멕시코에 자생하는 Solanum cardiophyllum은 재배종 감자(Solanum tuberosum L.)와 같이 괴경을 형성하나 배수성이 2배체로 재배종 감자의 4배체와는 차이가 있는 근연 야생종 중의 하나이다(Hawkes 1990; Thieme et al. 2010). S. cardiophyllum은 Phytophthora infestans에 의해 유발되는 감자역병, 감자바이러스Y (PVY), 콜로라도감자잎벌레(Colorado potato beetle) 등과 같이 감자의 신품종 육성에 활용 가치가 있는 병원균 및 해충에 대한 저항성이 있는 것으로 알려져 있다(Chandel et al. 2015; Graham and Dionne 1961; Shi et al. 2006; Thieme et al. 2010). 이러한 유용 형질을 감자 신품종 육성에 이용하기 위해서는 교배육종이라는 전통적인 방법에 의해 이루어질 수 있으나 S. cardiophyllum의 경우 EBN (Endosperm Balanced Number)이 1로 EBN이 4인 재배종 감자와의 차이가 생리적 불화합성을 야기하여 교배육종을 불가능하게 만든다(Cho et al. 1997; Hawkes 1990; Ortiz and Ehlenfeldt 1992; Spooner et al. 2014). 이에 따라, 생리적 장벽의 극복을 위해 S. cardiophyllum과 S. tuberosum 또는 다른 근연야생종을 이용한 종간의 체세포잡종 계통을 육성하여 감자의 신품종 육성에 활용할 수 있으며, S. cardiophyllum과 S. tuberosum 간에 체세포잡종을 통한 계통 육성(Chandel et al. 2015; Shi et al. 2006; Thieme et al. 2004, 2010) 뿐만 아니라 다양한 근연야생종을 대상으로 한 체세포융합 기술이 적용되었다(Barsby et al. 1984; Kim-Lee et al. 2005; Mojtahedi et al. 1995; Puite et al. 1986; Williams et al. 1993). 따라서, 본 연구와 더불어 S. cardiophyllum을 이용한 체세포잡종 계통 육성 연구가 수행 중이며, 향후 체세포잡종 계통을 확보하였을 때 S. cardiophyllum과 S. tuberosum의 핵내 그리고 세포질 DNA가 체세포잡종 계통에 어떻게 전달되는지를 확인하기 위해, 본 연구에서는 체세포잡종 계통에서의 엽록체 DNA의 구성을 확인하기 위해 S. cardiophyllum의 엽록체 유전체 정보를 확보하고 이를 이용하여 S. cardiophyllum과 S. tuberosum 특이적 분자마커를 개발하고자 하였다.

일반적으로 속씨식물의 엽록체 유전체는 large single copy (LSC) 영역과 small single copy (SSC) 영역이 각각 하나씩 그리고 두 개의 inverted repeats (IRs) 영역으로 구성된 4분할의 원형 이중가닥의 분자구조를 가지고 있다(Yurina and Odintosova 1998). 재배종 감자 및 감자의 근연야생종을 대상으로 한 엽록체 유전체 연구의 결과가 보고된 바 있으며(Table 1), 이들 Solanum 속 식물체의 엽록체 유전체가 구조적으로 매우 유사할 뿐 만 아니라 전체 염기서열 또한 매우 유사하였다(Palmer 1991; Raubeson and Jansen 2005; Saski et al. 2005; Sugiura et al. 1998). 그러나, 유사 종들 간의 엽록체 유전체에서 유전자 재배열, 역위 등과 같이 염기서열의 구조적 변화에 의한 변이가 발생하여, 식물체 종간의 엽록체 유전체 전체를 비교하여 InDel이나 SNP와 같은 영역을 확인할 수 있다(Calsa Junior et al. 2004; Cho et al. 2015; Jheng et al. 2012; Kim et al. 2005, 2018; Kim and Park 2019, 2020a, 2020b; Park 2021b, 2022a, 2022b; Saski et al. 2005).

Table 1 . Comparative analysis of the chloroplast genome sequence of S. cardiophyllum with 12 Solanum species.

