J Plant Biotechnol 2019; 46(1): 45-55
Published online March 31, 2019
https://doi.org/10.5010/JPB.2019.46.1.045
© The Korean Society of Plant Biotechnology
나카무라마사야, 라종환, 김주성
제주대학교 생명자원과학대학 친환경농업연구소
Correspondence to : e-mail: aha2011@jejunu.ac.kr
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The
Keywords ADH, ALDH, Antioxidant,
제주도 특산물의 하나인 당유자(
따라서 본 연구에서는 당유자 잎을 에탄올 농도별(20%, 40%, 60%, 80%, 100%)로 추출하여 항산화능, 페놀 함량, 항당뇨 효과, 미백 효과, 항균 효과, 그리고 이전에 보고된 바가 없는 알코올 분해능 활성에 초점을 맞추어 당유자 잎의 생리활성을 포괄적으로 비교 분석함과 동시에 제주도 특산물로써 잎을 이용한 신소재 개발 원료로서의 이용 가능성을 탐색하고자 하였다.
본 연구에서 사용한 당유자 잎은 2014년 10월초에 수확한 것을 제주특별자치도 식물자원연구소에서 구입하여 실험에 이용하였다. 이물질을 제거한 후 실온에서 10일동안 완전하게 건조시켜 믹서기로 분쇄하고 중량 10배의 용매(0%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100% 에탄올)에 담가 90분 동안 25°C에서 초음파 추출기(Power sonic 520, Hwashin Co., Yeongcheon, Korea)를 이용하여 추출하였다. 추출된 용액을 Whatman No.2 여과지(Whatman International Ltd, Kent, England, UK)에 여과하여 감압농축기(Hei-VAP Precision 280 rpm; Heldolph, Germany)를 이용하여 농축하였다. 농축된 시료는 -20°C에서 보관하면서 분석실험을 실시하였다.
총 페놀 함량을 측정하기 위하여 Singleton and Rossi (1965)의 실험 방법을 변형하여 수행하였다. 증류수로 희석된 샘플 용액에 50 µL의 Folin–Ciocalteu 시약을 첨가하여 5분 동안 실온에서 반응시켰다. 반응 후 300 µL의 20% sodium carbonate를 넣고, 20분 동안 반응시킨 뒤 1 mL의 증류수를 첨가하여 725 nm에서 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 샘플시료의 총 페놀 함량은 표준물질로 사용된 gallic acid의 표준액으로 작성한 검량선에 따라 계산하여 garlic acid equivalent (GAE, mg GAE/g)로 나타내었다.
1,1-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)를 이용한 항산화 활성 측정은 Musa et al. (2013)의 방법을 변형하여 수행하였다. 메탄올로 희석된 200 µL 샘플 용액을 96-well microtiter plate 두 번째 줄에 넣고 나머지는 100 µL의 메탄올을 가하였다. 두 번째 줄에서 마지막 줄까지 단계적으로 희석하여(1.56-200 µg/mL) 첫 번째 줄은 음성대조군으로 사용하였다. 희석된 용액에 100 µL의 DPPH (0.4 mM)을 첨가하여 암상태로 실온에서 30분 동안 반응시킨 후 490 nm에서 microplate reader (iMark; Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 소거능은 아래의 식으로 계산하여 50%가 되는 샘플량의 농도를 RC50 (µg/mL)로 나타내었고 양성대조군으로 L-ascorbic acid, α-tocopherol, butylated hydroxytoluene (BHT)을 사용하였다.
A: absorbance of sample solution, B: absorbance of control
2,2-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazothiazoline-6-sulfornic acid (ABTS)을 이용한 항산화 활성값 측정은 Re et al. (1999)의 실험 방법을 변형하여 수행하였다. 7 mM ABTS과 2.45 mM potassium persulfate를 혼합하여 암조건의 실온에서 16 시간동안 반응시킨 뒤 분광광도계(UV-1800, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)를 이용하여 흡광도 값이 750 nm에서 1.2 ∼ 1.3이 되도록 sodium phosphate buffer를 첨가하여 조절하였다. 준비된 샘플과 160 µL ABTS 용액을 96-well microtiter plate 두 번째 줄에 넣고 나머지는 100 µL의 증류수를 첨가하였다. 두 번째 줄에서 마지막 줄까지 단계적으로 희석하여(1.56 ∼ 200 µg/mL) 첫 번째 줄은 음성대조군으로 사용하였고, 10분 동안 반응시킨 후 750 nm로 세팅된 microplate reader를 이용하여 측정하였다. 소거능은 DPPH radical 소거능 측정과 같은 식으로 계산하였으며 50%가 되는 샘플량의 농도를 RC50 (µg/mL)로 나타내었고, 양성대조군으로 L-ascorbic acid, α-tocopherol를 사용하였다.
샘플의 환원력을 측정하기 위하여 Oyaizu (1986)의 방법을 약간 변형하여 실험을 수행하였다. 농도별(100, 200, 300 µg/mL) 샘플용액에 500 µL의 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 6.6)와 potassium fericyanide를 첨가하여 50°C에서 20분 동안 반응시켰다. 이 용액에 250 µL의 10% trichloroacetic acid를 넣고, 상등액을 microtube에 분주하여 0.1% ferric chloride를 첨가하였다. 마지막으로 분광광도계를 이용하여 흡광도 값을 조사하였다. 환원력은 흡광도 값으로 나타내었고, 양성대조군으로 α-tocopherol를 사용하였다.
α-Glucosidase 저해활성을 측정하기 위하여 Oki et al. (1999)의 방법을 변형하여 수행하였다. 200 µL의 sodium phosphate buffer (0.2 M, pH 6.8)와 50 µL의 α-glucosidase 효소액(0.5 U/mL)을 순서대로 50 µL의 샘플 용액과 혼합하여 15분 동안 37°C에서 반응시켰다. 이어서 기질로 100 µL의 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (
A: absorbance of sample solution, B: absorbance without treating
Tyrosinase 저해활성은 Huang et al. (2013)의 방법을 변형하여 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.8)로 희석된 샘플 용액에 기질로 40 µL의 L-tyrosine (1.66 mM), 효소로 tyrosinase (125 U/mL)를 순서대로 넣고, 37°C에서 20분 동안 반응시켰다. 실험 종료 후 microplate reader를 이용하여 495 nm에서 흡광도를 측정하였다. 동시에 L-tyrosine 대신에 L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-dopa)를 기질로 이용하였으며 α-glucosidase 저해활성 측정과 같은 식으로 계산하여 백분율로 나타내었고, 양성대조군으로 arbutin를 사용하였다.
항미생물 활성 측정은 Kobayashi et al. (1995)의 two-fold dilution법을 변형하여 항균활성 정도를 분석하였으며 그람 양성균으로
Alcohol dehydrogenase (ADH) 활성을 측정하기 위하여 수행된 실험은 Shim et al. (2013)이 고안한 방법을 변형하여 조사하였다. 100 µL의 희석된 샘플 용액에 ethanol과 nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) 시약을 가하여 혼합한 뒤 glycine- NAOH (pH 8.8)을 첨가하여 1.8 mL가 되도록 조절하였다. 그 다음 혼합한 용액을 25°C에서 10동안 반응시킨 후 ADH (10 U/mL)을 첨가하고 분광광도계를 이용하여 340 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Acetaldehyde dehydrogenase (ALDH) 활성 측정은 Tottmar et al. (1973)의 방법을 변형하여 수행하였다. 50 mM sodium phosphate buffer, 5 mM acetaldehyde, 0.5 mM NAD 용액, 0.1 mM ALDH을 순서대로 첨가하였다. 여기에 200 µL의 샘플 시료를 첨가하여 37°C에서 10분 동안 반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 370 nm에서 흡광도를 측정하였다. ADH 및 ALDH 활성 측정은 이전 실험을 통하여 300 µg/mL의 농도로 설정하고 아래의 식을 이용하여 계산하였으며 무처리군을 control로 이용하여 100%로 나타내어 ADH 및 ALDH 활성을 비교 분석하였다.
