%
DP915635-4	LM	20349.5	3193	395.1	10.7	2.70	0.417
	HMG		6829	946.5	26.0	2.74
DP051291-2	LM	20447.3	2589	313.5	23.5	7.48	0.370
	HMG		6268	847.5	20.3	2.40
DP910521-2	LM	20436.3	2641	320.3	13.1	4.10	0.415
	HMG		5793	771.8	24.4	3.17
MON95275	LM	20467.8	4557	583.1	13.7	2.36	0.582
	HMG		7188	1001.5	25.4	2.54
MON94804	LM	20439.5	3688	460.6	8.8	1.92	0.529
	HMG		6408	870.8	20.3	2.34
MON95379	LM	20465.5	4337	551.3	13.9	2.53	0.553
	HMG		7163	997.3	16.5	1.66
DAS01131-3	LM	20341.3	2868	353.6	16.8	0.98	0.426
	HMG		6160	830.5	44.9	5.40
DAS40278-9	LM	20436	2868	350.0	3.4	0.98	0.413
	HMG		6263	847.3	28.5	3.37
VCO-Ø981-5	LM	20441.6	4913	640.3	57.4	8.97	0.269
	ALD		13112	2376.4	46.3	1.96
MIR098	LM	20438.8	3820	479.6	14.9	3.11	0.581
	ADH1		6125	826.0	24.0	2.90
MZHGOJG	LM	20418.3	3963	499.5	7.5	1.49	0.487
	ADH1		7305	1025.1	25.0	2.44
5307	LM	20441.5	3421	424.0	2.34	0.55	0.521
	ADH1		6059	813.9	29.7	3.64

Conc.cp/ul, concentration of copies/µl; SD, standard deviation; CV%, % of coefficient variation..

LM 콩A2704-12와 DAS-44406-6 표준시료에서 Le1-A 또는 Le1- B검 정 간의 cdPCR 반응액의 µl당 평균 카피수(Conc.cp/ul) 비는 약 1.0에 근접하였다(Table 3). 또한A2704-12의 cdPCR증폭 그림(Fig. 2a)에서 Le1-A와 Le1-B 검정의 ‘양’의 형광 신호(각각 파란색과 녹색)는 ‘음’의 형광 신호(회색)와 명확히 구분되었다. 따라서 LM 콩A2704-12와 DAS-44406-6에서 Le1-A와 Le1-B 검정에 의해 검출되는 염기서열 카피수는 같은 것으로 판단되었다(Fig. 2a). LM옥수수의 경우 VCO-Ø981-5와 DAS01131-3 표준시료의 HMG, ADH1 및 ALD 검정들 간의 cdPCR 반응액의 µl당 평균 카피수 비를 비교하였다. VCO-Ø981-5의 ADH1에 대한 HMG카피수 비는 1.14으로 HMG 카피수가 ADH1에 비해서 상대적으로 많았다. HMG에 대한 ALD 카피수 비는 1.78, 그리고 ALD에 대한 ADH1의 카피수 비는 1.99로써, 이들 반응에서도 HMG 카피수가 ADH1 카피수에 비해 많은 것을 확인할 수 있었다(Table 3). ADH1에 비해 HMG에서 더 많은 카피수가 검출되는 이유는 PCR반응 효율성의 차이인 것으로 사료되었다. DAS01131-3의 경우 ADH1에 대한 HMG 카피수 비는 1.18, 그리고 HMG에 대한 ALD 카피수 비는 1.60이었으며, ADH1에 대한 ALD의 카피수 비는 1.91로써, VCO-Ø981-5와 비슷한 결과를 보였다(Table 3). VCO-Ø981-5 의 cdPCR증폭 산물의 형광 분포를 보면 HMG와 ADH1 검정의 ‘양’의 형광 신호는 단일 그룹인 반면, ALD 검정에서는 두 개로 분리된 양’의 형광 신호가 확인되었다(Fig. 2b-d).

