담배(Nicotiana tabacum L.; 2n=4x=48)는 하나의 개체로부터 백만 개 가량의 종자를 생산할 수 있으며, 3개월 이내에 다음 세대의 종자를 얻을 수 있는 특징이 있다. 또한, 조직배양, 유전자 발현량 분석, 단백질 분석 등이 쉬우므로 다양한 작물의 모델 식물로 이용되고 있으며(Ganapathi et al. 2004), 특히 형질전환 효율성이 높아 형질전환이 어려운 작물의 모델 식물로 유전자의 기능을 규명하는 데 사용된다. 예를 들어 형질전환이 어려운 고추의 경우, 역병균(Phytophthora capsici) 저항성 유전자의 기능을 확인하기 위하여 담배를 이용한 형질전환을 통해 고추의 저항성 후보 유전자의 기능을 밝힌바 있다(Kwon et al. 2023)

Botrytis 속에 속하는 병원균은 세계적으로 다양한 원예특용작물을 가해하고 생장을 방해하여 수확량을 감소시킨다. 그뿐만 아니라 작물의 수확 후 저장 때에도 피해를 주는 괴사성 진균 병원균 속으로 균사가 과실이나 잎, 줄기 등에 퍼져 해당 부위를 연화시키면서 다양한 작물에 곰팡이병을 발생시킨다(Elad et al. 2007; Williamson et al. 2007). 대부분의 괴사성 진균이 좁은 범위의 숙주를 가지는 특성이 있는 반면, 잿빛곰팡이병을 일으키는 B. cinerea는 인삼, 딸기, 포도, 양파, 감자, 고추, 물레나물 등 약 200종의 식물을 숙주로 할 수 있어 다른 괴사성 진균 병원균보다 다양한 작물에 피해를 일으킨다(Vicente-Díez et al. 2023; Hoshikawa et al. 2012; Kamara et al. 2016; Kim et al. 2015; Kwon and Son, 2015; Petrasch et al. 2019; Steentjes et al. 2021). B. cinerea에 의한 피해를 줄이기 위해서는 잿빛곰팡이병이 발생하는 저온 다습한 환경을 회피해야 하고, 감염된 식물체를 제거하는 물리적 방제와 동시에 살균제 등을 이용한 화학적 방제가 필수적이다(Gao et al. 2022; Saito et al. 2016).

B. cinerea에 대한 담배 접종 관련 연구는 몇 건 보고되었는데 Oirdi 등(2010)의 연구에서 N. tabacum cv. Samsun과 cv. Xanthi에 1 × 10⁶ spores/mL의 B. cinerea 포자 현탁액을 10 µL 씩 접종했을 때, 접종 4일 후 병증이 확인되었으나 cv. Petit Havana는 동일한 조건에서 병 발생이 되지 않았다. 해당 논문에서 저항성을 보인 cv. Petit Havana는 Rossi 등(2017)의 연구 결과에서는 1 × 10⁵ spores/mL 농도로 10 µL 접종 3일 후 병증이 관찰되어 담배 품종별 정밀한 B. cinerea의 접종 조건의 재설정이 필요한 상황이다. 그 외에도 B. cinerea의 침입에 대응하는 방어 기작과 관련된 유전자들의 발현 분석과 잿빛곰팡이병 저항성 관련 유전자의 선발 등의 연구가 이루어진 바 있으나 구체적인 B. cinerea의 침입 기작과 관련된 저항성 기작에 대한 연구가 필요하다(Bi et al. 2023; Dinh et al. 2010).

B. squamosa는 마늘, 파, 양파, 부추, 쪽파 등 주로 Allium 속에 속하는 작물의 잎에서 잎마름, 반점으로 시작하여 심하게는 감염부위를 연화시켜 잎마름병, 잿빛곰팡이병의 원인이 되며, 목썩음병에도 관여한다(Chilvers and du Toit 2006; Hassan et al. 2022; Liu et al. 2013; Ramsey and Lorbeer 1986; Tremblay et al. 2003). 중국, 캐나다, 뉴질랜드 등 다양한 국가에서 B. squamosa에 의한 양파의 잎마름병이 보고된바 있으며(Carisse et al. 2012; Zhang et al. 2010), Hassan 등(2022)의 연구 결과에서 B. squamosa에 의한 달래의 잎마름병이 한국에서 처음으로 알려졌다. B. squamosa에 의한 잎마름병은 크게 두 단계로 진행되는데 먼저, 순차적으로 잎에 하얀 반점이 생기며 이후에 잎이 무르면서 썩게 된다. 이때 양파의 경우 죽은 잎의 끝부터 포자가 형성되며, 비정상적인 구가 형성되기도 한다(Tremblay et al. 2003). 부추 잎에 회색 또는 흰색 반점의 형성을 시작으로 잿빛곰팡이병을 일으켜 생산량 감소 피해를 주기도 한다(Song et al. 2023).