A: absorbance of sample solution, B: absorbance without treating sample solution
모든 데이터는 최소 2 반복으로 이루어졌으며 실험결과는 평균과 표준편차로 표기했고 SPSS (Statistical Package for the Social Sciences, ver. 18.0)를 이용하여 one-way ANOVA 분석을 실시하였다. 평균값의 통계적 유의성은
용매 추출은 식물체의 생리활성 물질을 얻는데 가장 많이 사용되는 방법으로 식물 종류, 추출방법 및 시간, 용매 극성 등에 따라 다르며 기본적으로 일정한 추출 시간과 온도하에서는 사용하는 용매의 종류와 식물체가 가진 물질의 생리활성을 결정하는 큰 요인이 된다. 따라서 수율은 용매와 밀접한 관계가 있으며 효율적인 추출을 위하여 실험설계가 중요한 요소가 된다(Fatiha et al. 2012). 에탄올 농도별 당유자 잎의 추출수율은 Table 1에 나타내었다. 20% 에탄올 추출물이 27.62 ±0.91%로 가장 높은 수율을 나타냈으며 40%, 80%, 60%, 물, 100% 에탄올 추출물 순으로 유의적인 수율 감소가 관찰되었다. 특히 100% 에탄올 추출물이 3.82±0.31%로 다른 추출물보다 상당히 차이가 나타났으며 비교적 에탄올과 물의 혼합추출에서 높은 수율이 확인되었다. 이는 약용 허브인
Table 1 Extraction yields and total phenolic content of the
Extracts | Yield (%)a | Total phenol (mg GAE/g)b |
---|---|---|
Distilled water extract | 20.70±1.36 c | 628.27±28.11 a |
20% ethanol extract | 27.62±0.91 a | 486.32±19.40 c |
40% ethanol extract | 23.77±0.98 b | 557.92±20.30 b |
60% ethanol extract | 21.22±1.60 c | 543.60±10.53 b |
80% ethanol extract | 23.75±0.29 b | 466.40±3.50 c |
100% ethanol extract | 3.82±0.31 d | 568.82±30.42 b |
Values are mean value ± standard deviation (SD) of duplicate determinations. The values with the same superscript letter along the same column are not significantly different (
aPercentage yield from the dried plant material
bTotal phenolic content analyzed as gallic acid equivalent (GAE) mg/g of extract
페놀 화합물은 예로부터 인체에 주요한 역할을 하는 물질로 다양한 생리활성에 작용하는 것으로 알려져 왔으며 지금까지 수 많은 연구가 수행되어 왔다(Ho et al. 2018). 본 실험에서도 페놀 함량과 실시한 생리활성 사이에 연관이 있는지를 알아보기 위하여 총 페놀 함량을 측정하여 mg GAE/g로 나타내었다(Table 1). 앞서 고찰한 수율과 반대로 물(628.27±28.11), 100% 에탄올(568.82±30.42) 추출물에서 높은 함량을 나타냈으며 다음으로 40%(557.92±20.30), 60%(543.60±10.53), 20% (486.32±19.40), 80% 에탄올 추출물(466.40±3.50)의 순이었다. 당유자 과피를 극성순으로 분획하여 우수한 활성을 보인 ethylacetate 분획물의 페놀 함량이 163.19±2.34 mg GAE/g이라는 보고(Ko and Kim, 2018)와 당유자 잎 ethylacetate 분획물에서 202.1±0.8 mg GAE/g로 가장 높게 나타났다고 하여(Kim et al. 2008) 측정 방법이 약간 다른 것을 고려하여도 이들 실험 결과와 비교해볼 때 높은 페놀 함량을 나타내는 것을 알 수 있었다.
라디칼은 불안정한 것으로 알려져 있지만 DPPH 라디칼은 분자 내 라디칼을 보유하고 있으며 다른 라디칼과 결합함으로써 complex을 형성하기에 비교적 안정하고 항산화제부터 전자 및 수소 분자를 받으면 라디칼이 소거되어 특유의 보라색이 노란색으로 엷어지는데(Ju et al. 2009), 그 소거능을 RC50로 나타내었다(Table 2). 모든 추출물에서 대조군으로 사용된 L-ascorbic acid, α-tocopherol, BHT보다 높은 활성을 보이지 않았으며 80% 에탄올 추출물까지 에탄올 농도가 증가할수록 소거능이 증가하는 것으로 나타났다. 특히 80% 에탄올 추출물에서 174.32±8.45 µg/mL로 가장 높은 소거능을 나타냈으며 100% 에탄올 추출물에서는 500 µg/mL 이상의 가장 낮은 활성을 보였다. 또한 물 추출물에서 375.2±2.99 µg/mL로 나타났는데 Lim et al. (2006)은 당유자 미숙과 hexane, chloroform, ethylacetate, butanol, 그리고 물 분획물 중에서 물 분획물이 DPPH 소거능이 가장 높아 α-tocopherol과 유사한 활성을 보였다고 보고하였는데, 추출 방법 특히 본 실험에서는 잎을 사용했지만 껍질을 포함한 과실을 사용했기 때문이라 생각된다. 또한 페놀 함량과 라디칼 소거능은 비례한다고 보고 되었으나(Al-Dabbagh et al. 2018), 본 연구에서는 DPPH radical 소거능과 페놀 함량과의 상관 관계는 r=0.463으로 낮게 나타나(
Table 2 The result of the DPPH and ABTS radical scavenging in
Extracts | DPPH RC50 (μg/mL)a | ABTS RC50 (μg/mL)a |
---|---|---|
Distilled water extract | 375.21±2.99 d | 180.42±4.95 b |
20% ethanol extract | 240.26±10.05 c | 218.02±2.38 b |
40% ethanol extract | 192.55±0.95 bc | 300.67±9.54 c |
60% ethanol extract | 196.38±2.66 bc | 311.78±15.03 c |
80% ethanol extract | 174.32±8.45 b | 482.73±13.51 d |
100% ethanol extract | > 500 e | > 500 e |
L-Ascorbic acid | 1.21±0.04 a | 3.48±0.02 a |
α-Tocopherol | 3.98±0.01 a | 11.72±0.04 a |
Butylated hydroxytoluene | 42.66±1.81 a |
Values are mean value ± standard deviation (SD) of duplicate determinations. The values with the same superscript letter along the same column are not significantly different (
aRC50: Amount required for a 50% reduction of DPPH (ABTS) free radicals after 30 minutes
Table 3 Reducing power ability of the
Extracts | 100 μg/mL | 200 μg/mL | 300 μg/mL |
---|---|---|---|
Distilled water extract | 0.097±0.004 b | 0.189±0.002 b | 0.269±0.07 b |
20% ethanol extract | 0.075±0.004 cd | 0.157±0.007 cd | 0.214±0.013 c |
40% ethanol extract | 0.087±0.004 bc | 0.177±0.007 bc | 0.231±0.004 bc |
60% ethanol extract | 0.076±0.008 cd | 0.180±0.006 bc | 0.231±0.022 bc |
80% ethanol extract | 0.080±0.003 bcd | 0.158±0.008 cd | 0.215±0.008 c |
100% ethanol extract | 0.063±0.006 d | 0.146±0.006 d | 0.234±0.002 bc |
α-Tocopherol | 0.248±0.006 a | 0.603±0.029 a | 0.950±0.026 a |
Values are mean value ± standard deviation (SD) of duplicate determinations. The values with the same superscript letter along the same column are not significantly different (
Table 4 α-Glucosidase inhibitory activity of the
Extracts | IC50 (μg/mL)a |
---|---|
Distilled water extract | >500 d |
20% ethanol extract | >500 d |
40% ethanol extract | >500 d |
60% ethanol extract | 416.35±11.07 c |
80% ethanol extract | 336.57±2.03 b |
100% ethanol extract | 418.18±3.56 c |
Acarbose | 83.81±3.14 a |
Values are mean value ± standard deviation (SD) of duplicate determinations. Values with the same superscript letter along the same column are not significantly different (
aIC50: Concentration requires to reduce 50% of α-glucosidase (μg/mL).
