사과나무(Malus domestica Borkh)는 장미과(Rosaceae) 배나무아과(Maloideae) 사과나무속(Malus)에 속하는 목본성 영년생 원예작물로 온대 지역에서 주로 재배하고 있으며, 일년생 작물에 비해 과실의 형질을 확인하기까지의 유년기간이 길고, 수형이 커서 육종을 위해서는 많은 포장 면적과 경비가 소요되어 육종 효율이 낮은 작물이다. 또한 사과나무속은 자가불화합성으로 인해 근연종은 물론이고, 품종간에도 교배 불친화성이 존재하며 유전적으로 이형접합이다(Sassa et al. 1994). 따라서 육종 효율을 높이기 위하여 유묘기에 목표형질을 가진 개체를 선발할 수 있는 조기선발 분자표지의 개발이 필요하다. 사과에서는 검은별무늬병 저항성(Yang and Kruger 1994), 흰가루병(Markussen et al. 1995), 과피색(Cheng et al. 1996)과 관련한 분자표지 개발 연구가 보고되었으며, MdMYB1 유전자를 활용한 적색 과피를 구분할 수 있는 SNP 분자표지에 관한 연구가 보고되었다(Yanmin et al. 2011).

사과 품종 육성 초기에는 대과, 고당도 품종 개발이 육종 목표였으나 최근 붉은색 과육, 항산화 기능이 높은 품종 개발 목표가 추가되었다. 사과 유전자원을 수확기의 과육색으로 분류하면 백색 과육과 적색 과육으로 나뉘어진다. 우리

나라에서는 수확했을 때 과육색이 백색인 품종을 주로 재배하고 있지만, 소비자들의 요구는 기능성 성분 함량이 높은 품종으로 변화하고 있다. 사과의 기능성 성분 함량은 백색 과육보다는 적색 과육에 더 많이 함유되어 있어, 기능성 물질의 섭취를 위해 적색 과육 사과 품종의 육성이 필요하다. 전 세계적으로 과육까지 붉은 사과 품종은 ‘Redfield’, ‘Okanagan’, ‘Purple Wave’ 등 여러 품종이 육성되었으나 대체로 산도가 높아 식미는 불량한 편이다. 적육계 사과의 식미를 개량하기 위해서 여러 조합과 세대를 진전시켜야 하며, 조기선발 분자표지 개발 등 육종연한 단축을 위한 연구가 필요하다. 과수에서 색소를 나타내는 flavonoid는 식물의 꽃, 과실, 잎, 줄기, 뿌리, 종자 등 식물체 전체 부위에 존재하며 생장과 발육, 미생물과 해충에 대한 방어, 약리적 효과, 강력한 항산화 활성을 가지고 있다(Forkmann and Martens 2001). 사과에서 꽃, 과실, 잎 등이 적색으로 발현하는 데에는 MdMYB transcription factor가 관여하는 것으로 보고되었으며(Espley et al. 2007), MdMYB1 유전자는 사과의 과피색을 적색으로 하는데 있어 key regulator로 알려져 있어서(Ban et al. 2007), 국내에서는 이 유전자에서 유래한 SNP 분자표지를 개발하여 사과의 과피색을 조기에 구분하는데 활용하고 있다(Kim et al. 2011). MdMYB10 유전자는 사과의 과육색을 적색으로 하는데 있어 중요한 역할을 하며 이 유전자에서 유래한 SNP 분자표지를 이용하여 사과의 과육색을 판별한 연구결과가 보고되었다(Chagne et al. 2007).

본 연구는 기존에 보고된 MdMYB10 유전자에서 유래한 SNP 분자표지 외에 사과 과육색을 구분할 수 있는 조기선발 분자표지의 개발을 위해 적색 과육 사과 품종 ‘Redfield’와 녹색 과육 사과 품종 ‘Granny Smith’의 EST 분석 결과를 바탕으로(Kim et al. 2015) anthocyanin 발현에 관여하는 유전자들을 비교 분석하였다. HRM 기술을 사용하여 적색 과육 사과 품종과 백색 과육 사과 품종의 PCR 증폭산물에서 한 개의 서로 다른 염기서열을 구분하여 분리할 수 있는 SNP 위치를 확인하였다. 적색 과육 발현에 관련한 특이적 SNP 분자표지를 탐색하여 사과 유전자원 중 적색 과육 품종과 백색 과육 품종을 구분할 수 있는 분자표지를 개발하였고, 이러한 분자표지의 개발은 적색 과육 사과 품종의 육종 기한을 단축시키고 교배 육종의 효율성을 높이는데 이용할 수 있을 것이다.