B. squamosa는 병원균이 접종된 식물체의 유전체 및 단백질 분석에 관련된 연구와 병원성 평가 등의 연구가 일부 보고되었으나(Malvestiti et al. 2022), 식물체에 대한 침입 기작 및 저항성에 관련된 유전자의 연구는 부족하며 특히, 담배에 관련된 연구는 미비한 상태이다.

자스몬산(Jasmonic acid)은 식물의 생장, 발달 및 노화 등에 관여할 뿐만 아니라, 다양한 해충과 병원균, 특히 괴사성 병원균에 의한 생물학적 스트레스와 건조, 저온, 염 등 비생물학적 스트레스에 반응하여 방어 관련 신호전달 역할을 하는 식물호르몬 중 하나이다(Liu and Timko 2021). 자스몬산은 α-linolenic acid로부터 생합성되는데, lipoxygenase (LOX), allene oxide synthase (AOS), allene oxide cyclase (AOC), oxophytodienoic acid reductase (OPR) 및 acetyl-coenzyme A oxidase (ACX) 등의 다양한 유전자가 관여한다(Mata-Perez et al. 2015; Wasternack and Hause 2013). 상처 등과 같은 외부의 자극으로 식물이 스트레스를 받으면 이에 대응하여 식물체는 자스몬산의 생합성을 급격히 증가시키는데 이러한 현상을 ‘JA burst’라고 한다(Ye and Fernández-Milmanda 2022). JA burst에 주요하게 관여하는 유전자로 LOX와 AOS가 보고되어 있다(Yang et al. 2011).

본 연구는 형질전환이 어려운 작물을 대상으로 Botrytis 속 병원균의 저항성과 관련된 연구 수행을 원활히 하기 위하여 모델 식물인 담배에 B. cinerea 와 B. squamosa의 접종 체계를 확립하고자 하였다. 또한, Botrytis 속 병원균 접종 후 병 저항성과 밀접한 관련성이 있는 자스몬산의 생합성 관련 유전자 LOX와 AOS의 발현량을 확인하여 잿빛곰팡이병 저항성 유전자로서 가치를 평가하고자 하였다.

식물 재료

본 시험은 무균상태 유지를 위하여 클린벤치에서 이루어졌으며 사용된 담배(Nicotiana tabacum) Havana SR1 품종은 경희대학교에서 분양받아 다음과 같은 방법으로 준비되었다. 먼저, 종자를 70% EtOH로 30초 동안 침지 한 후, 멸균한 dH₂O로 수세하였다. 이후 2% NaOCl을 이용하여 30초 동안 처리 후 멸균한 dH₂O로 3회 수세하였다. 소독된 종자는 3% Sucrose와 0.8% Agar가 첨가되고 pH 5.7로 맞춘 MS 배지(Murashige and Skoog 1962)에 파종하였다. 발아 후 3% Sucrose와 0.8% Agar가 첨가되고 pH 5.7로 맞춘 1/2 MS 배지로 옮겨 뿌리 발근을 유도하였다(Fig. 1A). 파종 1달 후 본엽의 크기가 약 4 cm × 6 cm 되었을 때 잎을 채취하여 접종 재료로 사용하였다(Fig. 1B).

Figure 1. In vitro cultivation of N. tabacum cv. Havana SR1 and incubation of Botrytis cinerea and B. squamosa used for inoculation. (A) N. tabacum cultivated under in vitro condition. (B) N. tabacum leaf used for inoculation. (C) B. cinerea and (D) B. squamosa cultured in PDA media. (E) B. cinerea and B. squamosa were cultured in PDB media for three weeks. PDA, Potato Dextrose Agar; PDB, Potato Dextrose Broth