Table 5 Minimum inhibitory concentrations (MIC) of the
Minimum inhibitory concentration (μg/mL)a | ||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
H2Ob | 20E | 40E | 60E | 80E | 100E | Tet | ||
Gram positive bacteria | B.c | -c | - | 1000 | 125 | 250 | 250 | 8 |
S.a | - | - | - | 500 | 500 | - | 8 | |
B.s | - | - | - | 500 | 500 | - | 8 | |
K.r | - | - | - | 1000 | 500 | - | 8 | |
M.l | - | - | - | 500 | 500 | - | 8 | |
Gram negative bacteria | E.cl | - | - | - | - | - | - | 8 |
K.p | - | - | - | - | - | - | 8 | |
E.c | - | - | - | - | - | - | 8 | |
P.a | - | - | - | - | 1000 | - | 8 | |
P.v | - | - | - | 1000 | 250 | - | 8 | |
Yeast | S.c | - | - | - | - | - | - | |
P.j | - | - | 1000 | 1000 | 1000 | - | ||
C.a | - | - | 1000 | 1000 | 1000 | - |
B.c:
aThe MIC value against bacteria was determined through the serial two-fold dilution method. The growth of the bacteria was evaluated by the degree of turbidity of the culture with the naked eye in twelve hours.
bH2O, distil water extract; 20E, 20% ethanol extract; 40E, 40% ethanol extract; 60E, 60% ethanol extract; 80E, 80% ethanol extract, 100E, 100% ethanol extract; Tet, tetracycline
c- : >1000 μg/mL
Table 6 Correlation analysis between the total phenol content and each assay
TPC | RDP | DPPH | ABTS | α-Glu | L-Tyro | L-Dopa | ADH | ALDH | |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
TPC | 1 | 0.848*** | 0.463 | -0.124 | 0.33 | -0.691** | -0.486 | -0.351 | -0.197 |
TPC, total phenol content assay; RDP, reducing power assay; DPPH, DPPH radical scavenging assay; ABTS, ABTS radical scavenging assay; α-Glu, α-glucosidase inhibitory assay; L-Tyro, L-tyroine inhibitory assay; L-Dopa, L-dopa inhibitory assay; ADH, alcohol dehydrogenase assay; ALDH, aldehyde dehydrogenase assay
***, significance
**, significance
ABTS radical 소거능은 간편하게 샘플의 radical 소거능을 측정할 수 있는 방법으로, 안정한 radical이기 때문에 많이 사용되며 potassium persulfate를 산화제로 사용하여 발생한 ABTS radical과 항산화 효과가 있는 물질이 만나면 흡광도가 감소하게 되며 control과 비교하여 그 차이를 일정한 시간 후에 734 nm 부근에서 측정한다(Schaich et al. 2015). 당유자 잎의 에탄올 농도별 추출물의 ABTS radical 소거능은 Table 2에 나타내었다. 에탄올 농도가 증가할수록 활성이 감소하는 경향을 보여 물>20%>40%>60%>80%>100% 에탄올 추출물 순으로 나타났다. DPPH radical 소거능과 같이 100% 에탄올 추출물에서 500 µg/mL 이상의 낮은 활성이 나타났으며 100% 에탄올 추출에서는 radical 소거능에 관여하는 물질이 덜 추출된다는 것이 확인되었고 백부자(
환원력 측정은 potassium ferricyanide (Fe3+)가 ferrocyanide (Fe2+)로 환원되는 정도를 조사하여 환원력이 클수록 녹색에 가깝게 발색된다. 활성 정도는 샘플이 가진 reductone과 관계가 있으며 수소 분자를 공여함으로써 연쇄반응을 방지하므로 항산화 활성이 큰 물질일수록 높은 흡광도 값을 나타낸다(Saha and Paul, 2014). 당유자 잎의 환원력을 평가한 결과(Table 3), 농도 의존적으로 환원력을 나타내어 물 추출물이 100, 200, 300 µg/mL에서 각 0.097±0.004, 0.189±0.002, 0.269±0.07으로 가장 우수하게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 그리고 에탄올 농도가 증가함에 따라 활성이 감소하는 경향을 보여 40%, 60% 에탄올 추출물이 모든 첨가 농도에서 비교적 높은 활성을 나타냈으나 20%, 100% 에탄올 추출물에서는 낮은 활성을 나타냈다. 하지만 Padmanabhan and Jagle (2012)가 보고한 약용식물인
α-Glucosidase는 식후 탄수화물(다당류)이 α-amylase에 의해 변형된 이당류를 단당류로 가수분해할 때 관여하는 효소이며 그 후 소장에서 흡수되어 각 장기에서 사용되지만 빠르게 흡수되면 혈당치가 높아져 다양한 질환을 유발하기도 한다. α-Glucosidase 저해제로 acarbose, miglitol, voglibose 등이 사용되고 있으나 부작용이 보고되어 천연 추출물에서 α-glucosidase를 저해하는 물질을 찾아내는 연구가 활발히 진행되고 있다(Taha et al. 2016). α-Glucosidase 저해활성을 측정하여 IC50로 나타낸 결과 80% 에탄올 추출물에서 336.57±2.03 µg/mL로 다른 농도와 비교하면 뚜렷하게 높게 나타났으며 60%, 100% 에탄올 추출물에서는 비슷한 활성을 가지는 것으로 나타났다(Table 4). 물, 20%, 40% 에탄올 추출물의 경우 500 µg/mL 이상으로 매우 낮게 나타나서 대조군으로 사용된 acarbose와 비교해볼 때 모든 추출 농도에서 뛰어난 활성이 보이지 않았다. 이는 황칠 잎의 에탄올 농도별 추출에서 60%, 80%, 100% 에탄올 추출물이 물, 20%, 40% 에탄올 추출물에 비해 월등히 높은 활성을 나타낸 것과 일부 일치하였지만 본 실험에서는 페놀 함량과의 연관성이 r=0.330으로 유의성이 없게 나타났으며(Table 6), 황칠 잎 추출물에서 -0.614 (
피부를 자외선이나 외부의 자극으로부터 보호하는 역할을 하는 멜라닌은 피부 안의 멜라노사이트에서 생합성되며 tyrosine이 활성효소인 tyrosinase 그리고 기질로 L-dopa, L- tyrosine과 반응하여 생성된다. 하지만 멜라닌이 과하게 생성되면 피부의 신진대사가 느려져 기미, 주근깨를 형성하며 피부암을 유발하는 큰 요인이 된다. 따라서 tyrosinase를 저해하여 멜라닌의 과잉생산을 억제하는 천연물질을 찾아낼 필요가 있다(Aumeeruddy-Elalfi et al. 2016). L-Tyrosine, L-dopa를 기질로 하여 tyrosinase 저해활성을 조사한 결과는 Figure 1과 같다. L-Tyrosine을 기질로 한 경우 에탄올 농도가 증가할수록 활성이 증가하여 80% 에탄올 추출물이 가장 우수한 활성을 보여 500 µg/mL의 농도에서 80% 가까운 높은 수치를 나타냈다. 80% 에탄올 추출물에 비하여 100% 에탄올 추출물에서는 오히려 저해능이 감소하는 경향이 나타났지만 40%, 60%, 80%, 100% 에탄올 추출물에서 대조군으로 사용된 arbutin보다 뛰어난 결과를 보였으며 저농도 에탄올로 추출할 경우에도 어느 정도 저해활성이 있는 것을 확인할 수 있었다. 이는 제주도에서 자생하는 조릿대 추출물의 tyrosinase 저해활성이 20% 에탄올부터 추출 농도가 높아짐에 따라 활성이 증가하여 60% 에탄올을 기준으로 감소한다는 보고(Ra et al. 2017)와 일부 일치하였다. L-Dopa를 기질로 하여 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 L-tyrosine을 기질로 한 경우와 유사한 경향이 나타났으나 물, 20%, 80%, 100%, 40% 에탄올 추출물 순서였으며 60% 에탄올이 다른 추출물보다 높은 활성을 나타냈을 뿐만 아니라 arbutin보다 더 높은 저해 활성을 보여주었다. 이 결과는 10종의 약용식물을 메탄올로 추출하여 500 µg/mL 농도에서 가장 우수한 활성을 나타낸
Tyrosinase inhibitory activity for using L-tyrosine (A) and L-dopa (B) as substrate of the