식물재료 및 RNA 추출

본 연구에 사용한 재료는 농촌진흥청 국립원예특작과학원에 재식되어 있는 적색 과피, 적색 과육 사과 품종, ‘Redfield’와 녹색 과피, 백색 과육 사과 품종인 ‘Granny Smith’ 과실을 시기별로 채취하여 액체질소를 사용하여 분쇄하였다. 만개 후 7주에 과실을 수확하였고, RNA 분리 방법은 Pine Tees Methods (Shujun et al. 1993)에 따라서 다음과 같이 수행하였다. 분쇄한 3 g의 시료에 15 mL의 추출용액(2% CTAB, 2% PVP, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM EDTA, 2.0 M NaCl, 0.05% spermidine, 2% β-mercaptoethanol 사용 직전에 첨가)을 첨가하였다. 동량의chloroform:isoamyl alcohol (24:1)을 첨가하여 15000 rpm에서 25분 동안 원심분리 하였다. 상등액에 ¼ volume 의 10 M LiCl 를 첨가한 후 4°C에서 7시간 이상 보관 후, 15000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 침전물을 500 µL의 SSTE에 녹이고 동량의chloroform:isoamyl alcohol (24:1)을 첨가하였다. 15000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 상등액을 분리한 후 2배의 에탄올 첨가 후에 -70°C에서 40분 동안 저장 후 DEPC 처리한 멸균수에 녹였다. Total RNA로부터 mRNA를 분리하기 위해 polyA Tract mRNA isolation kit (Promega. USA)를 사용하였다. 다당류를 제거하기 위해 oligo (dT) 컬럼을 사용하는 대신에 biotinylated oligo (dT)와 paramagnetic particles을 사용하였다. One mg의Total RNA의 최종 부피를 500 µL로 맞춘 후 65°C에서 10분간 저장 후 3 µL의 biotinylated oligo (dT) probe와 13 µL의 20ⅹSSC를 첨가 후 상온에 저장하였다. SA- PMPs (streptavidin paramagnetic particles)이 튜브 안에서 완전하게 섞이도록 한 후에 magnetic stand에 세워서 입자를 분리하고, total RNA와 혼합하여 10분 동안 저장 후에 magnetic stand에서 0.3 ml의 0.1ⅹSSC로 4번 세척한 뒤에 0.1 mL의DEPC 처리한 멸균수를 첨가하였다.

‘Redfield’와 ‘Granny Smith’의 SNP 및 In/Del 분석

‘Redfield’와 ‘Granny Smith’ 전사체 분석 결과에서 찾은 SNP를 매트릭스로 만들어 변이 과정을 거친 후 동형(homozygous) SNP와 이형(heterozygous) SNP로 나누었고, SNP 선발 조건은 3 이상으로 하였다. ‘Redfield’와 ‘Granny Smith’의 SNP 비교분석은 동일한 SNP 위치에서 두 시료 간에 서로 동형 SNP인 경우만을 선발하였고, 두 시료 간에 탐색되는 다형성을 나타내는 SNP 554개가 선발되었다. GO분석은 TAIR10_ID을 이용하여 DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/tools.jsp)에서 제공하는 Gene Ontology Annotation Tool을 사용하였다. 참조한 제놈의 유전자는 선택적인 splicing form을 포함하고 있기 때문에 한 개의 SNP 위치는 한 개 이상의 전사체에 포함될 수 있으며 두 시료 간에 탐색되는 다형성을 나타내는 SNP 554개를 포함하는 전사체수는 323개 이고, TAIR10_ID 기준으로는 288개 이다. 이후 GO 분석 및 SNP 프라이머 디자인은 다형성을 나타내는 SNP 554개만을 사용하여 분석을 진행하여 103개의 프라이머를 제작하였다.

HRM 분석

HRM 분석(Wittwer et al. 2003)에 필요한 프라이머 제작을 위해 참조한 제놈과 주석 정보는 JGI Phytozome에서 사과(Malus domestica) 제놈 데이터를 받았고 7500 Fast Real-time PCR machine (Applied BioSystems)을 사용하여 수행하였다. HRM 분석을 위한 gDNA 추출은 적색 과피, 적색 과육 사과 10 품종 Redfield, Jay Darling, Pink Wood, Makamilk, May Pole, Okanagan, Red Flesh, M. pumila Royalty, Crimson Glory, Purple Wave, 백색 과육 사과 11 품종, Granny Smith, Court Pendu, Priam, End Blue Green, Mutsu, Northwest Greening, Lodi, Kinsei, Tumange, Bulmer Normern, Amere에서 잎을 채취하여 DNeasy Plant kit (Qiagen)을 사용하여 gDNA를 분리하였다(Prince et al. 1997). 추출한 DNA는 NanoDropⓇ ND-1000 (Nanodrop Technologies, USA)를 이용하여 정량하고 최종 농도가 20 ng이 되도록 희석하였다. PCR 반응액은 gDNA 20 ng에 각 SNP 분자표지에 해당하는 한 쌍의 프라이머(Table 2)를 넣고 PCR 반응은 95°C에서 초기 변성을 수행한 뒤, 95°C에서 15초간 변성과 60°C에서 60초간 복원하는 과정을 40회 반복하였다. 마지막으로 95°C에서 10초간 변성 반응을 시킨 후, 60°C에서 95°C까지 0.2°C씩 올리면서 각 온도에서 5초간 유지하는 동안 형광을 측정하여 HRM melting 그래프를 그렸다.