dPCR 반응은 분획된 오일방울 또는 마이크로챔버에서 형광 신호가 측정되기 때문에 프라이머 및 프로브 염기서열과 완벽히 일치하는 부분과 부분적으로 일치하는 염기서열에서의 dPCR 산물 간에 구분이 기능한 것으로 보고되었다. 부분적으로 일치하는 염기서열의 경우 낮은 dPCR 반응 효율로 인하여 완벽히 일치하는 염기서열에서의 형광 신호 세기보다 더 낮게 측정되었다(Pecoraro et al. 2019). 이와 유사하게 옥수수 이벤트 VCO-Ø981-5의 cdPCR 증폭 그림(Fig. 2c, d)에서 ALD 검정은 PCR 반응 효율이 다른 두 부위를 검출하는 것으로 판단되었다. 본 연구의 옥수수 LM 이벤트의 HMG, ADH1, ALD 검정의 카피수 비교 결과는 Jacchia 등(2018)이 ddPCR을 이용하여 MON810과 NK603 표준시료에서 보고한 결과와 유사하였다. 이들의 연구결과에서는 HMG 카피수는 ADH1 카피수 보다 더 많이 측정되었으며, ALD 검정의 경우 프라이머 및 프로브 염기서열과 완벽히 일치하는 목적 유전자와 SNP (Single Nucleotide Polymorphism)가 존재하는 상동유전자에서 증폭된 ‘양’의 형광 신호가 두 개로 분리되어 검출되었다(Jacchia et al. 2018). 본 연구에서도NCBI BLAST 조사를 통해서 옥수수B73 품종의 표준 염기서열 에서 염기서열의 상동성이 98.6%인 두개의 ALD (3g199300.1, 8g256900.1)가 존재하며, 8g256900.1 위치의 ALD 유전자 염기서열에서 역방향 프라이머 및 프로브에 대해 각 1개씩의 SNP가 확인되었다. PCR 반응에서 검출 유전자의 SNP는 PCR 반응액 조성 및 결합 온도에 따라 증폭 효율성에 영향을 미치는 것으로 보고 되었다(Broothaerts et al. 2008; Papazova et al. 2010). 따라서 ALD 검정은 LM 옥수수 정량 평가의 내재참조유전자로 적합하지 않는 것으로 판단되었다.

cdPCR을 이용한 LM 콩 및 LM 옥수수 zygosity ratio분석

RT-qPCR을 이용하여 시료 내의 정확한 LMO 혼입율을 산출하기 위해서는 zygosity ratio가 적용된 표준정량곡선을 사용하여야 한다(Corbisier et al. 2017). Zygosity ratio는 종 특이적 내재참조유전자 카피수 대비 도입유전자 카피수로 계산하며, 작물의 육종 단계 및 교배 시 LM 형질의 공여친(donor parent), 옥수수 등 외떡잎 식물의 종자 조직(배, 배유, 종피) 등에 따라 달라질 수 있다(Holst-Jensen et al. 2006). 콩은 대표적인 자가수분 작물이며, 종자의 배는 2배체로 양친의 기여도가 동일하다. LM콩의 도입유전자는 동형접합체(homozygous)로 고정되어서 세대로 유전되는 것으로 알려져 있다. 한편 옥수수 종자의 전체 DNA는 대략 배 49%, 배유 49%, 종피 2%로 구성되어 있으며, 배 DNA는 2배체로 양친의 기여도가 동일한 반면, 배유 DNA는 3배체로 모친 2/3, 부친 1/3이 기여하고, 종피는 2배체로 오직 모친으로부터 유래된다. 따라서 옥수수 LM모친과 non-LM 부친의 교배 된 교잡제일대(F₁ hybrid)의 LM DNA는 전체 DNA의 약 59.5%를 차지하며, LM 부친과 non-LM 모친의 교잡제일대에서는 약 40.5%를 차지하는 것으로 보고되었다(Holst-Jensen et al. 2006). 그러나 고정된 동형접합체LM 이벤트일지라도 세대가 거듭하면서 유전형이 분리될 가능성을 완전히 배제할 수는 없으며, 특히 LM 옥수수 이벤트의 LM 형질의 공여친에 따라 종자의 LM DNA 함유량이 상이할 수 있기 때문에, LM 정량 검정을 위해서zygosity ratio 정보가 필요하다. 이러한 이유로 EURL GMFF는 LM 이벤트에 대한 분석법 검증 보고서에 ddPCR 분석을 통한 zygosity ratio값을 명시하고 있다(Corbisier et al. 2017).