미생물에 의하여 발생하는 식중독이나 감염성 질환으로 인한 피해가 최근 들어 동반상승하고 있는 실정이며 이들 원인균의 피해를 방지하기 위한 항균성 식품개발과 강한 항균성을 가진 물질을 식물에서 얻고자 하는 연구가 수행되고 있다(Bensizerara et al. 2013). 당유자 잎의 에탄올 농도별 추출물의 미생물에 대한 저해활성은 Table 5와 같이 40% 에탄올 추출물이
간으로 운반된 알코올은 ADH, ALDH와 같은 효소 그리고 보효소인 NAD에 의하여 산화되며 ADH는 알코올을 acetaldehyde로, ALDH는 acetaldehyde를 acetic acid로 단계적으로 전환하여 결국 이산화탄소와 물로 되어 인체에 무해하게 분해된다. 그러나 다량의 알코올 그리고 만성적 섭취는 이들 효소의 활성을 억제하며 분해 능력을 약하게 시키므로 간 장해를 비롯한 다양한 질병을 일으키는 것으로 알려졌다(Matsumoto 2011). 따라서 ADH와 ALDH의 활성을 촉진하는 물질을 찾기 위하여 당유자 잎 추출물의 ADH 및 ALDH 활성을 측정하여 Figure 2에 나타내었다. ADH 활성에서는 물<20%<40%< 100%<80%<60% 에탄올 추출물 순서로 나타나 40%, 60%, 80%, 100% 에탄올 추출물이 control과 비교하여 각각 24%, 100%, 35%, 30% 정도 증가한 것으로 나타났다. 특히 60% 에탄올 추출물이 2배 정도 활성이 촉진되어 발효된 구기자 열매 에탄올, 메탄올, ethylacetate, 열수추출물이 각각 500 µg/mL에서 153.6%, 152.0%, 142.3%, 180.7%의 활성을 보였다는 보고(Choi et al. 2016)와 Choi and Jung (2016)의 모링가 잎 80% 에탄올(108.87%)과 열수 추출물(132.98%) 실험결과와 비교하여도 상당히 우수한 활성을 보임을 확인할 수 있었다. 하지만 ADH 활성과 비교하여 ALDH 활성은 모든 추출 농도에서 control보다 낮은 활성을 보였으며 그 중에 60% 에탄올 추출물이 가장 높은 활성을 나타냈으나 control의 반 정도의 활성에 불과하였다. Kang et al. (2002)에 의하면 ADH 및 ALDH 활성을 촉진시키는데 영향을 미치는 주요한 인자로 asparagine과 methionine 같은 아미노산과 Ca2+과 Zn2+ 같은 무기질이 독자적으로 작용하는 것보다 상호적으로 작용하는 것이 촉진효과가 크다고 하며, ADH 및 ALDH 활성을 촉진하는 아미노산은 대부분 친수성이고, 무기질 역시 물에 잘 용해되기 때문이라고 보고한 것과 더불어 아미노산 중 소수성이며 알코올 분해에 효과가 있는 alanine도 기여하고 있다고 보고하였다. 또한 수용성 아미노산들의 ADH 및 ALDH 활성을 측정한 Cha et al. (2009)의 보고에 따르면 ADH 활성은 크게 증가한 것으로 나타난 반면에 ALDH 활성은 ADH 활성보다 촉진 효과는 없었다는 실험결과도 있다. 본 연구와 이들의 결과를 종합하여 볼 때 ALDH을 촉진시키는 물질보다 ADH을 촉진시키는 물질이 풍부하게 함유되어 있고, ADH 활성의 경우 저농도에서 수용성 아미노산과 무기질이 크게 관여하고 있는 것으로 추측되며 고농도에는 alanine 같은 소수성 아미노산에 의존하고 있을 것으로 예상된다.
Alcohol dehydrogenase (A) and aldehyde dehydrogenase (B) activity of
제주도 특산물로 알려진 당유자의 잎을 이용한 연구는 미흡한 실정이며, 특히 용매 농도별로 다양한 생리활성을 측정한 연구는 지금까지 보고되어 있지 않았다. 이에 따라 본 연구에서는 에탄올 농도별로 추출된 당유자 잎에 대한 생리활성을 측정하였다. 수율과 총 페놀 함량은 각각 20% 에탄올, 물 추출물이 가장 높은 함량을 가진 것으로 나타났으며 가장 낮은 수율을 보인 100% 에탄올 추출물에서 비교적 높은 페놀 함량이 나타나 수율에 비하여 많은 페놀 함량이 확인되었다. 환원력과 ABTS radical 소거능 실험 결과 물 추출물이 가장 높은 활성을 나타냈으며 80% 에탄올 추출물이 DPPH radical 소거능, α-glucosidase, L-tyrosine을 기질로 한 tyrosinase 저해 활성에서 가장 우수한 활성을 가진 것으로 나타났다. 또한 L-dopa를 기질로 한 tyrosinase 저해 활성과 지금까지 보고된 바 없는 ADH 및 ALDH 활성에서는 60% 에탄올 추출물이 가장 뛰어난 활성을 촉진시켰고 미생물 생육을 억제하는 능력이 60%, 80% 에탄올에서 거의 동일하게 나타났다. 이 결과에서 항산화 효과를 얻고자 할 때는 물이나 80% 에탄올로, 그 외 생리활성(α-glucosidase 저해활성, tyrosinase 저해활성, 항미생물 활성, ADH 및 ALDH 활성)에서는 60∼80% 에탄올로 추출하는 것이 가장 효과적일 것으로 사료된다. 본 실험의 결과는 당유자 잎을 신소재 개발 원료로서 사용하는데 하나의 기초 자료가 될 것으로 기대된다.
본 연구는 중소벤처기업부와 한국산업기술진흥원이 지원하는 지역특화산업 육성사업(R0003895)으로 수행된 연구결과입니다.
J Plant Biotechnol 2019; 46(1): 45-55
Published online March 31, 2019 https://doi.org/10.5010/JPB.2019.46.1.045
Copyright © The Korean Society of Plant Biotechnology.
나카무라마사야, 라종환, 김주성
제주대학교 생명자원과학대학 친환경농업연구소
Masaya Nakamura, Jong-Hwan Ra, Ju-Sung Kim
Majors in Plant Resource and Environment, College of Agriculture and Life sciences, SARI, Jeju National University, Jeju 63243, Korea
Correspondence to: e-mail: aha2011@jejunu.ac.kr
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
The
Keywords: ADH, ALDH, Antioxidant,
제주도 특산물의 하나인 당유자(
따라서 본 연구에서는 당유자 잎을 에탄올 농도별(20%, 40%, 60%, 80%, 100%)로 추출하여 항산화능, 페놀 함량, 항당뇨 효과, 미백 효과, 항균 효과, 그리고 이전에 보고된 바가 없는 알코올 분해능 활성에 초점을 맞추어 당유자 잎의 생리활성을 포괄적으로 비교 분석함과 동시에 제주도 특산물로써 잎을 이용한 신소재 개발 원료로서의 이용 가능성을 탐색하고자 하였다.
본 연구에서 사용한 당유자 잎은 2014년 10월초에 수확한 것을 제주특별자치도 식물자원연구소에서 구입하여 실험에 이용하였다. 이물질을 제거한 후 실온에서 10일동안 완전하게 건조시켜 믹서기로 분쇄하고 중량 10배의 용매(0%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100% 에탄올)에 담가 90분 동안 25°C에서 초음파 추출기(Power sonic 520, Hwashin Co., Yeongcheon, Korea)를 이용하여 추출하였다. 추출된 용액을 Whatman No.2 여과지(Whatman International Ltd, Kent, England, UK)에 여과하여 감압농축기(Hei-VAP Precision 280 rpm; Heldolph, Germany)를 이용하여 농축하였다. 농축된 시료는 -20°C에서 보관하면서 분석실험을 실시하였다.
총 페놀 함량을 측정하기 위하여 Singleton and Rossi (1965)의 실험 방법을 변형하여 수행하였다. 증류수로 희석된 샘플 용액에 50 µL의 Folin–Ciocalteu 시약을 첨가하여 5분 동안 실온에서 반응시켰다. 반응 후 300 µL의 20% sodium carbonate를 넣고, 20분 동안 반응시킨 뒤 1 mL의 증류수를 첨가하여 725 nm에서 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 샘플시료의 총 페놀 함량은 표준물질로 사용된 gallic acid의 표준액으로 작성한 검량선에 따라 계산하여 garlic acid equivalent (GAE, mg GAE/g)로 나타내었다.
1,1-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)를 이용한 항산화 활성 측정은 Musa et al. (2013)의 방법을 변형하여 수행하였다. 메탄올로 희석된 200 µL 샘플 용액을 96-well microtiter plate 두 번째 줄에 넣고 나머지는 100 µL의 메탄올을 가하였다. 두 번째 줄에서 마지막 줄까지 단계적으로 희석하여(1.56-200 µg/mL) 첫 번째 줄은 음성대조군으로 사용하였다. 희석된 용액에 100 µL의 DPPH (0.4 mM)을 첨가하여 암상태로 실온에서 30분 동안 반응시킨 후 490 nm에서 microplate reader (iMark; Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 소거능은 아래의 식으로 계산하여 50%가 되는 샘플량의 농도를 RC50 (µg/mL)로 나타내었고 양성대조군으로 L-ascorbic acid, α-tocopherol, butylated hydroxytoluene (BHT)을 사용하였다.