Species	Accession no.	Total Length (bp)	GC content (%)	Total No. of genes	No. of tRNA	No. of rRNA	Reference
S. cardiophyllum	MK690622	155,570	37.90	134	36	4	In this study
S. acaule	MK036506	155,570	37.84	135	36	4	Park (2022b)
S. brevicaule	MK036507	155,531	37.87	135	36	4	Park (2022a)
S. demissum	MK036508	155,558	37.87	135	36	4	Park (2021b)
S. hougasii	MF471372	155,549	37.87	135	36	4	Kim and Park (2020b)
S. stoloniferum	MF471373	155,567	37.87	135	36	4	Kim and Park (2020a)
S. chacoense	MF471371	155,532	37.89	136	36	4	Kim and Park (2019)
S. berthaultii	KY419708	155,533	37.88	137	39	4	Kim et al. (2018)
S. commersonii	KM489054	155,525	37.88	133	33	4	Cho et al. (2016)
S. nigrum	KM489055	155,432	37.90	139	39	4	Cho and Park (2016)
S. tuberosum	KM489056	155,312	37.88	130	30	4	Cho et al. (2016)
S. bulbocastanum	DQ347958	155,371	37.88	133	30	4	Daniell et al. (2006)
S. tuberosum	NC008096	155,296	37.88	131	36	4	Gargano et al. (2005)

^*The data have been partially adopted from Park (2022b)..

식물재료 및 DNA 분리

S. cardiophyllum의 엽록체 전장 유전체 분석을 위해 야생종S. cardiophyllum (PI341233)의 계통 중 하나인 SC1-9가 이용되었다. S. cardiophyllum 엽록체 유전체 정보를 기반으로 한 S. cardiophyllum특이적 분자마커 개발을 위해서는 엽록체 전장 유전체 분석이 이용된 SC1-9와 더불어 SC1-3 계통이 추가되었고, 이외에 3개의 재배종 감자 품종과 14종의 가지속 (Solanum) 야생종이 이용되었다. 경산지역에서 자체적으로 수집한 S. nigrum (SN)을 제외한 모든 식물체는 국립식량과학원 고령지농업연구소로부터 분양받아 기내식물체로 유지하며 증식하여 이용되었다. 실험에 이용된 3개 품종은 ‘대서’ (DS), ‘대지’ (DJ), ‘수미’ (SM)이고, S. nigrum을 제외한 13개의 야생종은 S. acaule (PI310970, SA), S. brevicaule (PI205 394, SB2), S. candolleanum (PI210035, SC4), S. hjertingii (PI186 559, SH1), S. hougasii (PI161174, SH2), S. iopetalum (PI230459, SI), S. jamesii (PI578326, SJ), S. kurtzianum (PI578236, SK), S. mochiquense (PI338616, SM1), S. pinnatisectum (PI190115, SP), S. stoloniferum (PI160224, SS), S. vernei (PI230468, SV2), S. verrucosum (PI160228, SV1)이다.

DNA 분리는 Genomic DNA Extraction kit (Plants) (RBC, New Taipei City, Taiwan)를 이용하여 모든 식물재료의 기내식물체를 계대배양 후 약 3주 이내의 유식물체 약 100 mg를 채취하여 수행되었다.

S. cardiophyllum 엽록체 유전체의 완성 및 분석

S. cardiophyllum의 전장 유전체 분석에는 S. cardiophyllum 계통 SC1-9의 DNA를 추출하여 이용하였으며, 전체 염기서열을 얻기 위해 Macrogen (Macrogen, Seoul, South Korea)의 Illumina Hiseq2000 (Illumina, SanDiego, CA, USA)의 플랫폼이 이용되었다. 얻어진 전체 raw data는 파이젠에 구축되어 있는 생물정보학 파이프라인(http://phyzen.com)의 de novo assembly에 의한 분석과정을 통해 완성되었다(Cho et al. 2015). 초기의 염기서열 조립은 CLC assembly cell package version 4.2.1 내의 프로그램이 이용되었다. 우선 Phred score 20 이상의 신뢰도 높은 염기서열 만을 CLC quality trim 프로그램을 이용하여 trimming 과정을 거쳐 얻은 후, CLC de novo assemble 프로그램을 이용한 dnaLCW 방법으로 조립하였다. 이후 엽록체 유래의 염기서열로 구성된 contig를 추출하고 contig 확장과 통합을 거쳐 gap-filling하여 S. cardiophyllum의 엽록체 유전체 전체를 완성하였으며, 완성된 엽록체 유전체는 trimmed read를 mapping하여 mapped read depth를 계산하고, BLASTN을 통해 확인된 homology가 가장 높은 종인 S. bulbocastanum의 엽록체 유전체(DQ347958, Daniell et al. 2006)와 BLASTZ (Schwartz et al. 2003) 분석으로 확인하였다.