병원균 재료

B. cinerea는 농촌진흥청 농업유전자원센터에서 분양받았으며, B. squamosa는 시판 양파를 포트 재배 후 병반에서 병원균을 분리하였다. 두 병원균은 Potato Dextrose Agar (PDA) 고체 배지에서 배양한 후(Fig. 1C, D) 1 cm × 1 cm 크기로 잘라 50 mL Potato Dextrose Broth (PDB) 액체 배지에서 넣고 진탕 배양기에서 150 rpm, 25°C 조건으로 7일간 배양하였다(Fig. 1E, F). 병원균 접종에 필요한 분생포자를 유도하기 위하여 진탕배양이기에 150 rpm, 4°C 및 315-400 nm UV-A를 형광등과 함께 조사하여 14일간 추가 배양하였다. 분생포자 현탁액의 농도는 혈구 계수기를 사용하여 확인하였다.

숙주식물 검정 및 적정 접종 방법 설정

B. cinerea는 이전 연구에서 담배가 숙주식물임이 보고되었다(McLeod and Thomson 1958). 반면, 담배에 대한 B. squamosa 접종에 관한 선행연구가 없어 숙주식물인지 확인하기 위하여 2.25 × 10⁵ cells/µL 농도의 B. squamosa의 분생포자 현탁액을 잎에 접종하였으며, 20°C의 배양기에서 배양하였다.

접종 방법은 잎의 표면에 분생포자 현탁액을 치상하는 방법과 주맥에 직접 주입하는 방법을 비교하였다. 표면 처리의 경우, 잎의 4부분에 5 µL씩 치상하였으며, 주입 처리의 경우, 22G 주삿바늘을 이용하여 주맥에 상처를 내고 각각 10 µL와 20 µL의 분생포자 현탁액을 주입하였다. 접종된 담배 잎은 접종 후 9일까지 관찰하였다.

발병 조건 확립

담배에 대한 두 병원균의 적합한 발병 조건을 확립하기 위하여 분생포자 농도, 배양 온도 및 상처 유무가 고려되었다. 먼저 분생포자 현탁액을 7.5 × 10³ cells/µL와 2.25 × 10⁵ cells/µL 2수준으로 각각 10 µL씩 잎의 6부분에 접종한 후 생장상의 배양 온도를 20°C, 24°C, 26°C 3수준으로 다르게 하여 병증이 나타나는 시기와 병증의 진전도를 검정하였다. 대조군으로는 dH₂O를 10 µL씩 잎의 6부분에 처리한 후, 위와 동일한 3수준의 배양 온도로 처리하였다. 각각의 병원균의 병증은 접종 후 5일까지 관찰되었다.

담배잎에 B. cinerea와 B. squamosa 접종 시 상처의 유무에 따른 병증이 나타나는 시기와 병증의 진전도를 비교하기 위한 접종을 진행하였다. 2.25 × 10⁵ cells/µL의 10 µL의 분생포자 현탁액을 잎의 6부분에 치상하였다. 상처가 있는 경우, 병원균 접종 전 22G 주삿바늘을 이용하여 잎의 6부분에 상처를 낸 후, 상처 위에 10 µL의 분생포자 현탁액을 치상하였다. 또한 대조군으로 사용하기 위해 잎에 동일한 방법으로 상처의 유무 처리 후, 10 µL의 dH₂O를 처리하였다. 이후, 접종 후 5일까지 병증을 관찰하였다.

NtLOX와 NtAOS 유전자

NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 N. tabacum의 LOX와 AOS 유전자 정보를 활용하여 두 유전자의 발현량 확인을 위한 프라이머를 제작하였다. NtLOX를 표적으로 하는 qRT-PCR 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.

F : GCT GGT GTT CAT CAG TTG GT

R : TTC CAT GTC AAA GCG CCA CA

NtAOS를 표적으로 하는 qRT-PCR 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.

F : ACG GTT AGC GAA CGA GAT CC

R : TAA GGT CGC GTT TGG CTC TT

B. cinerea와 B. squamosa의 분생자 현탁액의 농도를 2.25×10⁵ cells/µL하여 10 µL씩 접종 후 24°C의 배양 온도에서 배양한 후, 각각 0, 4, 8, 16, 24, 48, 72시간 후의 잎의 RNA를 P&C Rapid RNA Prep Kit (Biosolution, Korea)를 이용하여 추출하였다. cDNA의 합성은 LyoFACT^TM RT Pre-Mix (Biofact, Korea)를 이용하여 500 ng/µL의 농도로 합성하였다. NtLOX와 NtAOS의 접종 후 시간대별 발현량 비교를 위해 BioFACT^TM Real-Time PCR Master Mix (Biofact, Daejeon, Korea)를 이용하여 qRT-PCR을 진행하였다. qRT-PCR 프로그램은 15분간 95°C에서 pre-denaturation 후, 40 cycle의 95°C의 denaturation 20초, 60°C의 annealing 30초, 72°C의 extension을 20초 진행하였으며, ΔΔCt 방법을 이용하여 NtLOX 유전자와 NtAOS 유전자의 각 처리 군별 시간에 따른 발현량을 비교하였다.

