Establishment of in vitro culture conditions for mass-production and analysis of functional compound contents at culture stage in Rhododendron micranthum Turcz.

Jungmok Kang · Daeho Choi · Eun-Suk Jung · Yong-Woo Park

doi:10.5010/JPB.2024.51.022.228

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J Plant Biotechnol (2024) 51:228-236

Published online September 24, 2024

https://doi.org/10.5010/JPB.2024.51.022.228

꼬리진달래의 대량증식을 위한 기내배양 조건 확립 및 배양 단계별 유용성분 함량 분석

강정목 · 최대호 · 정은숙 · 박용우

충청북도산림환경연구소 산림바이오센터

Received: 20 April 2024; Revised: 18 July 2024; Accepted: 22 July 2024; Published: 24 September 2024.

Establishment of in vitro culture conditions for mass-production and analysis of functional compound contents at culture stage in Rhododendron micranthum Turcz.

Jungmok Kang · Daeho Choi · Eun-Suk Jung · Yong-Woo Park

Author Info. +

Researcher, Forest Bio Center, Chungcheongbuk-do Forest Environment Research Center, Okcheon 29061, Korea

Correspondence to : Y.-W. Park (✉)
e-mail: pywcan@korea.kr

Received: 20 April 2024; Revised: 18 July 2024; Accepted: 22 July 2024; Published: 24 September 2024.

This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

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서 론
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In this study, suitable culture media, growth regulators, and acclimatization soil for regenerated plants were evaluated to enable mass production of Rhododendron micranthum, and the contents of functional compounds at culture stage were analyzed to confirm industrial applicability. For shoot proliferation, culturing in 4 mg/L zeatin-containing Murashige and Skoog medium was found to be the most effective treatment; the shoot induction rate was 77.08%, number of developing shoots was 2.8, and length of shoots was 9.01 mm. Regarding culture medium and growth regulator suitable for rooting, half-strength Economou and Read medium and 1 mg/L indole-3-butyric acid treatment were the most effective, with a rooting rate of 95.83%, root number of 4.1, and root length of 12.59 mm. Peatmoss was found to be most effective for facilitating ex vitro acclimatization of regenerated plants, with a seedling shoot length of 69.27 mm and root length of 49.30 mm. Chlorogenic acid, astragalin, myricetin, and afzelin contents were analyzed via high-performance liquid chromatography analysis at culture stage. The in vitro-rooted seedlings contained 3.77 mg/g chlorogenic acid, 1.53 mg/g astragalin, 1.07 mg/g myricetin, and 0.17 mg/g afzelin; the contents were higher than those in in vitro shoots (0.44 mg/g chlorogenic acid, 1.30 mg/g astragalin, 1.04 mg/g myricetin, and 0.05 mg/g afzelin) and increased as the stage progressed. We confirmed that these culture conditions can be used for additional research, such as increasing the contents of functional compounds and mass production research. Based on these findings, there is a possibility of supplying raw materials and producting four functional compound using in vitro culture of R. micranthum.

Keywords Rare plant, Tissue culture, Chlorogenic acid, Astragalin, Myricetin, Afzelin

서 론

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서 론
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꼬리진달래(Rhododendron micranthum Turcz.)는 충청북도, 경상북도, 강원도 산간 지역에 자생하는 진달래과(Ericaceae) 진달래속(Rhododendron)의 상록활엽관목으로 산림청 지정 희귀식물이다(Korea National Arboretum 2021). 꼬리진달래는 내음성이 강하고 꽃이 아름다워 조경용 소재로 이용이 기대되며(Lee et al. 1989), 지엽이나 꽃은 기관지염, 이질, 골절 치료의 효능이 있고 발효추출물은 미백, 항주름 효과가 보고 되어 대량증식을 통한 산업적 이용을 기대할 수 있는 산림생명자원이다(Kim et al. 2018; Oh et al. 2018).

현재까지 국내에 알려진 꼬리진달래의 증식방법으로는 삽목과 종자를 통한 증식이 있다. 삽목 증식은 녹지삽과 숙지삽 모두 10% 미만의 낮은 발근율을 보이며, 종자 증식은 저장기간과 환경에 따라 발아율의 편차가 크다(Kim et al. 2013; 2021). 또한 종자의 크기가 작고 적정 채집시기를 선정하는 것이 어렵고, 종자의 특성상 환경에 의한 변이가 다양하여 균일한 개체의 대량 증식에 어려움이 있다(Michaels et al. 1988; Pothasin et al. 2022).

