삽주(Atractylodes ovata (Thunb.) DC.)는 삽주속(Atractylodes spp.)에 속하는 국화과(Asteraceae) 다년생 초본 식물로 우리나라, 중국, 일본 등에 자생하고 있다. 우리나라에서 재배되고 있는 삽주 속으로는 삽주(A. ovata (Thunb.) DC.)와 중국에서 들여온 큰꽃삽주(A. macrocephala Kodiz.)가 있다. 삽주의 뿌리는 예로부터 소화 장애, 암, 골다공증, 비만 등의 질환에 효능이 있어 대부분의 한약재에 들어가는 주요한 재료로 사용되었다(Zhang et al. 2021; Zhu et al. 2018). 삽주의 뿌리를 한약재에서는 일반적으로 백출이라 부르며 대한약전(제2022-36호, 의약품각조 제2부)에 따르면 백출(Atractylodes Rhizome White)은 삽주(A. ovata (Thunb.) DC.)와 큰꽃삽주(A. macrocephala Kodiz.)의 근경으로서 원뿌리 혹은 주피를 제거한 것으로 규정하고 있다. 삽주의 뿌리는 10월 말에서 11월 초 사이에 수확하며 줄기와 잎, 흙을 제거하고 말린 후 잔뿌리를 제거하고 사용한다. 뿌리의 형태는 불규칙하게 구부러진 덩어리로 길이는 3~8 cm, 지름 2~3 cm이며 회갈색 또는 흑갈색을 띤다.

삽주에 포함되어 있는 성분은 atractylon, atractylenolide I, II, III 등의 정유성분과 atractyloside A, B 등 sesquiterpene glycoside 및 atractan A, B, C와 같은 다당체가 있다(Jun et al. 2018; Yun et al. 2013). 최근 연구결과에 따르면 삽주 뿌리에 있는 atractylenolide I 이 알레르기성 아토피 피부염을 완화하는데 효과가 있다는 것이 보고되었다(Lim et al. 2012). 그 외에도 항종양, 항염증, 항노화, 항산화, 항골다공증, 신경보호, 면역조절 활성, 위장기능 및 생식선 개선 등의 다양한 약리효과가 있다고 보고되었다(Zhu et al. 2018).

우리나라에서 재배되고 있는 삽주 속으로는 삽주(A. ovata)와 큰꽃삽주(A. macrocephala)가 있으며 이 두 속이 임가에서 대부분 재배되고 있다. 그러나 국내 자생종인 삽주(A. ovata)는 종자 결실률이 매우 낮고, 근경의 생장 속도가 느리며 생산량이 적어 임가에서는 종자번식이 용이 하며 재배기간이 짧은 중국 도입종 큰꽃삽주(A. macrocephala)를 대부분에서 재배·생산하고 있다. 그러나 최근 큰꽃삽주 또한 습해에 약하고 뿌리병의 발생 등으로 인해 생산이 저조해지고 있는 상황이다(National Institute of Horticultural and herbal science 2016). 국내 삽주의 생산량은 2017년 167.2톤이었으나 2020년에는 112.0톤으로 감소하였고(Korea Forest Service 2018; 2021) 수입량은 2020년 658.4톤, 2021년 928.6톤으로 증가하여 대부분을 수입에 의존하고 있는 실정이다(Animal and Plant Quarantine Agency 2021). 또한 큰꽃삽주에서 ‘삽주 약한 모틀바이러스(Atractylodes mild mottle virus: AMMV)’가 발견되면서 큰꽃삽주 뿐만 아니라 토종 삽주(A. ovata)에도 많은 피해를 주고 있으며, 뿌리 역병 등으로 생산량에 좋지 않은 영향을 미치고 있는 실정이다. 이러한 이유로 종자에 의존하지 않고 우량 개체를 기내에서 영양번식 방법으로 계절과 환경에 구애 없이 대량생산이 가능한 약용자원의 조직배양기술 개발 연구가 필요한 실정이다. 또한 조직배양기술을 이용한 바이러스가 없는 무병묘 혹은 역병 등의 저항성개체를 생산할 수 있는 기술개발의 요구가 이어지고 있다.