통계처리

모든 실험은 3회 반복하여 평균값과 표준편차를 계산하였다. 통계 분석은 R 프로그램(R version 4.3.3, The R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria)을 사용하였다. 분산 동질성 검증(유의수준: 5%) 후 등분산이면 Two sample t-test를 수행하였으며, 등분산성이 인정되지 않으면 Welch Two sample t-test를 수행하여 유의성을 검정하였다.

숙주식물 검정 및 적정 접종 방법 설정

담배가 B. squamosa에 대하여 숙주식물인지 확인하기 위하여 2.25 × 10⁵ cells/µL 농도의 분생포자 현탁액을 잎의 표면 처리와 주맥 주입 처리하였다. 그 결과, 모든 처리에서 병증이 관찰되어 담배는 B. squamosa에 대하여 숙주식물임이 입증되었다. 표면 처리한 경우, 접종 4일 후 잎의 표면에서 병증이 관찰된(Fig. 2A) 반면, 주맥에 주입한 경우, 10 µL와 20 µL를 주입하였을 때 각각 9일과 7일 후에 병증이 나타났다(Fig. 2B, C).

Figure 2. Inoculation of N. tabacum leaves with B. squamosa to confirm that SR1 was the host plant. (A) Inoculation of 5 µL B. squamosa conidia suspension at four parts of leaves surface. Injection of (B) 10 µL or (C) 20 µL B. squamosa conidia to midrib. The first confirmed disease symptom is marked in red. dpi, days post inoculation

Botrytis 속은 다양한 작물에 잿빛곰팡이병 등을 유발하는 병원균으로 B. cinerea가 담배를 숙주로 한다는 여러 연구 결과가 보고되었으나(Oirdi et al. 2010; Rossi et al. 2017) B. squamosa에 대한 연구는 부족한 편이었다. B. squamosa를 담배에 접종한 결과 병증이 관찰되었으며(Fig. 2), 이러한 사실로 보아 담배는 B. squamosa에 대하여 숙주식물이며 이러한 결과는 다른 연구에서 보고된 바 없다. 표면 처리와 주입 처리를 비교한 결과, 접종방식에 상관없이 병증이 충분히 발생하여 처리가 간편한 표면 접종 방법이 더욱 적절한 방법임을 확인하였으며, 이후 모든 시험은 표면 접종 방법을 사용하였다.

발병 조건 확립

Botrytis 속 두 병원균의 접종 조건을 확립하기 위하여 분생포자 현탁액을 농도별로 잎의 6부분에 처리하고 각각 20°C, 24°C, 26°C 온도 조건에서 배양하였다. 그 결과, 증류수를 접종한 대조구에서는 어떠한 병증도 관찰되지 않았다(Fig. S1). 또한, 7.5 × 10³ cells/µL 농도를 처리한 경우에도 병원균 종류와 배양온도에 관계없이 병증이 나타나지 않았다(Fig. S2). 반면, 2.25 × 10⁵ cells/µL 농도를 처리하였을 때는 뚜렷한 병증이 확인되었다.

Figure 7. SR1 leaves cultured at 20°C, 24°C, and 26°C after treatment with 10 µL of dH₂O treatment. The treated regions are marked in white. dpi, days post inoculation

Figure 8. Symptoms of SR1 leaves cultured at 20°C, 24°C, and 26°C after inoculation with 7.5 × 10³ cells/µL of B. cinerea or B. squamosa. (A) Inoculation with B. cinerea on six parts of the leaf surface and cultured at 20°C, (B) 24°C or (C) 26°C. (D) Inoculation with B. squamosa and cultured at 20°C, (E) 24°C or (F) 26°C. The treated regions are marked in white. dpi, days post inoculation

B. cinerea의 경우, 2.25 × 10⁵ cells/µL 농도 접종 후 24°C 배양 온도에서 3일 만에 병증이 확인되었는데 2-4부분에서 병증이 시작되었으며 5일 후에는 5-6부분에서도 병증이 확인되어 병증의 진전이 확인되었다(Fig. 3A-C). 반면, 20°C와 26°C 배양 온도의 경우, 접종 3일 후에는 병증이 나타나지 않았으며 5일 후에야 비로소 병증이 나타났다. 20°C의 경우, 2-5부분에서 병증이 확인되었으며, 26°C는 1-3부분에서 병증이 확인되었다.