기내배양은 유전적으로 동일한 식물체의 대량증식에 이용되는 기술로 희귀식물의 보존과 다양한 작물의 빠른 증식에도 효과적인 도구로 사용되며(Kane 2018; Murashige 1974; Parzymies et al. 2023), 산업적 이용을 위한 대규모 식물 증식 분야에서도 많이 이용되고 있다(Gamborg 2002; Jo et al. 2011; Kumar and Loh 2012; Seo et al. 2017). 진달래속의 기내배양은 Anderson (1975)이 진달래류의 신초 배양 방법을 최초로 보고한 뒤 기내 발아종자(R. ponticum, R. wattii), 액아(R. fortunei), 화아(R. decorum), 캘러스(R. aureum), 자엽절(R. maddeni)을 이용한 기내배양 방법이 보고되었으나(Cantos et al. 2007; Mao et al. 2018; Singh and Gurung 2009; Wei et al. 2018; Wu et al. 2023; Zhao et al. 2023) 꼬리진달래에 대한 기내배양 연구는 부족한 실정이다(Yi et al. 2012).

기내배양은 배양 배지(media)의 조성, 식물생장조절제의 종류나 농도에 따른 반응 차이가 크기 때문에(Lee et al. 2015) 꼬리진달래의 기내배양을 통한 대량증식을 위해서는 다양한 배지와 생장조절제의 영향 및 순화(acclimatization) 조건 확인이 필요하다. 또한 식물의 기내배양은 산업분야에서 쓰이는 의약품 및 화장품용 활성 화합물, 식품 첨가물 및 천연 살충제와 같은 이차 대사산물의 생산에 쓰이는 효율적인 생명공학기술이며(Debnarh et al. 2006; Terrier et al. 2007), 이차 대사산물 함량은 배양단계, 부위, 물질마다 달라 질 수 있어(Jung et al. 2007; Kim et al. 2006; Lee et al. 2005; Youn and Cho 1991) 산업적 이용의 원료 공급을 위해 배양 단계에 따른 유용물질 함량의 확인이 필요하다.

따라서 본 연구에서는 꼬리진달래의 대량증식을 위해 적합한 배지, 생장조절제, 증식 식물체의 순화 용토를 선발하였으며 산업 원료 공급 가능성을 알아보고자 배양 단계별 유용성분 함량을 확인하고자 하였다.

재료 및 방법

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식물재료

꼬리진달래는 충청북도 괴산군 조령산 내 꼬리진달래 자생지(36°48'49.4"N 128°02'41.6"E)에서 한 개체를 선발하고 신초(shoot)를 채취하여 식물재료로 사용하였다. 초대배양을 위한 살균처리는 초음파 세척기에서 증류수로 8분간 3회 수세 후 70% 에탄올에서 8분간 1회 소독하고 tween-20을 첨가한 2% 차아염소산나트륨(NaOCl)용액에 8분간 1회 멸균하였다. 살균처리가 완료된 시료는 클린벤치 내에서 멸균수로 5회 수세하고 물기를 제거한 후 실험에 사용하였다.

기내배양 적합 배지 선발

꼬리진달래의 신초 증식에 적합한 배지를 선정하기 위해 woody plant media (WPM), Economou and Read (ER), Murishige and Skoog (MS) 배지를 사용하였다. 실험에 사용한 모든 배지에 탄소원으로 1.5% (w/v) sucrose와 배지의 경화를 위해 0.6% (w/v) agar를 첨가하고 pH를 6.0 ± 0.1로 조정하여 121°C에서 15분간 고압 멸균 후 450 ml 유리 배양병에 80 ml씩 분주하였다. 배양 환경은 280 µmol·m^-2·s^-1 광도의 Light Emitting Diode (LED) 백색등으로 1일 16시간 조명, 온도는 25 ± 2°C로 유지하였다. 신초의 치상은 배지별로 병당 4주씩 6반복으로 실시하였고 배양 8주 후 신초 발생률, 신초 수, 신초 길이를 조사하였다.