삽주의 기내증식에 관한 연구는 거의 보고된 것이 없으며, 주로 기능성 물질에 관한 연구보고가 대부분이다. 기존 삽주 속의 기내증식에 관한 연구로 토종 삽주(A. ovata)에서는 BA와 IAA 혼합처리한 배지조건에서 아배양 방법을 이용한 신초 줄기증식에 관한 연구가 전부이다(Noboru et al. 2003). 큰꽃삽주(A. macrocephala)에서는 BA와 IBA가 첨가된 배지에서 액아배양을 이용한 신초 증식(Zhu et al. 2006), TDZ와 NAA 혼합 처리 배지에서 액아배양을 이용한 신초 증식(Bizeng et al. 2009), 그리고 TDZ와 NAA가 혼합 첨가된 배지에서 자엽과 배축으로부터 부정 신초 재분화 연구가 보고되었다(Yuling et al. 2020). 좁은잎 삽주(A. lancea)에서는 BA와 IAA가 함께 첨가된 배지에서 신초 다줄기를 유도하였고(Yukihiro et al. 1987), BA, kinetin, NAA와 IBA가 첨가된 배지에서 아배양을 이용한 줄기 증식 연구(Yun et al. 2010), 그리고 아배양을 이용하여 BA와 NAA가 함께 첨가된 배지에서 신초 유도 및 줄기 증식에 관한 연구가 보고되었다(Song et al. 2018). 교배종 삽주에서는 BA와 NAA첨가배지에서 액아배양을 이용한 줄기증식 등에 관한 연구가 전부이다(Koo et al. 2011).

본 연구는 우리나라 자생 삽주의 안정적 증식기술 개발을 위해 기본적이고 적용가능한 조직배양기술 및 건전한 바이러스 제거 혹은 병저항성 개체의 생산을 위한 기반기술 개발을 확립하기 위해 수행하였다. 또한 기술개발을 통해 약용자원으로서 이용 가치가 높으나 국내 생산량이 현저히 낮고 수입 의존성이 높은 국내 자생 삽주의 대량생산체계 확립을 위한 목적으로 본 연구를 수행하였다.

실험재료

본 연구에서는 삽주(Atractylodes ovata (Thunb.) DC.)의 종자를 기내로 들여와 기내식물체 확립 후 6개월 간 계대배양 하고 새로운 배지에 6주간 배양한 한 식물체를 재료로 사용하였다. 모든 실험의 기본배지는 1/2MS (Duchefa, Netherlands) 배지에 2% sucrose (Duchefa, Netherlands), 0.3% gelrite (Duchefa, Netherlands)를 기본배지로 사용하고, pH 5.7을 맞추어 사용하였다. 배양조건은 온도 25 ± 2°C, 광 조건 70 μmol m^-2 s^-1 냉백색 형광등, 16시간 조명 하에서 모든 배양을 수행하였다.

신초 유도 및 줄기 증식

신초유도 및 증식을 위해 cytokinin류 4종, 6-benzylaminopurine (BA; Duchefa, Netherlands), zeatin (Duchefa, Netherlands), kinetin (Sigma-Aldrich, Germany), thidiazuron (TDZ; Duchefa, Netherlands)을 각각 0.5, 1.0 mg/L 농도로 처리하였다. 신초 유도 및 증식을 위한 기본 배지는 MS 배지에 2% sucrose, 0.3% gelrite가 첨가된 배지를 사용하였다. 배양용기는 유리배양병(450 ml)을 사용하였으며 식물체는 병당 2개씩 접종하여 처리별로 5반복하였다. 유도된 신초의 생육을 위해 배지는 배양 8주 후 호르몬 무첨가 배지로 계대배양하였다. 신초 길이신장 배지는 1/2MS 배지에 2% sucrose, 0.3% gelrite가 첨가된 배지를 사용하였다. 배지조제 시 BA와 kinetin은 배지 멸균 전 첨가하였으며, zeatin과 TDZ는 멸균 후 필터링하여 사용하였다. 배지의 멸균 조건은 121°C에서 15분간 멸균하여 사용하였다. 모든 식물체의 배양환경은 25 ± 2°C에서 광 조건은 70 μmol m^-2·s^-1 냉백색 형광등 하에 16시간 조명을 유지하였다. 배양 8주 후 cytokinin 처리 농도별 지상부 식물체의 길이, 신초수, 엽장, 지상부 생중량 그리고 지하부 생중량을 조사하였다. 모든 실험은 처리구별 동일한 날에 진행되었다.