S. cardiophyllum 엽록체 전장 유전체에 존재하는 유전자는 Geseq 프로그램으로 확인하였고(Tillich et al. 2017), BLAST search를 기반으로 manual curation을 수행하여 유전자 부위를 최종적으로 확인하였다. 엽록체 유전체에 포함되어 있는 유전자 부위와 모든 특성들은 CPGView 프로그램을 통해 원형의 유전자지도에 표시되었으며, 추가로 trans 및 cis slicing 유전자에 대한 지도 또한 작성되었다(Liu et al. 2023, http:// www.1kmpg.cn/cpgview/).

엽록체 유전체의 비교 및 분자마커 개발

S. cardiophyllum 엽록체 전장 유전체 정보를 이용한 계통발생학적 유전관계 분석을 위해 the National Center for Biotechnology Information (NCBI)로부터 감자의 재배종인 S. tuberosum (DQ386163)과 감자의 근연 야생종 S. acaule (MK03 6506), S. berthaultii (KY419708), S. brevicaule (MK036507), S. bulbocastanum (DQ347958), S. commersonii (NC028069), S. chacoense (MF471371), S. demissum (MK036508), S. hougasii (MF471372), S. stoloniferum (MF471373)을 포함하는 가지속 (Solanum) 15종 및 이 외 가지과(Solanaceae)의 다른 17종 등 총 32종의 엽록체 전장 유전체 염기서열을 확보하였다. 이들로부터 확인된 엽록체 코딩 서열을 MEGA6.0 프로그램으로 분석하였으며, Kimura 2-parameter 모델 기반의 Maximum likelihood 방법이 이용되었으며 1,000번의 Bootstrap 옵션을 적용하였다(Tamura et al. 2013).

S. cardiophyllum에 특이적인 분자마커의 개발은 위해 S. cardiophyllum의 전체 엽록체 염기서열을 NCBI로부터 얻은 S. berthaultii (KY419708), S. bulbocastanum (DQ347958), S. commersonii (KM489054), S. hjertingii (MK690623), S. hougasii (MF471372), S. jamesii (MK690624), S. tuberosum (KM489056), S. verrucosum (MK690625)의 전체 엽록체 염기서열과 비교하였다. ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)를 이용하여 염기서열을 다중 정렬하여 비교 분석하여 S. cardiophyllum 특이적 InDel 및 SNP를 구명하였다. 그 결과로 구명된 S. cardiophyllum 특이적 SNP를 대상으로 tetra-primer ARMS-PCR 방법을 적용하여 primer를 제작하여(Ye et al. 2001; Collins and Ke 2012), S. cardiophyllum과 S. tuberosum을 포함한 총 19개의 계통, S. cardiophyllum (SC1-9 및 SC1-3), S. tuberosum (감자품종 ‘대서’ (DS), ‘대지’ (DJ), ‘수미’ (SM)), S. nigrum (SN), S. hjertingii (SH1), S. jamesii (SJ), S. verrucosum (SV1), S. iopetalum (SI), S. mochiquense (SM1), S. pinnatisectum (SP), S. kurtzianum (SK), S. candolleanum (SC4), S. vernei (SV2), S. acaule (SA), S. stoloniferum (SS), S. hougasii (SH2), S. brevicaule (SB2)를 대상으로 Thermocycler (Biometra, Göttingen, Germany)을 이용하여 PCR (약 20 ng genomic DNA, 10 pMol each inner primer, 1 pMol each outer primer, 0.5 mM dNTPs, 1 U Taq polymerase (Genetbio, Daejeon, South Korea))을 수행하였다. PCR의 결과는 RedSafe (Intron Biotechnology, Seongnam, South Korea)를 이용하여 염색 후 1% agarose gel에서 확인하였다.