발근 유도에 적합한 배지 선발을 위해 약 2 cm 길이의 신초를 1/2MS, 1/2WPM, 1/2ER배지에 치상하였다. 배양환경은 100 µmol·m^-2·s^-1 광도의 LED 백색등으로 1일 16시간 조명, 온도는 25 ± 2°C로 유지하였다. 치상은 배지별로 병당 4주씩 6반복으로 실시하였고 배양 8주 후 발근율, 뿌리 수, 뿌리 길이를 조사하였다.

다경유도

다경유도(multiplication)에 적합한 생장조절제의 종류와 농도를 구명하기 위해 MS 배지에 생장조절제로 zeatin, 2-isopentenyladenine (2iP), Thidiazuron (TDZ)을 선정하여 각각 2, 4, 6 mg/L의 농도로 첨가하고 약 2 cm 길이의 신초를 치상하여 다경 유도하였다. 치상은 배지별로 병당 4주씩 6반복으로 실시하였고 배양 8주 후 다경 발생률, 신초 수, 신초 길이를 조사하였다.

발근 유도

발근 유도에 적합한 생장조절제의 종류와 농도를 구명하기 위해 1/2ER 배지에 생장조절제로 Indole-3-butyric acid (IBA), Indole-3-acetic acid (IAA), 1-Naphthalene acetic acid (NAA)를 선정하여 1, 2, 3 mg/L의 농도로 각각 처리하여 발근 유도하였다. 치상은 처리별로 병당 4주씩 6반복으로 실시하였고 배양 8주 후 발근율, 뿌리 수, 뿌리 길이를 조사하였다.

증식 식물체 순화를 위한 용토 선발

증식 식물체의 순화에 적합한 용토를 선발하기 위하여 줄기와 뿌리가 건전한 기내 식물체의 뿌리 부위 배지를 제거한 후 4가지 토양조건으로 피트모스(마이플랜트), 원예용상토(바이오프로그, 흥농), 원예용상토와 펄라이트(마이플랜트)의 1:1 (v/v) 배합토, 블루베리상토(한아름)를 선정하여 토양에 정식하였다. 배양 환경은 1일 16시간 조명, 온도는 25 ± 2°C의 온도 조건에서 관리하였다. 기외적응을 위해 1~2주차에는 공중습도 70 ± 5%, 광도 140 µmol·m^-2·s^-1, 3~4주차에는 공중습도 60 ± 5%, 광도 280 µmol·m^-2·s^-1에서 관리하였으며 정식 4주 후에 생존율, 신초 길이, 뿌리 길이를 조사하였다.

추출물 제조 및 배양 단계별 유용물질 분석

각 배양단계에서 선발된 처리구의 개체를 대상으로 꼬리진달래의 유용성분으로 보고된 chlorogenic acid, astragalin, myricetin, afzelin (Kang et al. 2024) 함량을 측정하기 위해 추출물을 제조하고 유용물질 함량을 분석하였다.

선발된 처리구의 개체를 수세하여 이물질을 제거하고 동결건조(FD5508, Ilshin BioBase, Yangju, Korea) 후 분쇄하고 1:100 (w/v) 비율로 80% 에탄올을 첨가하여 60°C에서 1시간 동안 초음파 추출(UCP-10, JEIO TECH, Daejeon, Korea)하였다. 추출물은 20분간 4,000 rpm으로 원심분리하고 상등액을 실험에 사용하였다.

물질분석을 위해 꼬리진달래 추출물과 메탄올에 용해한 표준물질을 0.45 µm syringe filter로 여과하여 사용하였다. HPLC분석은 Thermo Ultimate 3000 (Thermo Scientific, MA, USA)를 이용하였으며 컬럼은 Hypersil GOLD C18 (250 × 4.6 mm, 5 µm, Thermo Scientific, MA, USA)을 이용하여 컬럼온도 45°C, 유속은 1.5 mL/min, 시료 주입량은 10 µL로 하여 검출파장 254 nm에서 분석하였다(Table 1). 모든 용매는 사용 전 탈기 및 여과하였다. 추출물 내 정성 평가는 표준물질의 검출시간(retention time, RT) 비교로 하였으며, 꼬리진달래 추출물의 피크 면적을 기준으로 표준물질의 검량선에 대입하여 정량 분석하였다.