엽면적 및 엽록소 분석

배양 8주 후에 처리별 식물체의 정아부 아래 5번째 엽까지의 엽면적을 측정기(YMJ-C, CHINCAN, China)를 이용하여 측정하였으며, 처리별 20반복으로 수행하였다. 엽록소 함량은 정아를 제외한 아래 2, 3, 4번째 엽을 재료로 사용하였으며 엽록소 측정기(CCM-300, OPTI-SCIENCES, USA)를 사용하여 처리별 20반복하여 측정하였다.

순화 및 토양이식

기내 생육 식물체의 순화를 위해 건전한 식물체를 선발하여 인공상토에 이식 후 순화하였다. 기내식물체 뿌리부위의 배지는 흐르는 물에서 모두 제거한 후 인공상토인 펄라이트(perlite)와 버미큘라이트(vermiculrite)를 1:1 (= v:v) 혼합한 것에 식재하여 순화하였다. 순화 직후부터 90%의 공기 중 습도를 2주간 유지하였으며, 2주 이후 60%의 습도를 유지하며 순화하였다. 순화실은 25 ± 1 °C, 70 μmol m^-2·s^-1 냉백색 형광등, 16시간 조명 하에서 4주간 생육 후 온실로 이동하여 30일 뒤 생존율을 조사하였다.

통계분석

통계분석은 SPSS (version 25.0)를 이용하여 일원배치분산분석(one-way ANOVA)과 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)로 유의수준 5% (p ≤ 0.05) 하에서 검증되었다. 모든 결과는 평균 ± 표준편차(means ± SD)로 나타내었다.

신초 및 증식에 미치는 cytokinin의 효과

삽주의 신초 증식을 위해 네 가지 cytokinin을 종류별, 농도별로 각각 처리하였다. 절편당 신초 유도수는 1.0 mg/L kinetin과 0.5 mg/L TDZ 처리에서 평균 3.8개와 4.0개로 가장 많은 수의 신초가 유도되었다. 1.0 mg/L BA 처리에서는 평균 2.8개, 0.5 mg/L와 1.0 mg/L zeatin 처리에서는 각각 평균 2.4개의 신초가 유도되어 평균 1.6개가 유도된 무처리구와 비교하여 1.8배 이상의 많은 신초가 유도되었다. 그외 0.5 mg/L BA 처리에서 평균 1.4개, 0.5 mg/L kinetin 처리에서 평균 2.0개로 무처리구와 비교하여 신초 유도수는 저조하였다(Table 1). 신초 유도수의 경우 모든 cytokinin 처리에서 고농도 처리(1.0 mg/L)가 저농도 처리(0.5 mg/L)보다 유도 개수가 많은 것을 확인하였다(Table 1 and Fig. 2).

Table 1 . Effects of four cytokinin types on the shoot growth of the Atractylodes ovata.

Treatments	Conc. (mg/L)	No. of shoots	Shoot length (cm)	Length of leaf with petioles (cm)	Leaf area (cm2)	Fresh weight of shoot (g/plant)
Control	-	1.6±0.5b	5.3±0.4abz	4.8±1.4cd	398.9±112.6bc	0.6±0.1b
BA	0.5	1.4±0.9b	5.8±0.6a	6.1±1.6a	526.3±155.8a	0.8±0.1ab
	1	2.8±1.1ab	6.3±0.7a	5.9±1.5ab	454.1±172.1ab	1.0±0.3a
Zeatin	0.5	2.4±1.5ab	6.0±1.2a	6.3±1.6a	508.5±212.1ab	0.9±0.2ab
	1	2.4±1.3ab	5.4±0.5ab	4.8±1.5cd	311.2±109.5cd	0.7±0.2b
Kinetin	0.5	2.0±0.7b	6.0±0.2a	5.2±1.5bc	470.5±203.4ab	0.8±0.2b
	1	3.8±1.9a	4.8±1.3b	4.3±1.6d	298.5±138.6cd	0.9±0.2ab
TDZ	0.5	4.0±1.4a	3.0±0.2c	3.4±0.9e	195.5±71.3de	0.4±0.2c
	1	1.6±0.6b	3.7±0.5c	3.1±0.7e	138.9±59.2e	0.3±0.1c

^ZMean seperation within columns by Duncan’s multi range test (P ≤ 0.05).