A: absorbance of sample solution, B: absorbance of control
2,2-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazothiazoline-6-sulfornic acid (ABTS)을 이용한 항산화 활성값 측정은 Re et al. (1999)의 실험 방법을 변형하여 수행하였다. 7 mM ABTS과 2.45 mM potassium persulfate를 혼합하여 암조건의 실온에서 16 시간동안 반응시킨 뒤 분광광도계(UV-1800, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)를 이용하여 흡광도 값이 750 nm에서 1.2 ∼ 1.3이 되도록 sodium phosphate buffer를 첨가하여 조절하였다. 준비된 샘플과 160 µL ABTS 용액을 96-well microtiter plate 두 번째 줄에 넣고 나머지는 100 µL의 증류수를 첨가하였다. 두 번째 줄에서 마지막 줄까지 단계적으로 희석하여(1.56 ∼ 200 µg/mL) 첫 번째 줄은 음성대조군으로 사용하였고, 10분 동안 반응시킨 후 750 nm로 세팅된 microplate reader를 이용하여 측정하였다. 소거능은 DPPH radical 소거능 측정과 같은 식으로 계산하였으며 50%가 되는 샘플량의 농도를 RC50 (µg/mL)로 나타내었고, 양성대조군으로 L-ascorbic acid, α-tocopherol를 사용하였다.
샘플의 환원력을 측정하기 위하여 Oyaizu (1986)의 방법을 약간 변형하여 실험을 수행하였다. 농도별(100, 200, 300 µg/mL) 샘플용액에 500 µL의 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 6.6)와 potassium fericyanide를 첨가하여 50°C에서 20분 동안 반응시켰다. 이 용액에 250 µL의 10% trichloroacetic acid를 넣고, 상등액을 microtube에 분주하여 0.1% ferric chloride를 첨가하였다. 마지막으로 분광광도계를 이용하여 흡광도 값을 조사하였다. 환원력은 흡광도 값으로 나타내었고, 양성대조군으로 α-tocopherol를 사용하였다.
α-Glucosidase 저해활성을 측정하기 위하여 Oki et al. (1999)의 방법을 변형하여 수행하였다. 200 µL의 sodium phosphate buffer (0.2 M, pH 6.8)와 50 µL의 α-glucosidase 효소액(0.5 U/mL)을 순서대로 50 µL의 샘플 용액과 혼합하여 15분 동안 37°C에서 반응시켰다. 이어서 기질로 100 µL의 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (
A: absorbance of sample solution, B: absorbance without treating
Tyrosinase 저해활성은 Huang et al. (2013)의 방법을 변형하여 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.8)로 희석된 샘플 용액에 기질로 40 µL의 L-tyrosine (1.66 mM), 효소로 tyrosinase (125 U/mL)를 순서대로 넣고, 37°C에서 20분 동안 반응시켰다. 실험 종료 후 microplate reader를 이용하여 495 nm에서 흡광도를 측정하였다. 동시에 L-tyrosine 대신에 L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-dopa)를 기질로 이용하였으며 α-glucosidase 저해활성 측정과 같은 식으로 계산하여 백분율로 나타내었고, 양성대조군으로 arbutin를 사용하였다.
항미생물 활성 측정은 Kobayashi et al. (1995)의 two-fold dilution법을 변형하여 항균활성 정도를 분석하였으며 그람 양성균으로
Alcohol dehydrogenase (ADH) 활성을 측정하기 위하여 수행된 실험은 Shim et al. (2013)이 고안한 방법을 변형하여 조사하였다. 100 µL의 희석된 샘플 용액에 ethanol과 nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) 시약을 가하여 혼합한 뒤 glycine- NAOH (pH 8.8)을 첨가하여 1.8 mL가 되도록 조절하였다. 그 다음 혼합한 용액을 25°C에서 10동안 반응시킨 후 ADH (10 U/mL)을 첨가하고 분광광도계를 이용하여 340 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Acetaldehyde dehydrogenase (ALDH) 활성 측정은 Tottmar et al. (1973)의 방법을 변형하여 수행하였다. 50 mM sodium phosphate buffer, 5 mM acetaldehyde, 0.5 mM NAD 용액, 0.1 mM ALDH을 순서대로 첨가하였다. 여기에 200 µL의 샘플 시료를 첨가하여 37°C에서 10분 동안 반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 370 nm에서 흡광도를 측정하였다. ADH 및 ALDH 활성 측정은 이전 실험을 통하여 300 µg/mL의 농도로 설정하고 아래의 식을 이용하여 계산하였으며 무처리군을 control로 이용하여 100%로 나타내어 ADH 및 ALDH 활성을 비교 분석하였다.
A: absorbance of sample solution, B: absorbance without treating sample solution
모든 데이터는 최소 2 반복으로 이루어졌으며 실험결과는 평균과 표준편차로 표기했고 SPSS (Statistical Package for the Social Sciences, ver. 18.0)를 이용하여 one-way ANOVA 분석을 실시하였다. 평균값의 통계적 유의성은
용매 추출은 식물체의 생리활성 물질을 얻는데 가장 많이 사용되는 방법으로 식물 종류, 추출방법 및 시간, 용매 극성 등에 따라 다르며 기본적으로 일정한 추출 시간과 온도하에서는 사용하는 용매의 종류와 식물체가 가진 물질의 생리활성을 결정하는 큰 요인이 된다. 따라서 수율은 용매와 밀접한 관계가 있으며 효율적인 추출을 위하여 실험설계가 중요한 요소가 된다(Fatiha et al. 2012). 에탄올 농도별 당유자 잎의 추출수율은 Table 1에 나타내었다. 20% 에탄올 추출물이 27.62 ±0.91%로 가장 높은 수율을 나타냈으며 40%, 80%, 60%, 물, 100% 에탄올 추출물 순으로 유의적인 수율 감소가 관찰되었다. 특히 100% 에탄올 추출물이 3.82±0.31%로 다른 추출물보다 상당히 차이가 나타났으며 비교적 에탄올과 물의 혼합추출에서 높은 수율이 확인되었다. 이는 약용 허브인
Table 1 . Extraction yields and total phenolic content of the
Extracts | Yield (%)a | Total phenol (mg GAE/g)b |
---|---|---|
Distilled water extract | 20.70±1.36 c | 628.27±28.11 a |
20% ethanol extract | 27.62±0.91 a | 486.32±19.40 c |
40% ethanol extract | 23.77±0.98 b | 557.92±20.30 b |
60% ethanol extract | 21.22±1.60 c | 543.60±10.53 b |
80% ethanol extract | 23.75±0.29 b | 466.40±3.50 c |
100% ethanol extract | 3.82±0.31 d | 568.82±30.42 b |
Values are mean value ± standard deviation (SD) of duplicate determinations. The values with the same superscript letter along the same column are not significantly different (
aPercentage yield from the dried plant material
bTotal phenolic content analyzed as gallic acid equivalent (GAE) mg/g of extract
페놀 화합물은 예로부터 인체에 주요한 역할을 하는 물질로 다양한 생리활성에 작용하는 것으로 알려져 왔으며 지금까지 수 많은 연구가 수행되어 왔다(Ho et al. 2018). 본 실험에서도 페놀 함량과 실시한 생리활성 사이에 연관이 있는지를 알아보기 위하여 총 페놀 함량을 측정하여 mg GAE/g로 나타내었다(Table 1). 앞서 고찰한 수율과 반대로 물(628.27±28.11), 100% 에탄올(568.82±30.42) 추출물에서 높은 함량을 나타냈으며 다음으로 40%(557.92±20.30), 60%(543.60±10.53), 20% (486.32±19.40), 80% 에탄올 추출물(466.40±3.50)의 순이었다. 당유자 과피를 극성순으로 분획하여 우수한 활성을 보인 ethylacetate 분획물의 페놀 함량이 163.19±2.34 mg GAE/g이라는 보고(Ko and Kim, 2018)와 당유자 잎 ethylacetate 분획물에서 202.1±0.8 mg GAE/g로 가장 높게 나타났다고 하여(Kim et al. 2008) 측정 방법이 약간 다른 것을 고려하여도 이들 실험 결과와 비교해볼 때 높은 페놀 함량을 나타내는 것을 알 수 있었다.