S. cardiophyllum의 엽록체 유전체

S. cardiophyllum의 전체 엽록체 유전체는 NGS 기술을 이용하여 완성되었다. 최초, NGS기반으로 얻은 데이터는 6,193,608 read를 통해 평균 301.0 bp 길이의 총 염기서열 약 1.9 Gbp를 생산하였다. 이중 약 90.5%를 대상으로 CLC quality trim 프로그램에서 전처리 과정과 Phred score 20 이상의 데이터 추출과정을 거쳐, 전체 염기서열 중 high-quality 서열인 평균 284.0 bp 길이의 총 염기서열 정보 약 1.59 Gbp를 얻었다. 이는 전체 raw data의 약 85.4%였으며, S. acaule와 S. brevicaule의 전장 유전체 분석 결과와 비교했을 때 사용된 총 염기서열이 각각 약 0.12 Gbp 및 0.87 Gbp 적었지만, 총 생산된 데이터 대비 추출 염기서열의 비율은 오히려 약 10% 많은 수준으로 데이터가 효율적으로 이용되었다(Park 2022a, 2022b). 이후, de novo assembly의 과정과 엽록체 유래의 contig 선발과 확장 및 통합, 그리고 gap-filling 과정 등을 거쳐 총 염기서열은 155,570 bp (MK690622)의 S. cardiophyllum 엽록체 전장 유전체가 완성되었으며, 결과적으로 aligned read 수는 약 36만 4천개, 엽록체 유전체의 평균 coverage는 약 660.1x, 전체 trimmed read를 완성된 전체 유전체 서열에 mapping한 결과인 read depth는 최소 400 이상으로 완성된 결과를 보여주었다. 다른 식물의 엽록체 유전체와 동일한 형태의 원형 이중가닥 분자로 85,983 bp의 LSC, 18,395 bp의 SSC, 그리고 한 쌍의 25,596 bp IRa/IRb 영역의 구조로 이루어져 있었으며, S. bulbocastanum 엽록체 유전체 염기서열(DQ347958, Daniell et al. 2006)과의 비교 및 BLASTZ 분석(Schwartz et al. 2003) 결과로도 그 유사성을 확인할 수 있었다. S. cardiophyllum의 엽록체 유전체 전체 염기서열을 대상으로 NCBI의 Blastn 분석을 한 결과 S. stenophyllidium (NC041596), S. bulbocastanum (DQ 347958)과 각각 99.94%, 99.66%의 높은 유사도를 보였으며, GC 비율도 37.90%로 매우 비슷하였다(Table 1).

S. cardiophyllum의 전체 엽록체 유전체에는 105개의 단백질 코딩, 45개의 tRNA, 8개의 rRNA를 포함한 총 158개의 유전자가 존재하였으며, 이중 11개의 단백질 코딩 유전자, 9개의 tRNA, 4개의 rRNA가 IRa 및 IRb 영역에 역배열로 중복되어 있었다(Table 1, Fig. 1). 전체 염기서열 중 59.3%가 코딩 영역으로 158개의 유전자 평균 길이가 약 583.5 bp로, 이 중 단백질 코딩 유전자, tRNA, rRNA가 각각 평균 765.1 bp, 62.2 bp, 1,132.1 bp의 크기로 51.6%, 1.8%, 5.8%의 비율로 분포되어 있으며, 이는 Solanum 속의 다른 종들과 매우 비슷한 수준이었다(Table 1). IR영역에서 중복되어 존재하는 2개의 유전자(rpl2, ndhB)를 포함하여 총 13개의 유전자(rps16, atpF, rpoC1, ycf3, clpP, petB, petD, rpl16, ndhA)는 cis-splicing 유전자이며, rps12는 tran-splicing 유전자로 확인되었다 (Fig. 2A and 2B).

Figure 1. Schematic map of overall features of the S. cardiophyllum chloroplast genome. From the center, the first track shows the dispersed repeats, which consist of direct and palindromic repeats, connected with red and green arcs. The second track shows the long tandem repeats as short blue bars. The third track shows the short tandem repeats or microsatellite sequences as short bars with different colors. The colors, the type of repeat they represent, and the description of the repeat types are as follows. Black: complex repeat; Green: repeat unit size = 1; Yellow: repeat unit size = 2. The small single-copy (SSC), inverted repeat (IRa and IRb), and large single-copy (LSC) regions are shown on the fourth track. The GC content is plotted on the fifth track. The genes are shown on the sixth track. The optional codon usage bias is displayed in the parenthesis after the gene name. Genes are color-coded based on their functional classification. The transcription directions for the inner and outer genes are clockwise and anticlockwise, respectively. The functional classification of the genes is shown in the bottom left corner.