Table 1 . Summary of the development of SNP markers in ‘Redfield’ and ‘Granny Smith’.

Sample	Total SNP	Homozygous SNP	Heterozygous SNP	Polymorphism SNP	HRM primer
Redfield	2,236	1,164	1,072	554	103
Granny Smith	1,373	717	656

Table 2 . PCR amplicons showing polymorphic HRM profiles in ‘Redfield’ and ‘Granny Smith’.

SNP ID	Variations	TAIR10 hit	Forward primer	Reverse primer	Product
MDC002231.658	T/C	FAR1-related sequence 4	AACAGTTTGTGAACCACGGC	GCACCGCTTCTTCTAATGCG	129
MDC003558.335	A/C	ATP synthase delta-subunit gene	CTGCACCTGCTTCGCTATCT	CCAAGCGCATCGACCTGATA	143
MDC003940.103	A/C	Phosphoglycerate kinase family protein	TGGGCAGCAAAAGAGACACT	GCACAAGGTCTCTCAGTCGG	109
MDC004004.245	A/G	NADH-ubiquinone oxidoreductase	CAAAGCAATGGCAGCTGAGG	CAGAGGGATCAGCAAGTGGG	118
MDC004582.94	C/T	protochlorophyllide oxidoreductase A	TGTTCAAATCTTCCAGCAGCA	GCTCGTGTGTAATGCTGCTG	137
MDC005276.240	G/A	NAD(P)-binding superfamily protein	GCCTCCATCACCTGCTTCTT	TCAATGCTATTGCCCGTGGT	88
MDC006621.191	A/C	intergenic	ACAGTAGAGTTTGATTTGCCCCT	TGTTTTCACTCCAAACACCAACT	133
MDC006639.149	C/T	cell elongation protein / DWARF1	GAAGCCCCAATGTTCCCTGA	TTCTTGCAGATGGCCGAGTT	96
MDC006684.239	G/A	O-Glycosyl hydrolases 17 protein	TCTGACTTGCGGCTCAAAGT	GCATGTTTGGGGATGTTCGG	101
MDC006833.367	C/G	Calcium-dependent lipid-binding protein	ACAGCCAACATCAGCTCTCC	TCCTCCTGACAGTCCTCTGG	87
MDC008445.171	C/T	chaperonin 20	CGCTGATGCCCACTTTTGTC	AAACCGGCGGTGGAATTTTG	114
MDC009250.268	T/C	alpha/beta-Hydrolases superfamily	TTCCAGTGTCGAGGGATCCT	AGTTCCGCGTCAAGTGAGAG	126
MDC009297.162	A/G	actin 7	GTCTCGTCCAGCAAGGTCAA	GTGCTTGACTCTGGTGATGGA	99
MDC009752.161	A/G	pumilio 1	AAGCTGCCTGGCATGATTCT	CGCGTTTTCCAGCATGAACT	142
MDC010692.100	G/A	Mov34/MPN/PAD-1 family protein	TGCCAATGTAGGAAGGCAGG	CAGTGTCGAGCATTGTTCCC	104
MDC011349.124	G/A	respiratory burst oxidase homologue D	ATGCAACCGCCATCAAAACC	ACAGCGATGACTACGAGCTG	126
MDC011437.437	A/G	UDP-Glycosyltransferase family protein	TGTCCTTCCCTGGTCAGAGA	TACACATGGGTCAGCTGCAG	95
MDC012729.141	C/T	COP1-interacting protein 8	TGAAGGCGAAGAGAACCAGG	GCCCAATCCAGAATCCGGTT	141
MDC013033.69	G/A	NAC domain containing protein 2	TCCCAGGGGTCGAACTTGTA	GACGGACGAAGAGCTAGTCG	108
MDC013255.329	A/G	ribosomal protein L5 B	TGAGACCAACTTCAAGCCCA	GCCCAAATTGTATCTGCCAGC	94
MDC013370.143	T/C	MDP0000678862:cds	TAGGTTCCCGTTCAGGCATG	TCTTGGTCGTGGTCATGGTG	84
MDC013467.418	G/A	envelope membrane of chloroplasts 159	TAGTTGTTCGGAGCTGCTGG	TTTCCCTCGGGCGAAACTAC	98