Figure 3. Symptoms of N. tabacum leaves cultured at (A) 20°C, (B) 24°C, and (C) 26°C after inoculation with B. cinerea and cultured at (D) 20°C, (E) 24°C, and (F) 26°C after inoculation with 2.25 × 10⁵ cells/µL of B. squamosa. The pathogens were inoculated at six parts of the leaf surface, marked in white. The first confirmed disease symptoms are marked in red. dpi, days post inoculation

B. squamosa를 2.25 × 10⁵ cells/µL 농도로 처리한 결과, 24°C 배양 온도에서 접종 3일 후 2-3부분에서 병증이 최초로 관찰되었으며 5일 후에는 5-6부분에서도 병증이 관찰되었는데, 병증의 크기가 점점 커지는 것이 확인되었다(Fig. 3D-F). 반면, 20°C와 26°C 배양 온도의 경우, 접종 5일 후에야 병증이 관찰되었는데 20°C에서는 3-5부분에서 병증이 확인되었으며, 26°C에서는 2-4부분에서 병증이 확인되었다.

Botrytis 속 두 병원균 접종 시 담배 잎 표면에 상처의 유무가 발병 조건에 미치는 영향을 평가한 결과, B. cinerea는 상처 유무와 관계없이 병증이 모두 접종 3일 후 확인되었다(Fig. 4A, B). B. squamosa의 경우에도 상처의 유무 관계없이 병증을 보이기 시작한 시기 뿐만 아니라 병의 진전도 역시 유사하게 나타났다(Fig. 4C, D). 대조구에서는 상처의 유무와 관계없이 병이 발생하지 않았다(Fig. S3).

Figure 4. Symptoms of N. tabacum leaves after inoculation with B. cinerea or B. squamosa in the presence or absence of wound conditions. Leaves were inoculated at six parts with B. cinerea (A) without wounds, or (B) with wounds or inoculated with B. squamosa (C) without wounds, or (D) with wounds. The inoculated regions are marked in white and the first confirmed disease symptoms are marked in red. dpi, days post inoculation

Figure 9. SR1 leaves after mock treatment in the presence or absence of wounds. (A) dH₂O treated at six parts of the SR1 leaves without wounds or (B) with wounds. The treated regions are marked in white. dpi, days post inoculation

B. cinerea에 대한 담배의 발명 조건 연구는 이전에 몇 건 보고되었으나(Oirdi et al. 2010; Rossi et al. 2017), 본 시험에 사용된 SR1 품종의 잎에 적합한 발병 조건은 확립되지 않았으며, B. squamosa에 대한 연구 결과는 거의 보고 보고된 바 없었다. 두 병원균을 각각 접종 시 발병할 수 있는 적합한 조건을 확인한 결과, 두 병원균 모두 2.25 × 10⁵ cells/µL 농도에서 발병이 원활하게 이루어졌다(Fig. 3). B. cinerea의 접종 시 애기장대에 1 × 10⁵ spore/mL의 농도로 접종한 연구 결과가 보고되어 있으며(Windram et al. 2012), 토마토에 1 × 10⁶ spore/mL의 분생포자 현탁액을 접종한 결과가 있다(ten Have et al. 2007). B. squamosa의 경우, 양파에서 1.65 × 10⁵ conidia/mL 농도의 분생포자를 스프레이 하거나(Marcuzzo and Eli 2016), 양파의 잎에 7.45 × 10³ conidia/µL의 분생포자를 접종한 연구 결과가 있다(Lee et al. 2022). 이전의 연구 결과들에서 병원균에 대해 숙주식물의 종, 세부적으로는 품종별로 발병하는 병원균의 농도가 달랐으며, 접종방식에 따라 같은 숙주식물 내에서도 적합한 접종 농도가 달랐다.