Figure 2. Schematic map of the cis- (A) and trans- (B) splicing genes in the S. cardiophyllum chloroplast genome. The 13 cis-splicing genes are arranged from top to bottom based on their order on the chloroplast genome. The gene names are shown on the left, and the gene structures are on the right. The exons are shown in black; the introns are shown in white. The arrow indicates the sense direction of the gene. Lengths of exons and introns are not drawn to scale. The trans-splicing gene rps12 in the chloroplast genome has three unique exons. Two of them are duplicated as they are located in the IR regions.

엽록체 유전체 비교 및 계통수

S. cardiophyllum의 전체 엽록체 유전체와 가지과의 다른 32종의 전체 엽록체 유전체의 코딩 서열을 기반으로 계통수를 작성하였다(Fig. 3). 그 결과, S. cardiophyllum은 감자 재배종 S. tuberosum을 포함하는 다수의 가지속(Solanum) 종들과 동일한 그룹에 존재함을 확인하였으며, 그룹 내에서는 S. bulbocastanum과 유연관계가 가장 가까우며, 상대적으로 까마중(S. nigrum), 가지(S. melongena), 토마토(S. lycopersicum)와는 다소 유연관계가 먼 것을 확인하였다. 또한, S. cardiophyllum의 전체 엽록체 유전체 염기서열을 감자 재배종 및 7종의 근연야생종 전체 엽록체 유전체 염기서열을 EMBL의 ClustalW2 (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)로 다중 정렬한 결과 S. cardiophyllum 특이적인 13개의 SNP를 확인하였다(Fig. 4). S. cardiophyllum 특이적 InDel은 존재하지 않았고 특이적 SNP의 수는 상대적으로 매우 적었는데, 이는 다중 정렬에 S. cardiophyllum의 유전체와 유사도가 매우 높은 S. bulbocastanum이 포함된 결과로 유추할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 동일한 가지속에 속한 재배종 감자와 감자 근연야생종들이 다양한 유전적 요인에 의해 발생할 수 있는 변이에 의해 S. cardiophyllum 특이적인 SNP가 존재하며, 이를 활용한 S. cardiophyllum 특이적 분자마커의 개발을 가능하게 하였다 (Cho and Park 2016; Chung et al. 2006; Kim et al. 2018; Kim and Park 2019, 2020a, 2020b; Park 2021b, 2022a, 2022b). 13개의 SNP 중, 6개는 유전자 영역에 7개는 유전자 간 영역에 분포하고 있었다. 2개의 유전자 영역에 존재하는 SNP의 경우 Cis-splicing 유전자의 intron에 존재하는 것으로 확인되었다.

Figure 3. Maximum likelihood phylogenetic tree of S. cardiophyllum with 32 species belonging to the Solanaceae family based on the chloroplast protein-coding sequences. Numbers in the nodes are the bootstrap values from 1,000 replicates. The data are partially adopted from Park (2021a)

Figure 4. Multiple sequence alignments of the intergenic or intragenic regions containing SNPs used to develop the PCR-based markers. The chloroplast genome sequences of S. cardiophyllum (SC1_9: MK690622), S. jamesii (SJ8: MK690624), S. bulbocastanum (Sblb: DQ347958), S. berthaultii (Sber: KY419708), S. tuberosum (Stub: KM489056), S. verrucosum (SV1_4: MK690625), S. hougasii (SH2 _10: MF471372), S. hjertingii (SH1_16: MK690623), and S. commersonii (Scmr: KM489054) were used and listed from top to bottom in each region of the SNPs. The regions of the SNPs detected on S. cardiophyllum chloroplast genome are in bold font, highlighted and underlined