본 연구에서는 각 개발사가 이벤트 별 정량 검정방법에서 사용한 내재유전자 특이 검정(Table 1)과 이벤트 특이 검정(Table 2)을 듀플렉스 cdPCR 방법으로 수행하여, cdPCR 반응액 µl당 평균 카피수 비로 zygosity ratio를 계산하였다. 콩의 경우 각 이벤트 특이 검정의 카피수와 Lectin 유전자의 Le1-A 또는 Le1-B 검정의 카피수로 zygosity ratio를 계산한 결과 LM콩 8개 이벤트에서 약 1.0에 근접하였다(Table 4). 콩 반수체(haploid)에서 Le1-A와 Le1-B 검정의 프라이머 및 프로브 염기서열과 정확히 일치하는 염기서열은 1카피라 보고되었다(Jacchia et al. 2018). 따라서 LM 콩 이벤트의 zygosity ratio가 1.0에 근접한 것으로 보아, LM도입유전자는 반수체 당 1카피로 존재하며, 동형접합성으로 판단되었다. 마찬가지로 LM 옥수수 12 이벤트에서 각 이벤트 특이 검정과 내재참조유전자 검정에 대한 듀플렉스 cdPCR결과를 Table 5에 나타내었다. VCO-Ø981-5의 zygosity ratio는 0.269로 가장 낮았으며, 다른 이벤트들은 0.357~0.569 값을 보였다. VCO-Ø981-5의 내재참조유전자로는 ALD 검정이 사용되었으며, Table 3의 결과에서 확인한 바와 같이 ALD 검정의 검출 염기서열은 두 부분이기 때문에 평균 카피수가 µl 당 2376으로 가장 높았다(Table 5). 따라서 VCO-Ø981-5의 LM 혼입율 산출에서 내재참조유전자로 ALD 검정을 사용할 경우zygosity ratio값은 0.538을 적용하여야 한다. VCO-Ø981-5외 다른 LM 옥수수 이벤트에서 zygosity ratio는 HMG 또는 ADH1 검정을 사용하였다. HMG 및 ADH1 검정의 검출 부위는 1카피로 보고되었다(Jacchia et al. 2018). 따라서 LM 옥수수 이벤트의 zygosity ratio 0.357~0.569 값은 도입유전자의 반접합성(hemizygous)을 의미하는 것으로 판단되었다. 이 결과를 통하여 정확한 zygosity ratio 산출은 LM 혼입율 계산을 위한 아주 중요한 요소임을 확인하였다.

RT-qPCR을 이용한 내재참조유전자 적합성 분석

RT-qPCR를 활용한 LMO 정량 분석 시 LM 도입유전자와 내재참조유전자의 표준정량곡선이 필요하다. 일반적으로 표준정량곡선의 적합성은 EFSA의 RT-qPCR 사용법에서 제시된 기울기 값 -3.6 < 기울기 < -3.1과 R² > 0.98, 효율성 90% ENGL 2015). 이때 효율성은 Efficiency(Eff) = 10(-1/slope) -1 방정식을 이용하여 계산된다. 본 연구에서는RT-qPCR정량 분석 방법에서 앞서 분석한 내재참조유전자 검정의 적합성을 조사하였다. 각 이벤트의 10% LM DNA가 혼합된 non-LM DNA시료(S1)과 이를 순차적으로 희석한 시료(S2-S5)을 주형으로, RT-qPCR 을 수행하여 각 DNA농도에서의 Ct 값을 얻었다. 이때 각 이벤트의zygosity ratio (Table 6, 7)를 반영하여 10% LM 이벤트의DNA 농도를 결정하였다. 또한 국내 콩 및 옥수수 품종에서 내재유전자로의 활용 여부를 조사하기 위하여, 국내 콩 4품종과 옥수수 3품종에서 정제한 genomic DNA 시료를 멸균 증류수로 순차적으로 희석하여 표준정량곡선을 형성하였다. RT-qPCR 반응 조건의 확립은 개발사가 각 LM 이벤트의 정량 검정에 사용한 내재참조유전자 중심(Table 1)으로 DNA농도와 프라이머 및 프로브 양을 조절하여 진행하였으며, 이를 다른 내재참조유전자에 적용하였다. 표준정량곡선은 주형으로 사용한 DNA 농도에서 환산한 카피수와 Ct값을 이용하여 형성하였다. 이때 게놈 평균 크기를 기준으로 한 카피 당 콩의 경우1.155 pg DNA로, 옥수수의 경우 2.73 pg DNA로 환산하였다(Arumuganathan and Earle 1991).