이번 연구에서 B. cinerea와 B. squamosa는 담배에 접종하였을 때 24°C에서 모두 발병이 원활하여 3일 만에 병증이 관찰되었다(Fig. 3). 이전의 연구에서 B. cinerea의 경우 0°C 이하의 온도에서도 살아남는다는 보고가 있으나, B. cinerea와 B. squamosa의 최적의 생장온도는 20~22°C이고, 25°C 이상에서는 급격히 균사 생장이 감소하는 것이 확인된바 있다(Alderman et al. 1985; Carisse et al. 2012; Ciliberti et al. 2015b). 본 연구에서 접종 후 24°C로 처리한 경우 가장 병증이 빠르게 나타났으며, 20°C에서 배양한 경우보다 26°C에서 배양한 경우가 잎의 접종한 부분에서 더 적게 병증을 보였는데(Fig. 3), 이는 B. cinerea와 B. squamosa의 최적 생장온도와 유사한 결과임을 확인할 수 있었다. 작물별로 B. cinerea 발병에 적합한 온도는 다른데, 포도 열매는 20°C에서 가장 높은 발병률을 보였고(Ciliberti et al. 2015a), 토마토는 15°C~25°C 온도 조건으로 접종하였을 때, 줄기는 온도가 낮을수록 발병률이 높았고 꽃은 온도가 높을수록 발병이 원활하였다(Eden et al. 1996). 인삼에서는 비교적 낮은 온도인 10°C에서도 균핵형성이 잘 된다고 하였다(Cho et al. 2008).

상처가 있는 경우 병원균의 침투가 용이하여 병증이 더 빠르게 나타나고 병증의 진전이 더 심할 가능성이 높아 접종 부위의 상처 유무는 병원균의 발병에 영향을 끼치는 요소이다(Mercier and Wilson 1995). Lee 등(2022)은 B. squamosa를 양파 잎에 접종 시, 상처를 낸 후 분생포자 현탁액을 접종하여 저항성과 감수성의 계통들을 선발하였고, Borges 등(2014)의 연구에서 토마토의 줄기에 상처를 낸 후 B. cinerea를 접종하였다. 본 연구에서 잎에 상처 유무에 따라서 B. cinerea와 B. squamosa를 접종하고 발병 여부를 조사한 결과, 상처의 유무와 관계 없이 병증을 보이는 시기와 병증의 진전 정도가 유사하게 나타났기 때문에(Fig. 4), 이후 접종 조건을 상처 없이 진행하였다. 이와 유사하게, 토마토와 애기장대의 잎에 B. cinerea를 접종하거나 콩의 잎에 Mycospharellapinodes를 접종할 때, 잎의 표면에 상처 없이 병원균 현탁액을 치상하여 접종한 보고가 있다(Toyoda et al. 2013; Windram et al. 2012; You et al. 2023).

NtLOX, NtAOS 발현분석

유전자 수준에서 병원균에 의한 스트레스반응을 확인하기 위하여 B. cinerea와 B. squamosa를 각각 접종 후 NtLOX와 NtAOS 유전자의 발현량을 확인하였다. 그 결과, B. cinerea의 경우, NtLOX 유전자의 발현량은 접종 4시간 후에 급격하게 증가하여 접종 전보다 2.37배로 최대화되었으며 이후에는 점차 감소하여 접종 8시간 후에는 접종 전 대비 2.23배였으며 16시간 이후에는 차이가 없었다(Fig. 5A). NtAOS의 발현량은 접종 후 4시간 후 2.74배였으며, 8시간 후에는 3.37배로 최대화되었으며 이후에 급격하게 감소하는 경향을 보였다(Fig. 5A). 발현량이 높았던 접종 4시간을 기준으로 dH₂O 처리구와 유전자 발현량을 비교한 결과, NtLOX와 NtAOS 모두에서 통계적으로 유의미한 차이가 확인되었다(Fig. 5B).

Figure 5. Expression levels of NtLOX and NtAOS after mock treatment or inoculation with B. cinerea. Expression levels of (A) NtLOX and NtAOS after treatment with dH₂O or inoculation with B. cinerea. (B) Differences in expression levels of NtLOX and NtAOS at 4 hours after treatment with dH₂O or inoculation with B. cinerea. *, ** indicate significant differences (p < 0.05 and 0.01 respectively) as revealed by two-sample t-test or Welch two-sample t-test

B. squamosa를 접종한 경우, NtLOX의 발현량은 접종 4시간 후에 급격하게 증가하여 접종 전보다 4.25배로 최대화되었으며 이후에는 급격하게 감소하였다(Fig. 6A). NtAOS의 발현량은 접종 4시간 후 접종 전 대비 2.55배로 최대화되었으며 이후에 급격하게 감소하여 낮게 유지되는 것을 확인하였다(Fig. 6A). 접종 4시간 후를 dH₂O 처리와 비교한 결과 후와 비교했을 때, NtLOX와 NtAOS 모두에서 통계적으로 유의미한 차이가 확인되었다(Fig. 6B).