S. cardiophyllum 특이적 분자마커 개발

S. cardiophyllum, 재배종 감자, 감자의 근연야생종 등 총 9종의 전체 엽록체 유전체 염기서열의 다중 정렬로 확인한 S. cardiophyllum 특이적 SNP는 S. cardiophyllum 특이적인 분자마커 개발에 이용되었다. 존재하는 S. cardiophyllum 특이적 SNP 영역을 기준으로 SNP를 포함하는 DNA 단편과 SNP 영역을 대상으로 S. cardiophyllum 특이적 또는 S. cardiophyllum을 제외한 Solanum 종 특이적인 DNA 단편을 증폭할 수 있는 tetra-primer ARMS-PCR 방법(Collins and Ke 2012; Ye et al. 2001)을 적용하여 primer를 제작하였다(Table 2). Tetra-primer ARMS-PCR 방법은 다양한 생명체를 대상으로 SNP가 존재하는 계통간의 비교를 PCR 방법으로 손쉽게 구명할 수 있는 방법으로 널리 활용되고 있으며(Kou et al. 2017; Mahmoudi et al. 2019; Zou et al. 2018), 본 연구에서도 간편히 큰 비용을 들이지 않고 Solanum 종간의 구별이 가능한 SNP 정보를 활용한 PCR 기반의 S. cardiophyllum 특이적인(Fig. 5B, 5C, 5D) 또는 비특이적인(Fig. 5A) 4개의 분자마커를 개발할 수 있었다. 이중 SC1_SNP2 (Fig. 4 and Fig. 5A)와 SC_SNP6 (Fig. 4 and Fig. 5B)은 각각 rps16과 trnQ 및 rpoB와 trnC 유전자 사이에 존재하는 SNP 기반으로 개발되었으며, SC_SNP9 (Fig. 4 and Fig. 5C)는 clpP 유전자 내의 Intron 영역에, SC1_SNP10 (Fig. 4 and Fig. 5D)은 petD 유전자의 Exon 영역에 존재하는 SNP 기반으로 개발되었다.

Table 2 . Primer information used to generate S. cardiophyllum-specific markers.

SNP	System	Primer sequence (5’ → 3’)	Touchdown PCR	Annealing temperature (°C)	Amplicon size
SC1-9_SNP2	Forward inner primer	AAAAGCAATCTATATTGTCAGAGAATACAG	No	58°C	256 bp (from two outer primers) 136 bp (T allele non-specific to S. cardiophyllum)
	Reverse inner primer	GTTCGAATCCTTCCGTCCCAGAACGTA
	Forward outer primer	AAACGATTCATCGAAGAAAAAAATCAGA
	Reverse outer primer	ATTTGGGCTAGAGTTGACAAACAAACAA
SC1-9_SNP6	Forward inner primer	TTTTATTGTCGTTTTATGTTCTATTCGAGG	Yes	72°C to 63°C	336 bp (from two outer primers) 210 bp (T allele specific to S. cardiophyllum)
	Reverse inner primer	GTTTTCGGAGAGCACAACCTGTGTCGA
	Forward outer primer	TCATTGTTCAAAAAATGATTCGCAGAGA
	Reverse outer primer	CCCCCCAAGATAAATTGTTAGACGGATA
SC1-9_SNP9	Forward inner primer	TTATTAGAGTTGAGATAACTTTGCTCGC	No	62°C	306 bp (from two outer primers) 169 bp (C allele specific to S. cardiophyllum)
	Reverse inner primer	TTTTTTCTTTGTAAAGAGATCCTAATCGT
	Forward outer primer	TCTGTTTCATCTTTTTAGGTTTATGCTC
	Reverse outer primer	TCAATTAGAATAATTTATGGTTGGCTTG
SC1-9_SNP10	Forward inner primer	ATGTTAATAAATTCCAAAATCCATTTAGC	Yes	72°C to 63°C	404 bp (from two outer primers) 252 bp (T allele specific to S. cardiophyllum)
	Reverse inner primer	AAAAGACAGTCGTCGCTACTGGAAGA
	Forward outer primer	GTAATGTAGGCTTAGCCGTTTTAGAACC
	Reverse outer primer	TTCGCTTTGAAGAAACTATTCCCTAGAT

Figure 5. PCR-based markers for the discrimination of S. cardiophyllum from other Solanum species. A: SC1-9_SNP2. B: SC1-9_SNP6. C: SC1-9_SNP9. D: SC1-9_SNP10. The markers SC1-9_SNP6, SC1-9_SNP9, and SC1-9_SNP10 are positively specific to S. cardiophyllum, and the marker SC1-9_SNP2 is negatively specific to S. cardiophyllum. SC1-9 and SC1-3 indicate two different lines of S. cardiophyllum (PI341233). SN is S. nigrum collected in Gyeongsan, South Korea. M, DS, DJ, SM, SH1, SJ, SV1, SI, SM1, SP, SK, SC4, SV2, SA, SS, SH2, and SB2 indicate a size marker ladder, potato varieties ‘Daeseo’, ‘Daeji’, ‘Sumi’, S. hjertingii (PI1 86559), S. jamesii (PI578326), S. verrucosum (PI160228), S. iopetalum (PI230459), S. mochiquense (PI338616), S. pinnatisectum (PI190115), S. kurtzianum (PI578236), S. S. candolleanum (PI210035), S. vernei (PI230468), S. acaule (PI310970), S. stoloniferum (PI160224), S. hougasii (PI161174), and S. brevicaule (PI205394), respectively. Yellow and red arrows indicate negative and positive bands on S. cardiophyllum, respectively