MDC017371.127	T/C	Stabilizer of iron transporter SufD	GGCCACCCATCAAGTTCCTT	TGCACTCTCTTGCTGGACAG	136
MDC017906.52	G/T	NAC domain containing protein 83	ACTGGGTTCTTTGCCGCATA	AACAGGCCTCGAGTTCTTGG	110
MDC018518.81	T/C	SAUR-like auxin-responsive protein	AGTACAGGCCGAAGAGGAGT	TCCTCGATGCTCAAGAACCG	141
MDC018809.596	T/G	monodehydroascorbate reductase 1	TAGCCTTGTTCTCCTCCGGA	CTGTGCTCTTCGGAGACAGT	123
MDC019312.167	T/G	coatomer gamma-2 subunit	AAGGAGGTTAAGTCGCAGCC	GCATCAACTGTGGATGCAGG	101
MDC019909.124	T/C	DC1 domain-containing protein	AGTCGCTCTTCGGTGAAAGG	GAAAAGTGCCCTTGAGTCGC	148
MDC039955.18	T/C	NADH-dependent glutamate synthase 1	TTCCACCGGAAGATGTCAGC	CCTTTGAAGCCACTCCCCAT	146
MDC000414.122	T/C	isoamylase 3	CAGGCAGCTTCGGAATGCTA	TCTCCCAATGACATCGTGCC	118
MDC000453.153	A/G	alanine-2-oxoglutarate aminotransferase 2	ACAAACAACATTTCTGCAGCTGT	TGCAGCAAAGGGATCCTTGA	84
MDC000453.153	G/A	alanine-2-oxoglutarate aminotransferase 2	ACCATGGAAAAGCAGAACAGC	ATGGTCAACCCTCCCAAACC	143
MDC000697.296	G/A	Ribosomal protein L6 family	TCGACAGAAATGCCATGTCA	ACGCAAAAACAAACACCCTTCA	113
MDC000727.1264	T/G	ubiquitin-specific protease 6	TCCTCCGGAGAGTTTGGTGA	TGGTTCAAGGGAAATGGATCCA	83
MDC000757.377	T/G	intergenic	CTCGTGCAGATTAAGGGAGTCA	GCATGGTGCAGTTTAAACTTCA	150
MDC001307.439	T/C	RING/U-box superfamily protein	AACACCGCACAGTAGTCGTT	ACAGGAGACTACTGCTTGATGAC	133
MDC001616.305	C/G	intergenic	ACAGGAGGGAGGATGTCGAA	CTGAGATCCTTGACGGTGGC	131
MDC002470.355	G/A	carotenoid cleavage dioxygenase 1	TCCTGGCGAATGAGGAAAGC	GCTAGAAGCTTCCCATGGTGA	120
MDC002602.408	C/G	vacuolar ATP synthase subunit A	ACTTCAGAGATATGGGCTACA	AATTACCAGCCGCCCAGAAA	95
MDC002841.101	G/T	Ribosomal protein S11 family protein	TCAGCATGTGACTGATCTGTCA	CCCAACATGAGCCAATGGTG	128
MDC003115.218	A/T	ADP-ribosylation factor A1B	CCAGACGGTGAAGCTGATGT	TCACTTCTCTGATGTCTTGTGGA	140
MDC004070.283	T/C	Uncharacterised protein family	AGCAGCTTCCATGGAAACCA	AGAGGTAGTCGGGTTTGGGG	110
MDC004461.290	A/G	intergenic	TGTCCATACAGTTTCGACGC	GGTTGTCCTACGCTTTCCGA	112
MDC005247.512	T/C	Ribosomal protein S4 family protein	ACAGGCTCGTGGTTTGAAGA	GGAACGACAACCATTGCACG	144
MDC005247.512	G/A	Ribosomal protein S4 family protein	CAAGCCTTCGTCTGGACCTC	CGGTCCTCACTTTCCCATCA	149
MDC005445.136	C/T	pyrophosphorylase 4	GCATGAGTGGGTGAAGGTCA	CGGCGCTTCTTTGAGGACTA	139
MDC005694.146	A/G	Rubredoxin-like superfamily protein	TGCAGAGGATGAGCATGATG	CCATCCGGTCCAATTCAGGG	148
MDC005697.432	G/C	tubulin alpha-2 chain	GGAAATGAGCTGCTCAGGGT	CACCTTCTTCTCCGAGACCG	133
MDC005923.474	G/A	20S proteasome beta subunit E1	GCCCGAACCAACAGAAAACC	ATCCTCGTTTGAGTGCAGGG	90