Figure 6. Expression levels of NtLOX and NtAOS after mock treatment or inoculation with B. squamosa. Expression levels of (A) NtLOX and NtAOS after treatment with dH₂O or inoculation with B. squamosa. (B) Differences in expression levels of NtLOX and NtAOS at 4 hours after treatment with dH₂O or inoculation with B. squamosa. *, ** indicate significant differences (p < 0.05 and 0.01 respectively) as revealed by two-sample t-test or Welch two-sample t-test

식물체에 병원균이 침입하면 호르몬 등과 관련된 특정 유전자의 발현량이 많아진다고 알려져 있다(Dreher and Callis 2007; Verma et al. 2016). 자스몬산과 같은 호르몬들은 Botrytis 속 등 괴사성 병원균의 침입 시 이에 대응하기 위하여 신호전달을 촉진하는 역할을 한다고 보고되고 있다(Ghozlan et al. 2020; Pandey et al. 2016). 본 연구에서는 B. cinerea와 B. squamosa를 각각 담배 잎에 접종한 후 자스몬산 생합성에 관여하는 주요 유전자인 LOX와 AOS 유전자의 발현이 어떻게 변하는지 확인하여 두 유전자가 잿빛곰팡이병 저항성과 관련이 있는지 검정하고자 하였다. 그 결과, B. cinerea와 B. squamosa를 각각 접종한 4시간 후의 NtLOX와 NtAOS의 발현량이 상당히 증가하다 이후 급격하게 낮아졌다(Fig. 5, 6). 이 결과는 병원균 접종 후 담배에서 해당 병원균의 침입을 인지하여 자스몬산을 생합성 하기 위한 NtLOX와 NtAOS의 발현량을 급격하게 증대시켰다고 추정을 가능하게 하였다. 이와 유사하게, Ajigboye 등(2021)은 병원균 Zymoseptoria tritici를 밀에 접종하였을 때, 자스몬산의 생합성에 관여하는 LOX와 AOS 유전자가 접종 전과 비교하여 접종 8시간 후에 상대적으로 높은 발현량을 보였으며, 24시간 후에는 다시 낮아졌다고 하였다. 결과를 종합하였을 때 담배는 B. cinerea와 B. squamosa와 침입에 대응하여 초기에 자스몬산 생합성과 관련된 LOX와 AOS 유전자들의 발현량을 증가시키며 이것은 두 유전자가 병 저항성과 관련이 깊다는 점을 시사한다.

본 연구에서는 모델 식물인 담배가 B. cinerea와 B. squamosa에 숙주식물인지 확인과 두 병원균의 적정 접종 체계를 확립하고자 하였다. 그 결과 담배는 B. cinerea와 B. squamosa에 대하여 숙주식물이었으며, 2.25 × 10⁵ cells/µL 농도의 분생포자 현탁액을 이용하여 잎의 표면에 접종하고 24°C에서 배양하였을 때 발병이 원활함을 확인하였다. 잎의 표면에 상처의 유무는 병증이 나타나는 시기나 병증의 정도에 영향을 미치지 않았다. 또한, 병원균 접종 후 스트레스에 의한 반응을 유전자 수준에서 확인하기 위하여 자스몬산과 관련된 유전자 LOX와 AOS의 발현량 변화를 확인한 결과 접종 4시간 후 NtLOX와 NtAOS에 유의미하게 발현량이 증가함을 확인하였다. 본 연구에서 확립된 접종 체계는 추후 형질전환이 어려운 작물에서 B. cinerea와 B. squamosa에 대한 저항성 관련 후보 유전자의 기능을 규명할 때 기반으로 쓰일 수 있을 것으로 기대된다. 또한 이번 연구에서 Botrytis 속 병의 저항성과 밀접하게 관련된 것으로 확인된 LOX와 AOS 유전자들에 대한 추가 연구가 필요하다고 판단된다.