Table 1 . High-performance liquid chromatography conditions for chlorogenic acid, astragalin, myricetin, and afzelin content analysis

Parameters	Conditions
Instrument	Thermo Ultimate 3000 system
Detector	DAD detector (254 nm)
Column	Hypersil GOLD C18 (250 × 4.6 mm, 5 µm)
Flow rate	1.5 mL/min
Column Temp.	45°C
Injection volume	10 µL
Mobile phase	A : 0.1% formic acid in water
	B : 0.1% formic acid in ACN
	Gradient	Time (min)	A (%)	B (%)
		0	97	3
		15	85	15
		50	50	50
		55	0	100
		55.1	97	3
		60	97	3
Run time	60 min

통계처리

모든 실험은 3회 이상 반복하여 수집된 데이터를 평균과 표준편차로 나타냈다. 통계처리는 R program (Ver 4.2.2)을 이용하여 평균 간 유의차를 95% 수준에서 일원분산분석(One-way ANOVA)을 실시하고, Duncan’s multiple range test로 유의적 차이를 검정하였다.

결과 및 고찰

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기내배양 적합 배지 선발

꼬리진달래의 신초 증식 배지 선발 실험 결과는 Table 2와 같다. 신초 발생률은 MS 배지에서 41.66%로 가장 높았으며, WPM 배지에서는 29.16%, ER 배지에서는 4.16%로 나타났다. 발생된 신초 수는 MS 배지에서 1.6개로 가장 많았고, WPM 배지에서는 1.4개, ER 배지에서는 1.0개로 나타났다. 신초 길이는 ER 배지에서 8.44 mm로 가장 길었으며, MS와 WPM 배지에서는 5.94 mm로 차이가 없었다. MS 배지에서의 신초 발생 특징은 절편체의 액아에서 새로운 신초를 발생하는 경우가 많았고 WPM 배지에서는 치상된 절편체(explant)의 길이가 생장하는 경우가 많았다. MS 배지에서 신초의 길이는 WPM 배지에 비하여 큰 차이는 없었으나 신초의 발생율과 발생개수가 높아 초대배양을 위한 신초 증식에 적합 배지로 판단된다.

Table 2 . Effect of basal media on induction of axillary shoots in Rhododendron micranthum

Medium^a	Shooting rate (%)^b	No. of shoots^b	Shoot length (mm)^b
WPM	29.16	1.4 ± 0.4	5.94 ± 1.72
ER	4.16	1.0 ± 0.0	8.44 ± 0.00
MS	41.66	1.6 ± 0.4	5.94 ± 2.76
Significance	ns	ns	ns

^aWPM, woody plant medium; ER, Economou and Read medium; MS, Murashige and Skoog medium.

^bData were collected 60 d after culture and presented as the mean ± standard deviation with six replicates. The different letters indicate a significant difference (p < 0.05; Duncan’s multiple range test). ns, not significant.

꼬리진달래의 발근 유도 배지 선발 실험 결과는 Table 3과 같다. 치상한 개체의 발근 유무를 조사한 발근율은 1/2ER 배지에서 8.33%로 1/2WPM 배지에 비해 2배 이상 높았다. 발근수는 1/2ER 배지에서 1/2WPM 배지 보다 많았으나 통계적으로 유의하지 않았다. 발근길이는 1/2WPM 배지에서 26.29 mm로 1/2ER 배지에 비해 6 mm 이상 길었다. 1/2MS 배지에서는 발근이 유도되지 않아 발근수와 발근길이가 측정되지 않았다. 1/2ER 배지에서 발근율과 뿌리 수가 많아 1/2WPM 배지와 1/2MS 배지보다 발근 유도에 적합할 것으로 판단된다.

Table 3 . Effect of half-strength basal media on root induction in Rhododendron micranthum

Medium^a	Rooting rate (%)^b	No. of roots^b	Root length (mm)^b
1/2WPM	4.16	2.0 ± 0.0	26.29 ± 4.35
1/2ER	8.33	3.0 ± 0.0	20.70 ± 5.55
Significance	ns	ns	ns

^a1/2WPM, half-strength woody plant medium; 1/2ER, half-strength Economou and Read medium.