MDC006455.356	A/G	homology to ABI1	TGGGTCTACAGCTGTCGTTG	TCAGTACGCCATAAACACATGC	147
MDC007040.105	C/T	citrate synthase 2	TTGTGAGTGCGATGAGTGCT	GCATCGAACAATGGACCCCT	138
MDC007099.161	T/A	UDP-D-galactose 4-epimerase 1	GAGCCCCGACAGGATTGAAG	AGGGATGCATCCTTTGTCTTCT	138
MDC007394.373	C/T	O-Glycosyl hydrolases family 17 protein	ATTTTGCCACGCACCACTTC	CGTTGTGTGATTTAGGATGGTGC	118
MDC008133.431	G/A	Protein of unknown function (DUF581)	GGTAACACACCGTTTTGCAGT	ACGGTTTTGTTAGCGGTGGA	137
MDC008385.321	C/T	glyoxylate reductase 1	ACCGGAATGACGCACAAGAA	GCATTCTTGAGCAGATTTGTGC	147
MDC009092.100	A/G	stromal cell-derived factor 2-like protein	GATCTCGACACTGGCTACGC	GTACGTGACCTGCCCAGATC	144
MDC009177.321	A/G	tripeptidyl peptidase ii	ACTTCGAAGGTAGTCAAGGCC	TCTCAAGGAAGATGCAGGAA	142
MDC009229.176	T/C	IQ-domain 21	CAACAGCAATGGCATGGCTT	TGAGCATTTTCCAGCGGAGA	113
MDC009297.162	A/G	actin 7	CCTGTAGTACGCCCACTAGC	TGAATCCTAAGGCCAACAGGG	121
MDC009552.126	A/G	Pyruvate kinase family protein	AACTGGCATTGTGGGTCGAT	ATTCTGGTGGGTGCATTTGG	132
MDC010328.215	T/C	Class II aaRS and biotin synthetases	TGCGAAGGAAAAACGAGATGC	TCATCACACCAAGGAGCCAA	105
MDC010706.416	T/A	Late Embryogenesis Abundant 4-5	TTGGTCGCATTCCCACCTAC	TCACCAGATGTCCGCACTTC	150
MDC010707.221	T/A	EamA-like transporter family protein	AGATGATGCAAATCGCCTTTG	GGAGCATCTTTGGTTCCATTGC	92
MDC011159.221	A/G	RING/U-box superfamily protein	GAACGAGAATGCGACAACGG	TGCTTGTTCCCCCGATTTCA	148
MDC011198.306	T/G	Leucine-rich repeat protein kinase	TTGGGACGGATGTTTACCCG	CCGAGATTCGCAAGTCCAGT	101
MDC011283.417	T/C	intergenic	CCATGACGAAACCGAATCGC	TGGGATTTGATGATTTGGGTGT	122
MDC011443.229	T/C	regulatory particle AAA-ATPase 2A	GTGGGAGCTCAACTGCTTCT	GGTGCTTTCTGTTGTTGGGC	149
MDC011610.336	C/T	heteroglycan glucosidase 1	CATCCAGCAGAGCGGTACTC	TTCATGTGGTGATTGCAGGG	97
MDC011703.39	T/A	MDP0000775972:cds	GAACCGGTTTCGACTCCACA	GGTGTCCGAGGAGGTTGAAG	122
MDC011914.230	A/G	Leucine-rich repeat (LRR) family protein	ATTGATACGCAGGCGGCTTA	TCGTTTCCAGTTCTCTGAAAA	116
MDC012026.355	T/G	chlorsulfuron/imidazolinone resistant 1	ACCCAGCAAATGAGTCGGAG	TACGGACCAGGAGTGTCCAA	136
MDC012278.208	G/A	intergenic	AGGATTCATCTGTTCTGGCACA	CACAGATCAAGACGAGGCCA	121
MDC013249.318	A/T	Protein kinase superfamily protein	ACGTGATCAGCTTGCGAAGA	CTTGGCGGAACATGGTGTTG	123
MDC013437.191	G/A	intergenic	TCTTCCGAACCTCCTTTGGC	TGCTGGACATGGGGTTTGAA	108
MDC013823.203	T/C	Protein of unknown function (DUF506)	TGTTCTTTTGCAGAGGCCGA	GCCGCCAAGAAATGCATGAA	99