Table 6 . Values of slope, correlation coefficient (R²), and efficiency (Eff%) of RT-qPCR standard curves using Le1-A and Le1-B assays with lectin gene from LM soybean events and Korean commercial soybean varieties.

Variety	Le1-A assay			Le1-B assay
	Slope	R2	Eff%	Slope	R2	Eff%
LM events
MON87701	-3.411	0.999	96.42	-3.317	0.999	100.21
MON94313	-3.359	0.999	98.48	-3.437	0.999	95.40
DAS-44406-6	-3.453	0.999	98.80	-3.336	0.999	99.42
SYHT0H2	-3.348	0.999	98.94	-3.243	1.000	103.39
FG72	-3.359	0.999	98.48	-3.359	0.999	98.48
A2704-12	-3.387	0.999	97.35	-3.239	0.999	103.60
GMB151	-3.365	1.000	98.22	-3.437	0.999	95.41
BP-CV127-9	-3.573	0.999	90.48	-3.543	0.998	91.55
Korean varieties
Kwangan	-3.324	1.000	99.93	-3.384	1.000	97.49
Socheongja	-3.367	0.999	98.15	-3.463	0.999	94.42
Seonpung	-3.309	1.000	100.54	-3.352	0.999	98.75
Pungwon	-3.336	1.000	99.43	-3.326	0.999	99.82

Table 7 . Values of slope, correlation coefficient (R²), and efficiency (Eff%) of RT-qPCR standard curves using HMG, ADH1, and ALD assays from LM maize events and Korean commercial maize varieties.

Variety	HMG assay			ADH1 assay			ALD assay
	Slope	R2	Eff%	Slope	R2	Eff%	Slope	R2	Eff%
LM events
DP915635-4	-3.320	0.999	100.07	-3.162	0.998	107.31	-3.288	0.999	101.43
DP051291-2	-3.219	0.999	104.49	-3.092	0.999	110.60	-3.288	0.999	101.43
DP910521-2	-3.260	0.999	102.61	-3.149	0.999	101.75	-3.396	1.000	97.00
MON95275	-3.277	0.998	101.89	-3.174	0.999	106.55	-3.683	0.938	86.85
MON94804	-3.120	0.999	109.16	-3.354	0.998	98.70	-3.368	1.000	98.09
MON95379	-3.309	1.000	100.56	-3.122	0.999	109.92	-3.308	0.999	100.58
DAS01131-3	-3.091	0.997	110.63	-3.199	0.999	105.39	-3.319	0.999	100.12
DAS40278-9	-3.167	0.999	106.88	-2.997	0.999	115.62	-3.281	0.999	101.73
VCO-Ø981-5	-3.329	0.999	99.70	-3.142	0.999	108.09	-3.327	0.999	101.06
MZIR098	-3.288	0.999	101.44	-3.152	0.999	107.61	-3.405	0.999	96.63
MZHGOJG	-3.248	1.000	103.20	-3.151	0.999	107.68	-3.466	0.998	94.33
5307	-3.061	0.998	112.20	-3.231	0.999	103.94	-3.267	0.999	102.36
Korean varieties
Heokmichal	-3.114	0.998	108.01	-3.048	0.989	112.85	-3.322	0.999	99.98
Ilmichal	-3.34	1.000	99.27	-3.258	0.999	102.73	-3.262	0.999	102.55
Kangilok	-3.295	1.000	101.15	-3.274	0.999	102.03	-3.347	0.999	98.95