신초 증식에는 MS 배지, WPM 배지, ER 배지 순으로 신초 발생률과 신초 발생 수가 많았고 발근 유도에는 1/2ER 배지, 1/2WPM 배지, 1/2MS 배지 순으로 발근율과 발근수가 많았다. 일반적으로 MS 배지는 목본식물의 기내배양에 많이 사용되는 WPM 배지에 비해 질소와 암모늄이 많기 때문에 질소 요구도가 높은 목본 식물에서는 더 효과적이나(Phillips and Garda 2019), 배양단계에 따라 적합한 배지 종류와 농도가 다를 수 있다(Borkheyli et al. 2021; Fotopoulos and Sotiropoulos 2005; Sarropoulou et al. 2015). Yi 등(2012)의 보고에서는 신초 증식과 발근 유도 단계에 모두 ER 배지를 사용하여 배지 별 차이를 확인 할 수 없었다. 본 연구에는 꼬리진달래의 신초 증식에 MS 배지가 적합하고 발근 유도에 1/2ER 배지가 적합한 것을 확인할 수 있었다. ER 배지에 비해 질소 함량이 적은 1/2ER 배지는 발근율 향상에 영향을 주었을 것으로 사료되며, 꼬리진달래의 기내 배양 시 질소 요구도가 신초 증식 단계에서 발근 유도단계보다 높은 것으로 판단된다(Woodward et al. 2006).

다경유도

꼬리진달래의 신초 증식에 적합한 MS 배지에 생장조절제를 처리하여 다경유도한 결과는 Table 4와 같다. 절편당 신초 발생률은 zeatin 4 mg/L 처리구와 6 mg/L 처리구가 77.08%로 가장 높았고, 다음으로 zeatin 2 mg/L 처리구가 75.00%로 비교적 높았다. 2iP 2 mg/L 처리구를 제외 하고 2iP와 TDZ의 처리구는 모두 대조구에 비하여 4~29% 정도 낮았다. 절편당 신초 수는 zeatin 4 mg/L 처리구가 2.8개, TDZ 6 mg/L 처리구는 2.8개로 다른 처리구에 비하여 많았으나 통계적 유의성은 없었다. TDZ 2 mg/L 처리구와 2ip의 모든 처리구는 대조구에 비하여 0.3~0.6개 정도 더 적었다. 유도된 신초 길이는 zeatin 4 mg/L 처리구가 9.01 mm로 가장 길었고 나머지 처리구는 대조구에 비하여 0.2~5.5 mm정도 짧았다. 이는 초기 신초 발생률이 증가할수록 신초 길이 감소에 영향이 있는 것으로 추정된다.

Table 4 . Effect of cytokinin on induction of multiple shoots in Rhododendron micranthum grown in Murashige and Skoog basal medium

PGRs^a	Conc. (mg/L)	Shooting rate (%)^b	No. of shoots^b	Shoot length (mm)^b
Zeatin	2	75.00 ^a	2.6 ± 1.7	7.68 ± 4.52 ^a
	4	77.08 ^a	2.8 ± 1.6	9.01 ± 3.56 ^a
	6	77.08 ^a	2.6 ± 2.0	8.17 ± 2.51 ^a
2iP	2	41.66 ^ab	1.1 ± 0.3	4.03 ± 0.95 ^b
	4	25.00 ^b	1.3 ± 0.7	4.15 ± 0.94 ^b
	6	37.50 ^b	1.0 ± 0.0	2.91 ± 1.06 ^b
TDZ	2	12.50 ^b	1.3 ± 0.4	3.49 ± 0.63 ^b
	4	29.16 ^b	2.5 ± 1.1	4.12 ± 0.68 ^b
	6	20.83 ^b	2.8 ± 1.1	3.04 ± 0.34 ^b
Significance		^***	ns	^***

^aPGRs, plant growth regulators, zeatin, 6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino)purine; 2iP, N⁶-(2-isopentenyladenine); TDZ, thidiazuron.

2iP는 다경 유도 능력이 낮았고, TDZ는 정상적인 신초의 형태가 아닌 과수화(hyperhydricity)된 형태였다(Fig. 1). TDZ에 의해 유발된 신초의 과수화는 Pluchea lanceolate (Kher et al. 2014), Aloe polyphylla (Ivanova and van Staden 2011), Arbutus unedo (El-Mahrouk et al. 2010)과 같은 식물종에서도 보고되어, 꼬리진달래와 유사한 결과를 보였다.