MDC013824.133	C/G	ATPase E1-E2 type family protein	GGACCTACCTTGAGACATAACT	ATGCTTCATTCTCCGGCCAA	139
MDC013836.179	T/C	Inorganic H pyrophosphatase	AACGTGCACGAGTGGTTTTG	CTGGAGGCGCATGGGATAAT	118
MDC013836.179	A/G	Inorganic H pyrophosphatase	GCATACCAGTTCTTGACAGCC	CAGTGAGATCGAACCCGCTT	150
MDC013848.311	C/T	Protein of unknown function (DUF581)	CTTTGCCGTGGCCAAGATTC	TTTTCTCCCGGCAGGAAGTC	97
MDC015282.549	C/T	cystatin B	ACCCTCCTGACCTTTTCCTT	TTTCGCCTTCACAACCCTCA	122
MDC015470.252	G/A	RELA/SPOT homolog 3	TCTGTGCAAGAGTATCCTGCA	GAACCCGTACGGAGTCCATC	90
MDC016054.80	A/C	UDP-Glycosyltransferase	TCCTTGATGTATGGAGCAGGA	CACGGGGATGTTCCTGTCAA	136
MDC016112.100	T/C	Stabilizer of iron transporter SufD	ATGACAGGTTGTGGCCTCAC	CCAGTTACAGTGCCCCTCTG	138
MDC016219.172	C/A	Adenine nucleotide alpha hydrolases	AGAGTCGCAGCACTCTTTGG	AGGATGAAATTTTGAAGAAGCAA	87
MDC016248.191	A/T	methyltransferases superfamily protein	CCTGCTCTTAATGCATTCGACG	CCTGTGCTGGAAGAAGGTGA	85
MDC018099.109	A/G	nucleoside triphosphate hydrolases	AGTCTCAACCGAAAGCTCAGA	CCGACTCAATTTTCAGGTGCA	137
MDC018099.109	A/G	nucleoside triphosphate hydrolases	ACCCCTGCAAAGGTTACTGG	AAGCATGAGCACACACCTCA	121
MDC018296.41	C/T	MDP0000261713:cds	GTATCACCGGCATCCAGCTT	GCATGAAAAGGAAATGCCAGC	144
MDC018954.138	T/G	zinc finger superfamily protein	TGCATGTTCATGCCTCAGGT	CTGCAAGTGGACTGTGCATG	89
MDC019089.170	G/A	Transducin family protein	TGGGACATGGACAACACTCA	CGAGGGCTTGCCTAGGAATT	149
MDC019312.167	T/G	coatomer gamma-2 subunit	CACTCTGCCTGTCAGGTCAT	AACTGCAGGGATGCCTTCTG	150
MDC019581.293	A/G	Protein kinase superfamily protein	CGTCAAGCTTCTTCACTGCC	CTGTGGAGGAGCTGAAAGAGA	129
MDC021673.67	T/G	intergenic	GAGGAGATCCAGCCTTCTGC	ACCTGAAATGAAATGGCTGGT	96
MDC021750.166	A/G	GTP binding Elongation factor	GGCTCACCTTGTTGCAGCAG	CGGAGGTTTTGAAGCCGGTA	110
MDC022126.96	A/C	GTP-binding protein	TAGCCTGTTGATGCTGGTGC	CAGCTTCCCGGGCTTCTATC	137
MDC022171.193	A/T	Protein kinase superfamily protein	TTTGCAAAACTATTCCGCAG	AGACTTTGCTGTCCACGAGG	143
MDC022588.206	A/G	NADP-malic enzyme 4	ACTCTAGTTCTTGAACCCGGT	TTCCAGGTTTGGCTACTCGC	144
MDC022716.123	C/T	translation initiation factor 3B1	CGATCCTGCTCGCTCAAGAA	AAGGCCACCATCATTGCTGA	123
MDC022728.65	T/C	Protein of unknown function (DUF3506)	AATCCACGGTTAGACTGGCG	TGCTGGCCAGGTTTATAGCT	145
MDC023119.21	C/G	ENTH/VHS family protein	GGTGGAGAACAGACAGGCAA	TTGGGTTCTCAGTTGCAGCA	145
MDC037826.18	A/G	UDP-glucosyl transferase 88A1	TGAAATCCTTGCTCCCGGAC	CACAAACCCACCCACTGAGT	116
MDC039955.18	C/T	NADH-dependent glutamate synthase 1	AAAATTTGCAGGAGAACACTG	AACCCGACCAGTAAACTCGG	140