콩 내재참조유전자

8개의 LM콩 이벤트에서 Le1-A 검정에 대한 표준정량곡선의 기울기 값은 -3.573 < 기울기 < -3.348 범위였으며, 효율성은 90.48%에서 98.94% 범위로 나타났다. Le1-B 검정의 표준정량곡선 기울기 값은 -3.239 < 기울기 < -3.543 범위로, 효율성은 91.55%에서 103.6% 범위였다. 이 결과는RT-qPCR반응의 효율성이 좋으며 억제 현상이 거의 없음을 시사하였다(Smith 2021). Le1-A 및 Le1-B 검정의 R² 값은 모두 0.999 이상으로 정량 검정에 적합한 선형성을 보였다(Table 6). 또한 국내 콩 품종 중에서 생명공학 기술을 활용한 신품종 개발 연구에 주로 사용되고 있는 광안과 풍원, 그리고 농가 보급률이 높은 선풍과 소청자에서 Le1-A와 Le1-B 검정을 수행하였다. 이들 품종에서 Le1-A 검정의 표준정량곡선 기울기 값은 -3.573 < 기울기 < -3.348 범위였으며, Le1-B 검정의 경우 -3.239 < 기울기 < -3.543 범위로 허용범위를 충족하였다. R² 값은 모두 0.999 이상으로 정량 검정 목적에 적합하였다(Table 6). 따라서 콩 내재유전자 Lectin의 Le1-A 및 Le1-B 검정은 RT-qPCR를 이용한 정량 검정 방법에서 내재참조유전자로의 그 활용 가치가 높은 것으로 판단되었다.

옥수수 내재참조유전자

본 연구에서 사용한 12개의 LM 옥수수 이벤트 중 9개 이벤트에서 HMG, ADH1, ALD 검정의 표준정량곡선 기울기 값은 -3.6 < 기울기 < -3.1 범위였으며, R²은 0.98 이상, 효율성은 94.33%에서 108.09% 범위로 허용 기준에 모두 부합하였다(Table 7). HMG 검정의 경우 오직 5307이벤트에서 허용기준이 충족되지 않았으며, 그 외11 개 이벤트에서 기울기 값은 -3.382 < 기울기 < -3.120 범위였으며, R²은 0.999 이상, 효율성은 99.7%에서 109.16%이었다. 한편, 5037 이벤트의 ADH1 및 ALD 검정은 표준 곡선의 기울기, R², Eff% 허용범위 기준에 부합하였다. ADH1 검정의 경우는 DP051291-2와 DAS40278-9에서 허용 기준이 충족되지 않았으나, 그 외 다른 10 개 이벤트에서 기울기 값 -3.354 < 기울기 < -3.122, R² > 0.998 이상으로 모두 표준 곡선 허용 기준에 부합하였다(Table 7). 또한 ALD 검정은11 개 이벤트에서 기울기 값 -3.466 < 기울기 < -3.267, R² > 0.998 이상으로 표준 곡선의 허용 기준에 부합하였다. 오직 MON95275이벤트에서 기울기 -3.683, R² 0.938, Eff% 86.85로 허용 기준에 부합되지 않았다. 또한 국내 찰옥수수 품종인 흑미찰과 일미찰, 사료용 품종인 강일옥에서 HMG 검정의 기울기 값은 -3.34 < 기울기 < -3.114이었으며, ADH1 검정의 기울기 값은 -3.239 < 기울기 < -3.543, ALD 검정의 기울기 값은 -3.347 < 기울기 < -3.262 범위로 표준 곡선의 허용 범위에 적합하였다. 모든 검정에서 R² 값은0.989 이상이었다(Table 7). 이 결과는 HMG, ADH1, ALD 검정이 국내 옥수수 품종에서 내재참조유전자로 활용될 수 있음을 시사하였다.

이 실험결과에서 LM옥수수 이벤트에서 내재유전자 검정의 정량표준곡선이 허용 기준에 충족되지 않는 경우 Table 7에 회색으로 표시하였다. 이런 경우는 SNP 등 유전자의 염기서열 변이로 프라이머 및 프로브와의 불일치에 의한 가능성을 유추할 수 있다. 그러나 한편으로 해당 검정에 대한 PCR 방법이 최적화 되지 않은 결과일 수도 있다. 예를 들어 5307의 경우 ADH1 검정으로 최적화된 RT-qPCR 반응 조건이 HMG와 ALD 검정에 적용되었다. 그 결과 ALD 검정은 표준 곡선의 허용 기준을 충족하였으나, HMG 검정의 경우 기울기 값 -3.061, 효율성 112.20%로 허용 기준에서 벗어났다. 따라서 5307 이벤트에서 HMG 검정에 대한 RT-qPCR 반응의 최적화 실험이 필요할 것으로 사료되었다. 그리고 ALD 검정의 경우cdPCR 결과에서 PCR 증폭 효율이 다른 2개의 염기서열로부터 2개의 ‘양’ 의 형광 신호 그룹이 확인되었으나, RT- qPCR 증폭곡선에서는 이러한 특성이 구분되지 않았다. 그 이유는RT-qPCR의 증폭곡선은 주형 DNA가 증폭되는 모든 과정에서 측정되는 형광 신호의 총합이기 때문에 PCR 증폭 효율이 다른 검출 부위의 형광 신호는 구분할 수 없는 것으로 사료되었다(Pecoraro et al. 2019).