Fig. 1. Effect of cytokinin on induction of multiple shoots in Rhododendron micranthum after 8 weeks of culture; scale bars, 1 cm. Plantlets are shown after treatment with (A) 2 mg/L zeatin, (B) 4 mg/L zeatin, (C) 6 mg/L zeatin, (D) 2 mg/L 2iP, (E) 4 mg/L 2iP, (F) 6 mg/L 2iP, (G) 2 mg/L TDZ, (H) 4 mg/L TDZ, and (I) 6 mg/L TDZ. 2iP, N⁶-(2-isopentenyl)adenine; TDZ, thidiazuron

진달래속 식물의 기내배양에서 R. fortunei은 zeatin (Wei et al. 2018), R. aureum은 TDZ (Zhao et al. 2023), R. wattii는 2iP가(Mao et al. 2018) 다경유도에 적합한 생장조절제로 보고되었으며, 이는 동일 속에서도 적합한 생장조절제의 종류가 다른 것으로 사료된다. 꼬리진달래의 다경유도에는 zeatin이 적합한 생장조절제로 판단되며 이는 cytokinin oxidase가 cytokinin의 효과를 감소시키지만, zeatin은 친화력이 낮아 상대적으로 높은 농도로 존재할 수 있어 기관 형성에 영향을 미친 것으로 사료된다(Nikolić et al. 2006).

발근 유도

기내 배양 꼬리진달래의 발근 유도를 위한 생장조절제의 처리 결과는 Table 5와 같다. IBA처리구의 발근율은 IAA와 NAA처리구보다 높았고, IBA 1 mg/L 농도에서 95.83%로 가장 높았다. NAA처리구는 생장조절제를 처리하지 않은 대조구보다 4% 이상 낮았으며, IAA 2 mg/L 처리구는 발근이 되지 않았다.

Table 5 . Effect of auxin on rooting of Rhododendron micranthum grown in half-strength Economou and Read basal medium

PGRs^a	Conc. (mg/L)	Rooting rate (%)^b	No. of roots^b	Root length (mm)^b
IBA	1	95.83 ^a	4.1 ± 1.8	12.59 ± 5.84 ^a
	2	79.16 ^ab	4.6 ± 3.4	7.53 ± 2.87 ^ab
	3	50.00 ^bc	3.9 ± 2.4	8.17 ± 3.34 ^ab
IAA	1	41.66 ^bcd	4.1 ± 2.0	11.06 ± 5.49 ^ab
	2	0	0	0
	3	16.66 ^cd	2.5 ± 2.5	7.14 ± 2.09 ^b
NAA	1	4.16 ^d	2.0 ± 0.0	1.34 ± 0.47 ^c
	2	4.16 ^d	5.0 ± 0.0	2.03 ± 0.47 ^c
	3	4.16 ^d	3.0 ± 0.0	1.08 ± 0.32 ^c
Significance		^***	ns	^***

^aIBA, indole-3-butyric acid; IAA, indole-3-acetic acid; NAA, 1-naphthalene acetic acid.

절편당 뿌리 수는 NAA 2 mg/L 처리구가 5.0개로 가장 많았고 IAA 3 mg/L처리구와 NAA 1 mg/L 처리구는 대조구에 비하여 0.5~1.0개 정도 적었으나 통계적으로 유의하지 않았다. 뿌리 길이는 IBA 1 mg/L 처리구가 12.59 mm로 가장 길게 나타났고 IAA 1 mg/L 처리구는 11.06 mm였다. NAA 처리구는 2 mg/L처리구가 2.03 mm였으나 IBA 처리구나 IAA 처리구에 비해 뿌리생장에는 효과가 낮은 것으로 추정된다.

NAA 처리구를 제외한 IBA 처리구와 IAA 처리구는 대조구보다 발근율이 높고 뿌리 수가 많은 경향을 보였다. IBA 처리구의 가장 큰 잎의 크기는 1 cm, IAA 처리구가 0.5 cm정도였다. NAA 처리구는 가장 큰 잎의 크기가 0.3 cm 정도로 신초의 성장이 매우 더디거나 고사하였고, 배지와 맞닿은 부위에서 callus와 짧은 뿌리가 형성되기도 하였다(Fig. 2). 1/2ER 배지는 R. fotunei에서 발근 유도 효과가 우수하다고 보고되었으며, IBA는 진달래속의 다른 종인 R. fotunei, R. aureum, R. wattii 에서 발근에 유용한 생장조절제로 보고되어(Mao et al. 2018; Wei et al. 2018; Zhao et al. 2023) 꼬리진달래의 발근에 IBA가 적합하다는 본 연구 결과와 유사하였다. 이는 IBA가 뿌리 발달 초기에 캘러스 형성을 방해하여 IAA보다 효과가 높은 것으로 사료된다(Štefančič et al. 2005).