사과 RNA-Seq data를 이용한 SNP 분석

본 연구의 목적인 적색 과육 사과 품종과 백색 과육 사과 품종을 구분할 수 있는 분자표지를 개발하기 위해서 사과 NGS 데이터를 참조 제놈에 매핑하여 genome wide SNP를 찾고, 적색 과육 품종인 ‘Redfield’와 백색 과육 품종인 ‘Granny Smith’에서 탐색되는 다형성을 나타내는 SNP를 선발하였다. 참조 제놈과 주석 정보는 JGI Phytozome에서 사과(Malus domestica) 제놈을 사용하였고, 사용한 염기서열은 881,278,625 bp이고 전사체 수는 63,517개, 전사체의 총 염기서열은 71,132,322 bp이다. ‘Redfield’의 총 read 수는 353,980이며 총 염기서열 길이는 213,441,953이고, read의 평균 염기서열 길이는 602.98 bp로 전사체 대비 범위가 3×이고, raw reads 대비 확보된 수치가 44.89%로 총 95,811,160 bp를 분석에 사용하였다. ‘Granny Smith’의 총 read 수는 214,679이며 총 염기서열 길이는 129,247,804이고, read의 평균 염기서열 길이는 602.05 bp로 전사체 대비 범위가 1.82×이고, raw reads 대비 44.54%를 확보하여 57,564,661 bp를 분석에 사용하였다. 참조 제놈 대비, 배열 결과 ‘Redfield’는 정리된 read 중에서 73.52%의 read가 매핑되었고, ‘Granny Smith’는 71.71%의 read가 매핑되었다. ‘Redfield’와 ‘Granny Smith’에서 찾은 SNP를 매트릭스로 만들어 변이 과정을 거친 후, 동형 SNP와 이형 SNP로 나누어 정리하였고(Table 1) SNP 선발 조건은 3 이상으로 하였다. ‘Redfield’와 ‘Granny Smith’의 SNP 비교분석은 동일한 SNP 위치에서 두 품종간에 서로 동형 SNP인 경우만을 선발하였고, 그 결과 다형성을 나타내는 SNP 554개가 선발되었다. ‘Redfield’와 ‘Granny Smith’ 간에 탐색되는 SNP 554개의 주석(JGI Phytozome)을 찾은 결과 전사체 수는 323개이고, TAIR10_ID 기준으로는 288개이다. SNP 수와 전사체 수가 다른 이유는 참조 제놈의 유전자는 한 개의 SNP 위치가 한 개 이상의 전사체에 포함될 수 있기 때문이다.

Anthocyanin 생합성 관련 유전자 탐색 및 HRM 분석

‘Redfield’와 ‘Granny Smith’ 간에 탐색되는 polymorphism SNP 554개 중에서 103개의 프라이머 조합을 이용하여 HRM 분석을 하였다(Table 2). 103개의 SNP 분자표지의 유전자 정보를 분석하여 탐색한 색소 생성과 관련된 유전자는 carotenoid cleavage dioxygenase1으로 C₄₀ carotenoids의 이중결합을 분해하여 다양한 apocarotenoids을 생성하는 기능을 가지고 있다(Floss and Walter 2009). 이 유전자로부터 유래한 SNP 분자표지는 사과 적색 과육 품종 10개와 백색 과육 11품종이 구분되지 않았다. 과육 색에 따른 21품종의 사과를 적색과 백색 2군으로 구분할 수 있는 SNP 분자표지는 2종이었다(Fig. 1). SNP ID, MDC000453.153의 유래는 alanine-2-oxoglutarate aminotransferase 2로 식물의 잎에서 peroxisomes에 위치하며 광호흡에서 glycollate pathway에 관여하는 것으로 알려져 있다(Noguchi and Hayashi 1981). 이 유전자의 기능은 색소 생성과는 직접적으로 관계가 없지만 ‘Redfield’에서는 G 염기서열이 ‘Granny Smith’에서 A로 바뀌어서 적색 과육 사과 10품종과 백색 과육 사과 11품종을 구분할 수 있었다(Fig. 1A). SNP ID, MDC005247.512의 유래는 ribosomal protein S4 (RPS4A) family protein으로 ribosomal RNA에 binding 하는 기능을 갖고 있는 것으로 알려져 있으며(Lin et al. 1999), ‘Redfield’에서는 G 염기서열이 ‘Granny Smith’에서 A로 바뀌어서 21품종의 사과를 적색과 백색 2군으로 구분할 수 있었다(Fig. 1B).

Figure 1.