감자의 신품종 육성을 위하여 다양한 유용 형질을 보유한 감자의 근연야생종을 활용한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. 하지만, 많은 근연야생종이 재배종 감자와 배수성 및 EBN의 차이로 인하여 교배육종의 방법으로는 유용 형질의 도입이 쉽지 않아 체세포융합에 의한 체세포잡종을 만들어 신품종 육성에 활용하고 있으며, 그 과정에서 체세포잡종의 유전자형 확인이 필요하다. 유전자형의 확인은 서로 다른 종의 염색체의 조합 뿐만 아니라 미토콘드리아 및 엽록체 유전체의 전달 확인도 필요한데, 다양한 식물종의 체세포융합 과정에서 미토콘드리아 유전체는 높은 빈도의 재조합 발생이 이루어지는 것으로 알려져 있으나 엽록체 유전체의 경우 한 쪽의 엽록체 유전체만 무작위로 전달이 되는 경우 뿐 만 아니라 양친의 유전체 모두가 전달되는 경우도 있었다(Chen et al. 2013; Cho et al. 2016; Lössl et al. 2000; Mohapatra et al. 1998; Smyda-Dajmund et al. 2016; Wang et al. 2011; Xiang et al. 2004).따라서, 본 연구의 결과인 SNP 기반의 분자마커는 감자의 신품종을 육성 과정에서 S. cardiophyllum을 이용한 체세포잡종의 육성과 S. cardiophyllum과 S. tuberosum 유래의 엽록체 유전체의 유전자형 구별에 이용될 수 있을 것이다.

멕시코 유래의 2배체 감자 근연야생종 Solanum cardiophyllum은 감자역병, 감자바이러스Y, 콜로라도감자잎벌레 등과 같은 병원균 및 해충에 대한 저항성을 가지고 있어 감자의 신품종 육성에 이용되고 있다. 재배종 감자에 이러한 형질을 도입하기 위해서는 전통적인 교잡육종에 의해 이루어질 수 있으나, 재배종 감자와 근연야생종과의 서로 다른 EBN에 따라 제한적이며, S. tuberosum과 S. cardiophyllum 간에도 생리적 불화합성이 존재한다. 따라서, 이러한 생리적 장벽의 극복을 위해 체세포융합에 의한 체세포잡종 계통을 육성하고 이를 감자 신품종 육성에 활용할 수 있는데, 분자마커는 적절한 체세포잡종 계통 선발에 필요하다. 이에, 본 연구에서는 S. cardiophyllum의 전체 엽록체 유전체 정보를 구명하고 8개의 다른 Solanum 종의 전체 엽록체 유전체 정보와 비교하여 S. cardiophyllum 특이적인 분자마커를 개발하였다. S. cardiophyllum의 전체 엽록체 유전체의 길이는 155,570 bp였으며, 그 구조와 유전자 구성은 다른 Solanum 종들과 매우 유사하였고 가지과에 속해 다른 32개의 종들과의 계통수 분석을 통해 예상했던 바와 같이 다른 Solanum 종과 같은 그룹에 속해 있고 S. bulbocastanum과의 가장 근접한 유연관계를 확인하였다. S. cardiophyllum의 전체 엽록체 유전체와 8개 다른 Solanum 종의 전체 엽록체 유전체의 다중 정렬 결과로 총 13개의 S. cardiophyllum 특이적인 SNP 영역을 확인하였으며, 이 정보를 이용하여 4개의 PCR 기반 분자마커를 개발하였다. 본 연구의 결과는 S. cardiophyllum의 진화적 측면에서의 연구와 S. cardiophyllum를 이용한 감자 신품종 육성을 위한 연구에 기여를 할 수 있을 것이다.

이 성과는 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임(No. NRF-2021R1F1A1045981).