Fig. 2. Effect of auxin on rooting in Rhododendron micranthum grown in half-strength Economou and Read basal medium after 8 weeks of culture; scale bars, 1 cm. Plantlets are shown after treatment with (A) 1 mg/L IBA, (B) 2 mg/L IBA, (C) 3 mg/L IBA, (D) 1 mg/L IAA, (E) 2 mg/L IAA, (F) 3 mg/L IAA, (G) 1 mg/L NAA, (H) 2 mg/L NAA, and (I) 3 mg/L NAA. IBA, indole-3-butyric acid; IAA, indole-3-acetic acid; NAA, 1-naphthaleneacetic acid

증식 식물체 기외 순화를 위한 용토 선발

증식 식물체의 적합한 기외 순화 용토 실험 결과는 Table 6과 같다. 정식한 증식 식물체의 생존율은 모든 처리구에서 100%였다. 정식 후 신초 길이는 피트모스 처리구에서 69.27 mm로 다른 처리구에 비하여 20~26 mm정도 길었고 뿌리 길이도 피트모스에서 49.30 mm로 다른 처리구에 비하여 7~16 mm 정도 길었다.

Table 6 . Effect of different mixed soil media on Rhododendron micranthum growth

Treatment	Survival rate (%)^a	Shoot length (mm)^a	Root length (mm)^a
Peatmoss	100	69.27 ± 15.48 ^a	49.30 ± 16.58 ^a
Horticultural substrate:perlite (1:1)	100	48.11 ± 14.52 ^b	36.27 ± 9.30 ^bc
Horticultural substrate	100	50.21 ± 14.09 ^b	33.63 ± 9.60 ^c
Blueberry substrate	100	43.88 ± 9.56 ^b	42.74 ± 16.19 ^ab
Significance	ns	***	***

^aData were collected 30 d after planting and presented as the mean ± standard deviation with eight replicates. The different letters indicate a significant difference (p < 0.05; Duncan’s multiple range test). ns, not significant, *** p < 0.001.

기외 순화 시 피트모스 처리구가 식물체의 상부길이와 뿌리 길이 생장에 가장 효과적이었고, 정식 후 잎의 넓이도 피트모스 처리구가 가장 양호하였다. 특이적으로 블루베리용 상토 처리구는 일부 개체에서 뿌리 길이 생장이 높았으나 피트모스 처리구에 비하여 균일하지 않아(Fig. 3), 피트모스가 꼬리진달래 증식 식물체의 기외 순화에 가장 적합한 용토로 판단되었다. 피트모스는 진달래속의 다른 종인 R. maddeni, R. niveum, R. griffithianum에서도 순화 용토로 적합한 것으로 보고되어 본 연구와 유사한 결과를 보였다(Singh 2008; Singh et al. 2013; 2016).

Fig. 3. Effect of different mixed soil media on Rhododendron micranthum growth after 8 weeks of culture; scale bars, 1 cm. Plantlets are shown after growth in (A) peatmoss, (B) horticultural substrate:perlite (1:1), (C) horticultural substrate, and (D) blueberry substrate

배양 단계별 HPLC-PDA 분석

기내 배양 꼬리진달래의 생육이 우수한 기내 신초(in vitro shoot, zeatin 4 mg/L), 기내 발근묘(in vitro root, IBA 1 mg/L), 순화묘(acclimatization, 피트모스)를 선발하여 배양 단계별 chlorogenic acid, astragalin, myricetin, afzelin 함량을 분석한 결과는 Table 7과 같다. Chlorogenic acid의 함량은 기내 신초에서 0.44 mg/g였으며 배양 단계가 진행됨에 따라 증가하였고 순화묘는 기내 신초보다 6배 이상 크게 높았다. Astragalin 함량은 기내 신초에서 1.30 mg/g였으며 기내 발근묘에서 1.53 mg/g로 유의적 차이는 없었으나 순화묘에서 2.82 mg/g로 기내 발근묘에 비하여 약 50% 가량 더 높았다. Myricetin 함량은 배양 단계가 진행되면서 증가하였으나 큰 차이를 보이지 않았다. Afzelin의 함량은 기내 신초에 비하여 기내 발근묘와 순화묘가 3배 이상 높았다.