라디칼은 불안정한 것으로 알려져 있지만 DPPH 라디칼은 분자 내 라디칼을 보유하고 있으며 다른 라디칼과 결합함으로써 complex을 형성하기에 비교적 안정하고 항산화제부터 전자 및 수소 분자를 받으면 라디칼이 소거되어 특유의 보라색이 노란색으로 엷어지는데(Ju et al. 2009), 그 소거능을 RC50로 나타내었다(Table 2). 모든 추출물에서 대조군으로 사용된 L-ascorbic acid, α-tocopherol, BHT보다 높은 활성을 보이지 않았으며 80% 에탄올 추출물까지 에탄올 농도가 증가할수록 소거능이 증가하는 것으로 나타났다. 특히 80% 에탄올 추출물에서 174.32±8.45 µg/mL로 가장 높은 소거능을 나타냈으며 100% 에탄올 추출물에서는 500 µg/mL 이상의 가장 낮은 활성을 보였다. 또한 물 추출물에서 375.2±2.99 µg/mL로 나타났는데 Lim et al. (2006)은 당유자 미숙과 hexane, chloroform, ethylacetate, butanol, 그리고 물 분획물 중에서 물 분획물이 DPPH 소거능이 가장 높아 α-tocopherol과 유사한 활성을 보였다고 보고하였는데, 추출 방법 특히 본 실험에서는 잎을 사용했지만 껍질을 포함한 과실을 사용했기 때문이라 생각된다. 또한 페놀 함량과 라디칼 소거능은 비례한다고 보고 되었으나(Al-Dabbagh et al. 2018), 본 연구에서는 DPPH radical 소거능과 페놀 함량과의 상관 관계는 r=0.463으로 낮게 나타나(
Table 2 . The result of the DPPH and ABTS radical scavenging in
Extracts | DPPH RC50 (μg/mL)a | ABTS RC50 (μg/mL)a |
---|---|---|
Distilled water extract | 375.21±2.99 d | 180.42±4.95 b |
20% ethanol extract | 240.26±10.05 c | 218.02±2.38 b |
40% ethanol extract | 192.55±0.95 bc | 300.67±9.54 c |
60% ethanol extract | 196.38±2.66 bc | 311.78±15.03 c |
80% ethanol extract | 174.32±8.45 b | 482.73±13.51 d |
100% ethanol extract | > 500 e | > 500 e |
L-Ascorbic acid | 1.21±0.04 a | 3.48±0.02 a |
α-Tocopherol | 3.98±0.01 a | 11.72±0.04 a |
Butylated hydroxytoluene | 42.66±1.81 a |
Values are mean value ± standard deviation (SD) of duplicate determinations. The values with the same superscript letter along the same column are not significantly different (
aRC50: Amount required for a 50% reduction of DPPH (ABTS) free radicals after 30 minutes
Table 3 . Reducing power ability of the
Extracts | 100 μg/mL | 200 μg/mL | 300 μg/mL |
---|---|---|---|
Distilled water extract | 0.097±0.004 b | 0.189±0.002 b | 0.269±0.07 b |
20% ethanol extract | 0.075±0.004 cd | 0.157±0.007 cd | 0.214±0.013 c |
40% ethanol extract | 0.087±0.004 bc | 0.177±0.007 bc | 0.231±0.004 bc |
60% ethanol extract | 0.076±0.008 cd | 0.180±0.006 bc | 0.231±0.022 bc |
80% ethanol extract | 0.080±0.003 bcd | 0.158±0.008 cd | 0.215±0.008 c |
100% ethanol extract | 0.063±0.006 d | 0.146±0.006 d | 0.234±0.002 bc |
α-Tocopherol | 0.248±0.006 a | 0.603±0.029 a | 0.950±0.026 a |
Values are mean value ± standard deviation (SD) of duplicate determinations. The values with the same superscript letter along the same column are not significantly different (
Table 4 . α-Glucosidase inhibitory activity of the
Extracts | IC50 (μg/mL)a |
---|---|
Distilled water extract | >500 d |
20% ethanol extract | >500 d |
40% ethanol extract | >500 d |
60% ethanol extract | 416.35±11.07 c |
80% ethanol extract | 336.57±2.03 b |
100% ethanol extract | 418.18±3.56 c |
Acarbose | 83.81±3.14 a |
Values are mean value ± standard deviation (SD) of duplicate determinations. Values with the same superscript letter along the same column are not significantly different (
aIC50: Concentration requires to reduce 50% of α-glucosidase (μg/mL).
Table 5 . Minimum inhibitory concentrations (MIC) of the
Minimum inhibitory concentration (μg/mL)a | ||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
H2Ob | 20E | 40E | 60E | 80E | 100E | Tet | ||
Gram positive bacteria | B.c | -c | - | 1000 | 125 | 250 | 250 | 8 |
S.a | - | - | - | 500 | 500 | - | 8 | |
B.s | - | - | - | 500 | 500 | - | 8 | |
K.r | - | - | - | 1000 | 500 | - | 8 | |
M.l | - | - | - | 500 | 500 | - | 8 | |
Gram negative bacteria | E.cl | - | - | - | - | - | - | 8 |
K.p | - | - | - | - | - | - | 8 | |
E.c | - | - | - | - | - | - | 8 | |
P.a | - | - | - | - | 1000 | - | 8 | |
P.v | - | - | - | 1000 | 250 | - | 8 | |
Yeast | S.c | - | - | - | - | - | - | |
P.j | - | - | 1000 | 1000 | 1000 | - | ||
C.a | - | - | 1000 | 1000 | 1000 | - |
B.c:
aThe MIC value against bacteria was determined through the serial two-fold dilution method. The growth of the bacteria was evaluated by the degree of turbidity of the culture with the naked eye in twelve hours.
bH2O, distil water extract; 20E, 20% ethanol extract; 40E, 40% ethanol extract; 60E, 60% ethanol extract; 80E, 80% ethanol extract, 100E, 100% ethanol extract; Tet, tetracycline
c- : >1000 μg/mL
Table 6 . Correlation analysis between the total phenol content and each assay.
TPC | RDP | DPPH | ABTS | α-Glu | L-Tyro | L-Dopa | ADH | ALDH | |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
TPC | 1 | 0.848*** | 0.463 | -0.124 | 0.33 | -0.691** | -0.486 | -0.351 | -0.197 |
TPC, total phenol content assay; RDP, reducing power assay; DPPH, DPPH radical scavenging assay; ABTS, ABTS radical scavenging assay; α-Glu, α-glucosidase inhibitory assay; L-Tyro, L-tyroine inhibitory assay; L-Dopa, L-dopa inhibitory assay; ADH, alcohol dehydrogenase assay; ALDH, aldehyde dehydrogenase assay.