HRM analysis of 10 red flesh apple cultivars (Redfield, Jay Darling, Pink Wood, Makamilk, May Pole, Okanagan, Red Flesh, M. pulila Royalty, Crimson Glory, Purple Wave) and 11 white flesh apple cultivars (Court Pendu, Priam, End Blue Green, Mutsu, Northwest Greening, Lodi, Kinsei, Tumange, Bulmer Normern, Amere, Granny Smith). (A) Normalized graph of SNP ID, MDC000453.153 (B) Normalized graph of SNP ID, MDC005247.512. Green line colors indicate white flesh apple cultivars and blue line colors indicate red flesh apple cultivars

MdMYB10 유전자에서 유래한 기존의 SNP 분자표지 개발 방법은 MdMYB10 유전자의 인트론 부분의 4개의 염기서열에서 indel을 발견하여 SNP 분자표지로 개발하였으며(Chagne et al. 2007) 본 연구에서는 기존에 알려진 anthocyanin pathway에 관여하는 유전자뿐만 아니라 다른 기작에 의해서도 사과 적육계와 백육계를 구분할 수 있는 SNP 분자표지를 개발하고자 RNA-Seq data를 사용하였다. 본 연구에서 개발한 2개의 SNP 분자표지가 적육계 사과 품종과 백육계 사과 품종을 구분할 수 있는 정확한 기작에 대해서는 앞으로 연구를 계속 진행해야 할 것이다. 또한 더 많은 유전자원과 교배집단에 적용하여 분자표지로서의 가능성이 있는지 확인할 필요가 있다. HRM 분석 방법에 의한 SNP 분자표지 개발은 재현성 실험 결과가 확보되어야 하고, 구분하고자 하는 개체수가 많을수록 정확성이 높다고 볼 수 있다. 고부가 기능성 사과 품종을 육성하는데 있어 전통육종방법은 적색과육과 같은 특정형질만 발현시키는 데 오랜 시간과 노력이 필요하다. 과수분야에서 특정 유전자를 발현시키는 분자육종은 국내에서도 사과, 포도, 키위 등에서 연구가 되고 있다(Kim and Song 2010). 또한 비교적 일차 대사율이 낮은 종자나 과실 등의 조직에서는 특이적으로 flavonoid 생합성을 유도하는 것이 프로모터의 개발을 통해 가능한 결과지만(Allan et al. 2008) 현실적으로 과수 형질전환체의 개발과 보급은 단시간 내에 이루어질 수 있는 연구가 아니기 때문에 전통육종방법을 활용하여 식미가 좋은 적육계 계통의 사과를 육성하는 것이 시급하다. 사과는 재식 후 2~3년이 경과되어야 과실의 특성을 볼 수 있기 때문에 적육계 계통 선발을 위한 교배 집단에서 분자표지의 개발은 육종 연한을 단축시킬 수 있는 중요한 수단이다. 본 연구에서는 고부가 기능성 품종으로 사과 적육계 계통을 육성하기 위해 전사체 분석방법으로 적육계와 백육계에서 차등으로 발현되는 유전자들을 분석하였고, HRM 방법을 이용한 SNP 분자표지를 개발하여 사과 유전자원 21품종에 적용하므로써 과육색을 구분할 수 있는 분자표지의 가능성을 검토하였다. 앞으로 anthocyanin의 내재 생합성 조절 기작에 대한 연구를 통해 기존에 보고되지 않은 새로운 유색관련 분자표지를 개발하고 이를 다양한 유전자원과 교배집단에 적용하여 육종연한을 단축할 수 있는 방향을 제시하고자 한다.

과육색이 다르게 발현되는 사과(Malus domestica L.) 품종의 유전자 발현을 비교하기 위해 2개의 cDNA library를 제작하였다. 붉은 색 과육 품종인 ‘Redfield’와 백색 과육 품종인 ‘Granny Smith’의 유전자 발현 차이를 보기 위해 차세대 염기서열 분석(NGS) 기술을 사용하였고 두 품종으로부터 얻은 EST의 염기서열을 결정하고 기존에 보고된 유전자와의 상동성을 분석하였다. HRM 기술은 붉은 색 과육 품종 사과와 백색 과육 품종 사과의 짧은 PCR 증폭산물에서 한 개의 서로 다른 염기서열을 구분하여 분리해낼 수 있다. ‘Redfield’와 ‘Granny Smith’의 EST database로부터 103쌍의 단일염기다형성(SNP) 분자표지를 선발하였고, 붉은 색 과육 품종 10개와 백색 과육 품종 11개를 구분할 수 있는 SNP 분자표지를 HRM 방법으로 분석하였다. 본 연구에서는 사과 EST database를 기반으로 HRM 분석 방법을 이용하여 사과 품종의 적육계와 백육계를 구분할 수 있는 효율적인 SNP 분자표지를 개발하였다. 이러한 SNP 분자표지는 사과육종에 유용하게 사용할 수 있으며 사과 품종의 다양한 색 변화에 관한 분자 기작 연구에 좋은 참고자료가 될 수 있을 것이다.

본 연구는 농촌진흥청 연구과제(세부과제번호:PJ010272 022017)의 지원에 의해 이루어진 것임.