Table 7 . Chlorogenic acid, astragalin, myricetin, and afzelin contents in Rhododendron micranthum at different stages of culture

Stage	Contents (mg/g)^a
Stage	Chlorogenic acid	Astragalin	Myricetin	Afzelin
In vitro shoot	0.44 ± 0.06 ^c	1.30 ± 0.01 ^b	1.04 ± 0.00 ^b	0.05 ± 0.00 ^b
In vitro root	3.77 ± 0.40 ^b	1.53 ± 0.04 ^b	1.07 ± 0.02 ^b	0.17 ± 0.02 ^a
Acclimatization	6.21 ± 0.21 ^a	2.82 ± 0.05 ^a	1.17 ± 0.00 ^a	0.15 ± 0.00 ^a
Significance	***	***	***	*

^aData were collected and presented as the mean ± standard deviation with three replicates. The different letters indicate a significant difference (p < 0.05; Duncan’s multiple range test); * p < 0.05, *** p < 0.001.

Chlorogenic acid, astragalin, myricetin, afzelin은 배양 단계가 진행될수록 함량이 증가하는 모습을 보여주었고, chlorogenic acid와 astragalin은 기내 발근묘에서 순화묘보다는 낮은 함량을 보였으나 기내 신초보다 높은 함량을 보였다. Myricetin과 afzelin은 기내 발근묘에서 순화묘와 비슷한 함량을 보였다. 또한 신초 부분만 추출한 단계보다 신초와 뿌리부분을 같이 추출한 단계에서 함량이 높아 뿌리부분에 유용성분 함량이 높은 것으로 판단되어 식물 부위에 대한 추가 함량 연구가 필요하다.

적 요

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서 론
재료 및 방법
결과 및 고찰
적 요
REFERENCES

꼬리진달래의 대량증식을 위해 적합한 배지, 생장조절제, 재분화체의 순화 용토를 선발하고 산업적 이용 가능성을 확인하고자 배양 단계별 유용성분 함량을 분석하였다. 신초 증식에는 MS 배지와 zeatin 4 mg/L 처리가 신초 발생률은 77.08%, 신초 발생개수는 2.8개, 신초 길이 생장은 9.01 mm로 가장 효과적인 것으로 나타났다. 발근에 적합한 배지와 생장조절제는 1/2ER 배지와 IBA 1 mg/L 처리가 발근율은 95.83%, 뿌리 수는 4.1개, 뿌리 길이 생장은 12.59 mm로 가장 효과적인 것으로 나타났다. 증식 식물체의 기외 순화에는 피트모스가 신초 길이 69.27 mm, 뿌리 길이 49.30 mm로 가장 효과적인 것으로 나타났다. 배양 단계별 HPLC분석을 통해 chlorogenic acid, astragalin, myricetin, afzelin 함량을 분석했다. 기내 발근묘가 chlorogenic acid 3.77 mg/g, astragalin 1.53 mg/g, myricetin 1.07 mg/g, afzelin 0.17 mg/g으로 기내 신초의 chlorogenic acid 0.44 mg/g, astragalin 1.30 mg/g, myricetin 1.04 mg/g, afzelin 0.05 mg/g보다 높은 함량으로 단계가 진행될수록 증가하였으며, 유용성분 함량증진, 대량증식 연구 등 추가 연구에 사용할 수 있음을 확인했다. 이를 통해 꼬리진달래의 기내배양을 통한 대량증식과 배양단계별 유용성분 함량으로 기내 배양을 이용한 원료공급 가능성이 있음을 확인하였다.

REFERENCES

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서 론
재료 및 방법
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적 요
REFERENCES

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Article

Research Article

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Published online September 24, 2024 https://doi.org/10.5010/JPB.2024.51.022.228

꼬리진달래의 대량증식을 위한 기내배양 조건 확립 및 배양 단계별 유용성분 함량 분석

강정목 · 최대호 · 정은숙 · 박용우

충청북도산림환경연구소 산림바이오센터

Received: 20 April 2024; Revised: 18 July 2024; Accepted: 22 July 2024; Published: 24 September 2024.