***, significance
**, significance
ABTS radical 소거능은 간편하게 샘플의 radical 소거능을 측정할 수 있는 방법으로, 안정한 radical이기 때문에 많이 사용되며 potassium persulfate를 산화제로 사용하여 발생한 ABTS radical과 항산화 효과가 있는 물질이 만나면 흡광도가 감소하게 되며 control과 비교하여 그 차이를 일정한 시간 후에 734 nm 부근에서 측정한다(Schaich et al. 2015). 당유자 잎의 에탄올 농도별 추출물의 ABTS radical 소거능은 Table 2에 나타내었다. 에탄올 농도가 증가할수록 활성이 감소하는 경향을 보여 물>20%>40%>60%>80%>100% 에탄올 추출물 순으로 나타났다. DPPH radical 소거능과 같이 100% 에탄올 추출물에서 500 µg/mL 이상의 낮은 활성이 나타났으며 100% 에탄올 추출에서는 radical 소거능에 관여하는 물질이 덜 추출된다는 것이 확인되었고 백부자(
환원력 측정은 potassium ferricyanide (Fe3+)가 ferrocyanide (Fe2+)로 환원되는 정도를 조사하여 환원력이 클수록 녹색에 가깝게 발색된다. 활성 정도는 샘플이 가진 reductone과 관계가 있으며 수소 분자를 공여함으로써 연쇄반응을 방지하므로 항산화 활성이 큰 물질일수록 높은 흡광도 값을 나타낸다(Saha and Paul, 2014). 당유자 잎의 환원력을 평가한 결과(Table 3), 농도 의존적으로 환원력을 나타내어 물 추출물이 100, 200, 300 µg/mL에서 각 0.097±0.004, 0.189±0.002, 0.269±0.07으로 가장 우수하게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 그리고 에탄올 농도가 증가함에 따라 활성이 감소하는 경향을 보여 40%, 60% 에탄올 추출물이 모든 첨가 농도에서 비교적 높은 활성을 나타냈으나 20%, 100% 에탄올 추출물에서는 낮은 활성을 나타냈다. 하지만 Padmanabhan and Jagle (2012)가 보고한 약용식물인
α-Glucosidase는 식후 탄수화물(다당류)이 α-amylase에 의해 변형된 이당류를 단당류로 가수분해할 때 관여하는 효소이며 그 후 소장에서 흡수되어 각 장기에서 사용되지만 빠르게 흡수되면 혈당치가 높아져 다양한 질환을 유발하기도 한다. α-Glucosidase 저해제로 acarbose, miglitol, voglibose 등이 사용되고 있으나 부작용이 보고되어 천연 추출물에서 α-glucosidase를 저해하는 물질을 찾아내는 연구가 활발히 진행되고 있다(Taha et al. 2016). α-Glucosidase 저해활성을 측정하여 IC50로 나타낸 결과 80% 에탄올 추출물에서 336.57±2.03 µg/mL로 다른 농도와 비교하면 뚜렷하게 높게 나타났으며 60%, 100% 에탄올 추출물에서는 비슷한 활성을 가지는 것으로 나타났다(Table 4). 물, 20%, 40% 에탄올 추출물의 경우 500 µg/mL 이상으로 매우 낮게 나타나서 대조군으로 사용된 acarbose와 비교해볼 때 모든 추출 농도에서 뛰어난 활성이 보이지 않았다. 이는 황칠 잎의 에탄올 농도별 추출에서 60%, 80%, 100% 에탄올 추출물이 물, 20%, 40% 에탄올 추출물에 비해 월등히 높은 활성을 나타낸 것과 일부 일치하였지만 본 실험에서는 페놀 함량과의 연관성이 r=0.330으로 유의성이 없게 나타났으며(Table 6), 황칠 잎 추출물에서 -0.614 (
피부를 자외선이나 외부의 자극으로부터 보호하는 역할을 하는 멜라닌은 피부 안의 멜라노사이트에서 생합성되며 tyrosine이 활성효소인 tyrosinase 그리고 기질로 L-dopa, L- tyrosine과 반응하여 생성된다. 하지만 멜라닌이 과하게 생성되면 피부의 신진대사가 느려져 기미, 주근깨를 형성하며 피부암을 유발하는 큰 요인이 된다. 따라서 tyrosinase를 저해하여 멜라닌의 과잉생산을 억제하는 천연물질을 찾아낼 필요가 있다(Aumeeruddy-Elalfi et al. 2016). L-Tyrosine, L-dopa를 기질로 하여 tyrosinase 저해활성을 조사한 결과는 Figure 1과 같다. L-Tyrosine을 기질로 한 경우 에탄올 농도가 증가할수록 활성이 증가하여 80% 에탄올 추출물이 가장 우수한 활성을 보여 500 µg/mL의 농도에서 80% 가까운 높은 수치를 나타냈다. 80% 에탄올 추출물에 비하여 100% 에탄올 추출물에서는 오히려 저해능이 감소하는 경향이 나타났지만 40%, 60%, 80%, 100% 에탄올 추출물에서 대조군으로 사용된 arbutin보다 뛰어난 결과를 보였으며 저농도 에탄올로 추출할 경우에도 어느 정도 저해활성이 있는 것을 확인할 수 있었다. 이는 제주도에서 자생하는 조릿대 추출물의 tyrosinase 저해활성이 20% 에탄올부터 추출 농도가 높아짐에 따라 활성이 증가하여 60% 에탄올을 기준으로 감소한다는 보고(Ra et al. 2017)와 일부 일치하였다. L-Dopa를 기질로 하여 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 L-tyrosine을 기질로 한 경우와 유사한 경향이 나타났으나 물, 20%, 80%, 100%, 40% 에탄올 추출물 순서였으며 60% 에탄올이 다른 추출물보다 높은 활성을 나타냈을 뿐만 아니라 arbutin보다 더 높은 저해 활성을 보여주었다. 이 결과는 10종의 약용식물을 메탄올로 추출하여 500 µg/mL 농도에서 가장 우수한 활성을 나타낸
Tyrosinase inhibitory activity for using L-tyrosine (A) and L-dopa (B) as substrate of the
미생물에 의하여 발생하는 식중독이나 감염성 질환으로 인한 피해가 최근 들어 동반상승하고 있는 실정이며 이들 원인균의 피해를 방지하기 위한 항균성 식품개발과 강한 항균성을 가진 물질을 식물에서 얻고자 하는 연구가 수행되고 있다(Bensizerara et al. 2013). 당유자 잎의 에탄올 농도별 추출물의 미생물에 대한 저해활성은 Table 5와 같이 40% 에탄올 추출물이
간으로 운반된 알코올은 ADH, ALDH와 같은 효소 그리고 보효소인 NAD에 의하여 산화되며 ADH는 알코올을 acetaldehyde로, ALDH는 acetaldehyde를 acetic acid로 단계적으로 전환하여 결국 이산화탄소와 물로 되어 인체에 무해하게 분해된다. 그러나 다량의 알코올 그리고 만성적 섭취는 이들 효소의 활성을 억제하며 분해 능력을 약하게 시키므로 간 장해를 비롯한 다양한 질병을 일으키는 것으로 알려졌다(Matsumoto 2011). 따라서 ADH와 ALDH의 활성을 촉진하는 물질을 찾기 위하여 당유자 잎 추출물의 ADH 및 ALDH 활성을 측정하여 Figure 2에 나타내었다. ADH 활성에서는 물<20%<40%< 100%<80%<60% 에탄올 추출물 순서로 나타나 40%, 60%, 80%, 100% 에탄올 추출물이 control과 비교하여 각각 24%, 100%, 35%, 30% 정도 증가한 것으로 나타났다. 특히 60% 에탄올 추출물이 2배 정도 활성이 촉진되어 발효된 구기자 열매 에탄올, 메탄올, ethylacetate, 열수추출물이 각각 500 µg/mL에서 153.6%, 152.0%, 142.3%, 180.7%의 활성을 보였다는 보고(Choi et al. 2016)와 Choi and Jung (2016)의 모링가 잎 80% 에탄올(108.87%)과 열수 추출물(132.98%) 실험결과와 비교하여도 상당히 우수한 활성을 보임을 확인할 수 있었다. 하지만 ADH 활성과 비교하여 ALDH 활성은 모든 추출 농도에서 control보다 낮은 활성을 보였으며 그 중에 60% 에탄올 추출물이 가장 높은 활성을 나타냈으나 control의 반 정도의 활성에 불과하였다. Kang et al. (2002)에 의하면 ADH 및 ALDH 활성을 촉진시키는데 영향을 미치는 주요한 인자로 asparagine과 methionine 같은 아미노산과 Ca2+과 Zn2+ 같은 무기질이 독자적으로 작용하는 것보다 상호적으로 작용하는 것이 촉진효과가 크다고 하며, ADH 및 ALDH 활성을 촉진하는 아미노산은 대부분 친수성이고, 무기질 역시 물에 잘 용해되기 때문이라고 보고한 것과 더불어 아미노산 중 소수성이며 알코올 분해에 효과가 있는 alanine도 기여하고 있다고 보고하였다. 또한 수용성 아미노산들의 ADH 및 ALDH 활성을 측정한 Cha et al. (2009)의 보고에 따르면 ADH 활성은 크게 증가한 것으로 나타난 반면에 ALDH 활성은 ADH 활성보다 촉진 효과는 없었다는 실험결과도 있다. 본 연구와 이들의 결과를 종합하여 볼 때 ALDH을 촉진시키는 물질보다 ADH을 촉진시키는 물질이 풍부하게 함유되어 있고, ADH 활성의 경우 저농도에서 수용성 아미노산과 무기질이 크게 관여하고 있는 것으로 추측되며 고농도에는 alanine 같은 소수성 아미노산에 의존하고 있을 것으로 예상된다.