LM 이벤트의 정량 검정은 내재참조유전자 카피수 대비 도입유전자 카피수로 표현되기 때문에 이들에 대한 정확한 카피수는 필수적으로 필요한 요소이다. 본 연구에서는 개발사가 표준시료 정량심사에서 사용하는 내재참조유전자 검정을 이벤트 간 교차하여 사용할 수 있음을 증명하였다. 콩의 Le1-A 및 Le1-B, 옥수수의 HMG 및 ADH1 검정이 검출하는 목적 염기서열 카피수는 1개이며, 콩과 옥수수에 대한 분류군 특이성을 보였다. 또한 여러 LM콩 및 옥수수 이벤트와 국내 콩 및 옥수수 품종에서 RT-qPCR표준곡선의 기울기, R², 효율성은 허용 범위를 충족하여, 내재참조유전자로의 효용성을 확인하였다. 한편 옥수수의 ALD 검정은 분류군 특이성을 보였으며, 또한 RT-qPCR표준곡선에서도 정량 검정 목적에 적합한 기울기, R², 효율성을 보였다. 그러나 ALD 상동 유전자의 염기서열이 프라이머 및 프로브와 부분적으로 일치함으로써, PCR 결과의 변동 가능성으로LM 정량 검정에서 적합하지 않는 것으로 판단되었다. 본 연구에 제시한 LM콩과 LM 옥수수에서 보편적으로 사용 가능한 내재참조유전자 검정은 효율적인 정성 및 정량 분석법 확립과 효과적인 LMO 안전관리에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

LM 작물의 정량 검정 결과는 내재참조유전자의 카피수 대비 도입유전자의 카피수의 백분율로 제시된다. 따라서 적합한 내재참조유전자의 개발과 검증이 필수적이다. 본 연구는 국내에 수입 승인된 LM 콩 및 LM 옥수수 이벤트의 정량 검정 방법에서 사용된 대표적인 내재참조유전자 검정의 특성을 일반 PCR 및 chamber digital PCR (cdPCR), 실시간 정량 PCR (RT-qPCR) 방법을 사용하여 평가하였다. 콩의 경우 Lectin 유전자의 다른 두 부위를 타겟으로 하는 Le1-A와 Le1-B를, 옥수수의 경우 High Mobility Group a (HMG), 및 Alcohol Dehydrogenase 1 (ADH1), Fructose bisphosphate Aldolase (ALD) 검정을 수행하였다. 일반 PCR 분석으로 분류군 특이성을, cdPCR을 통해 내재참조유전자의 검출 카피수 및 zygosity ratio를, 그리고 RT-qPCR을 통해 표준정량곡선의 기울기, R², 효율성을 분석하였다. 그 결과 해당 분류군에 대한 특이성을 보였으며, Le1-A와 Le1-B 검정은 분석한 모든 LM 콩 이벤트와 국내 콩 4개 품종에서 적합한 것으로 판단되었다. 12개의 LM 옥수수 이벤트 중 HMG 검정은 11개 이벤트에서 적합 하였으며 ADH1 검정은 10개 이벤트에서 적합성을 보였다. 또한 국내 옥수수 3개 품종에서도 적합한 것으로 판단되었다. 그러나 옥수수의 ALD 검정은 상동 유전자의 SNP로 cdPCR 반응의 효율성이 다른 두 개의 ‘양’의 그룹을 형성하여 옥수수 내재참조유전자로 적합하지 않는 것으로 판단되었다. 본 연구에서 제시한 LM 콩 및 LM 옥수수의 내재참조유전자 검정의 활용은 효율적인 정성 및 정량 분석법을 구축할 수 있으며. 규제 요구 사항을 보다 효율적으로 충족시킬 수 있을 것으로 전망된다.

본 연구는 농촌진흥청 평가기관 과제(과제 번호: RS-2024-00400888)로 수행되었으며, 이에 감사드립니다.