Alcohol dehydrogenase (A) and aldehyde dehydrogenase (B) activity of
제주도 특산물로 알려진 당유자의 잎을 이용한 연구는 미흡한 실정이며, 특히 용매 농도별로 다양한 생리활성을 측정한 연구는 지금까지 보고되어 있지 않았다. 이에 따라 본 연구에서는 에탄올 농도별로 추출된 당유자 잎에 대한 생리활성을 측정하였다. 수율과 총 페놀 함량은 각각 20% 에탄올, 물 추출물이 가장 높은 함량을 가진 것으로 나타났으며 가장 낮은 수율을 보인 100% 에탄올 추출물에서 비교적 높은 페놀 함량이 나타나 수율에 비하여 많은 페놀 함량이 확인되었다. 환원력과 ABTS radical 소거능 실험 결과 물 추출물이 가장 높은 활성을 나타냈으며 80% 에탄올 추출물이 DPPH radical 소거능, α-glucosidase, L-tyrosine을 기질로 한 tyrosinase 저해 활성에서 가장 우수한 활성을 가진 것으로 나타났다. 또한 L-dopa를 기질로 한 tyrosinase 저해 활성과 지금까지 보고된 바 없는 ADH 및 ALDH 활성에서는 60% 에탄올 추출물이 가장 뛰어난 활성을 촉진시켰고 미생물 생육을 억제하는 능력이 60%, 80% 에탄올에서 거의 동일하게 나타났다. 이 결과에서 항산화 효과를 얻고자 할 때는 물이나 80% 에탄올로, 그 외 생리활성(α-glucosidase 저해활성, tyrosinase 저해활성, 항미생물 활성, ADH 및 ALDH 활성)에서는 60∼80% 에탄올로 추출하는 것이 가장 효과적일 것으로 사료된다. 본 실험의 결과는 당유자 잎을 신소재 개발 원료로서 사용하는데 하나의 기초 자료가 될 것으로 기대된다.
본 연구는 중소벤처기업부와 한국산업기술진흥원이 지원하는 지역특화산업 육성사업(R0003895)으로 수행된 연구결과입니다.
Tyrosinase inhibitory activity for using L-tyrosine (A) and L-dopa (B) as substrate of the
Alcohol dehydrogenase (A) and aldehyde dehydrogenase (B) activity of
Table 1 . Extraction yields and total phenolic content of the
Extracts | Yield (%)a | Total phenol (mg GAE/g)b |
---|---|---|
Distilled water extract | 20.70±1.36 c | 628.27±28.11 a |
20% ethanol extract | 27.62±0.91 a | 486.32±19.40 c |
40% ethanol extract | 23.77±0.98 b | 557.92±20.30 b |
60% ethanol extract | 21.22±1.60 c | 543.60±10.53 b |
80% ethanol extract | 23.75±0.29 b | 466.40±3.50 c |
100% ethanol extract | 3.82±0.31 d | 568.82±30.42 b |
Values are mean value ± standard deviation (SD) of duplicate determinations. The values with the same superscript letter along the same column are not significantly different (
aPercentage yield from the dried plant material
bTotal phenolic content analyzed as gallic acid equivalent (GAE) mg/g of extract
Table 2 . The result of the DPPH and ABTS radical scavenging in
Extracts | DPPH RC50 (μg/mL)a | ABTS RC50 (μg/mL)a |
---|---|---|
Distilled water extract | 375.21±2.99 d | 180.42±4.95 b |
20% ethanol extract | 240.26±10.05 c | 218.02±2.38 b |
40% ethanol extract | 192.55±0.95 bc | 300.67±9.54 c |
60% ethanol extract | 196.38±2.66 bc | 311.78±15.03 c |
80% ethanol extract | 174.32±8.45 b | 482.73±13.51 d |
100% ethanol extract | > 500 e | > 500 e |
L-Ascorbic acid | 1.21±0.04 a | 3.48±0.02 a |
α-Tocopherol | 3.98±0.01 a | 11.72±0.04 a |
Butylated hydroxytoluene | 42.66±1.81 a |
Values are mean value ± standard deviation (SD) of duplicate determinations. The values with the same superscript letter along the same column are not significantly different (
aRC50: Amount required for a 50% reduction of DPPH (ABTS) free radicals after 30 minutes
Table 3 . Reducing power ability of the
Extracts | 100 μg/mL | 200 μg/mL | 300 μg/mL |
---|---|---|---|
Distilled water extract | 0.097±0.004 b | 0.189±0.002 b | 0.269±0.07 b |
20% ethanol extract | 0.075±0.004 cd | 0.157±0.007 cd | 0.214±0.013 c |
40% ethanol extract | 0.087±0.004 bc | 0.177±0.007 bc | 0.231±0.004 bc |
60% ethanol extract | 0.076±0.008 cd | 0.180±0.006 bc | 0.231±0.022 bc |
80% ethanol extract | 0.080±0.003 bcd | 0.158±0.008 cd | 0.215±0.008 c |
100% ethanol extract | 0.063±0.006 d | 0.146±0.006 d | 0.234±0.002 bc |
α-Tocopherol | 0.248±0.006 a | 0.603±0.029 a | 0.950±0.026 a |
Values are mean value ± standard deviation (SD) of duplicate determinations. The values with the same superscript letter along the same column are not significantly different (
Table 4 . α-Glucosidase inhibitory activity of the
Extracts | IC50 (μg/mL)a |
---|---|
Distilled water extract | >500 d |
20% ethanol extract | >500 d |
40% ethanol extract | >500 d |
60% ethanol extract | 416.35±11.07 c |
80% ethanol extract | 336.57±2.03 b |
100% ethanol extract | 418.18±3.56 c |
Acarbose | 83.81±3.14 a |
Values are mean value ± standard deviation (SD) of duplicate determinations. Values with the same superscript letter along the same column are not significantly different (
aIC50: Concentration requires to reduce 50% of α-glucosidase (μg/mL).
Table 5 . Minimum inhibitory concentrations (MIC) of the
Minimum inhibitory concentration (μg/mL)a | ||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
H2Ob | 20E | 40E | 60E | 80E | 100E | Tet | ||
Gram positive bacteria | B.c | -c | - | 1000 | 125 | 250 | 250 | 8 |
S.a | - | - | - | 500 | 500 | - | 8 | |
B.s | - | - | - | 500 | 500 | - | 8 | |
K.r | - | - | - | 1000 | 500 | - | 8 | |
M.l | - | - | - | 500 | 500 | - | 8 | |
Gram negative bacteria | E.cl | - | - | - | - | - | - | 8 |
K.p | - | - | - | - | - | - | 8 | |
E.c | - | - | - | - | - | - | 8 | |
P.a | - | - | - | - | 1000 | - | 8 | |
P.v | - | - | - | 1000 | 250 | - | 8 | |
Yeast | S.c | - | - | - | - | - | - | |
P.j | - | - | 1000 | 1000 | 1000 | - | ||
C.a | - | - | 1000 | 1000 | 1000 | - |
B.c:
aThe MIC value against bacteria was determined through the serial two-fold dilution method. The growth of the bacteria was evaluated by the degree of turbidity of the culture with the naked eye in twelve hours.
bH2O, distil water extract; 20E, 20% ethanol extract; 40E, 40% ethanol extract; 60E, 60% ethanol extract; 80E, 80% ethanol extract, 100E, 100% ethanol extract; Tet, tetracycline
c- : >1000 μg/mL
Table 6 . Correlation analysis between the total phenol content and each assay.
TPC | RDP | DPPH | ABTS | α-Glu | L-Tyro | L-Dopa | ADH | ALDH | |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
TPC | 1 | 0.848*** | 0.463 | -0.124 | 0.33 | -0.691** | -0.486 | -0.351 | -0.197 |
TPC, total phenol content assay; RDP, reducing power assay; DPPH, DPPH radical scavenging assay; ABTS, ABTS radical scavenging assay; α-Glu, α-glucosidase inhibitory assay; L-Tyro, L-tyroine inhibitory assay; L-Dopa, L-dopa inhibitory assay; ADH, alcohol dehydrogenase assay; ALDH, aldehyde dehydrogenase assay.
***, significance
**, significance
Jin-Woo Hwang ・Chan Hwi Park ・Hae-Yeon An ・Ye-Won Jang ・Hyun Kang ・Sung-Gyu Lee
J Plant Biotechnol 2022; 49(4): 339-346Bimpe Suliyat Azeez ・Se-Jin Oh ・Jong-Kuk Na
J Plant Biotechnol 2024; 51(1): 377-386Jong-Kuk Na
J Plant Biotechnol -0001; ():
Journal of
Plant BiotechnologyTyrosinase inhibitory activity for using L-tyrosine (A) and L-dopa (B) as substrate of the
Alcohol dehydrogenase (A) and aldehyde dehydrogenase (B) activity of