Figure 2. Effects of cytokinin types and concentrations influenced on in vitro plantlets on A. ovata after 8-week of culture

유도된 신초 줄기 길이는 0.5 mg/L와 1.0 mg/L BA 처리에서 평균 5.8 cm와 6.3 cm 그리고 0.5 mg/L zeatin 처리와 0.5 mg/L kinetin 처리에서 평균 6.0 cm로 세 처리 간 유의적 차이 없이 줄기길이가 가장 길었다. 1.0 mg/L zeatin 처리에서는 줄기길이 평균 5.4 cm로 두 번째로 줄기생육이 좋았으며 무처리구와 비교하여 통계적으로 유의적 차이를 보이지 않았다. TDZ 처리에서는 두 가지 농도 0.5 mg/L와 1.0 mg/L 처리에서 신초 줄기 길이 평균 3.0 cm와 3.7 cm로 무처리구와 비교하여 1.8배 이하로 모두 길이 신장이 저조하여 생육이 억제되는 것이 관찰되었다(Table 1). 신초줄기 길이 또한 BA 모든 농도처리를 제외하고 각 호르몬의 1.0 mg/L 그리고 TDZ 모든 농도 처리구에서 무처리구보다 길이 신장이 억제되는 것이 관찰되어 삽주 기내 신초의 길이 신장에는 BA가 효과적인 것을 확인하였다(Table 1 and Fig. 2, 3AB).

Figure 3. Shoot regeneration of A. ovata in medium with BA. (A) The proliferation of shoots after 5 weeks of culture, (B) Regenerated in vitro plantlets, (C) Potted plantlets after acclimatization

엽병을 포함한 엽의 길이는 0.5 mg/L BA 처리에서는 평균 6.1 cm, 0.5 mg/L zeatin 처리에서 평균 6.3 cm로 다른 처리와 비교하여 가장 길게 나타났다. 1.0 mg/L BA 처리에서는 평균 5.9 cm로 나타났으며, 다음으로 0.5 mg/L kinetin 처리에서는 평균 5.2 cm로 나타났다. 1.0 mg/L kinetin 처리에서는 4.3 cm 그리고 무처리에서는 평균 4.8 cm로 유의적 차이를 보이지 않았으며, TDZ에서는 두 가지 농도 모두 평균 3.4 cm 이하로 무처리구보다 짧은 엽길이를 보였다. 엽면적은 0.5 mg/L BA 처리에서 526.3 cm²로 가장 넓었으며, 다음으로 1.0 mg/L BA, 0.5 mg/L zeatin과 kinetin 처리에서는 454.1~508.5 cm²의 엽면적을 보였다. TDZ 처리에서는 두 가지 농도 모두 무처리구와 비교하여 엽면적이 1/2 이하로 적은 것으로 나타났다(Table 1 and Fig. 2). 엽록소 함량 또한 1.0 mg/L BA 처리에서 평균 926.2 mg/m²로 높게 나타났다(Fig. 1). 지상부의 생체중은 1.0 mg/L BA 처리구에서 평균 1.0 g으로 가장 높았으며, 다음으로 0.5 mg/L BA와 zeatin 그리고 1.0 mg/L kinetin 처리에서 평균 0.8~0.9 g으로 나타나 TDZ 처리의 경우 두 가지 농도 모두 무처리구와 비교하여 1/3배 이하로 생체중이 낮았다(Table 1 and Fig. 2).

Figure 1. Comparison of cytokinin types and concentrations influenced on chlorophyll contents of the Atractylodes ovata

발근의 경우 1.0 mg/L TDZ 처리구를 제외한 모든 처리구에서 80% 이상의 발근율을 보였으며, 뿌리수 및 뿌리 길이에서는 1.0 mg/L BA 처리에서 높은 결과를 얻었다(Table 2 and Fig. 2, 3A). 그러나 뿌리 생체중의 경우 1.0 mg/L TDZ 처리에서 가장 높았는데 그 이유는 줄기 기부에 뿌리 대신 캘러스가 형성되었기 때문으로, 모든 농도의 TDZ 처리구에서는 줄기 기부에 캘러스가 형성되어 비정상 적인 근계를 보였다(Fig. 2). 유도된 기내식물체는 배양 5주 후 순화하였으며, 인공상토에서의 순화율은 80% 이상으로 정상적인 식물체와 포트묘로 생육하였다(Fig. 3C).

Table 2 . Effect of four cytokinin types on the root growth of the Atractylodes ovata.

Treatments	Conc. (mg/L)	Rooting (%)	No. of roots	Length of roots (cm)	Fresh weight of root (g/plant)	Callus
Control	-	83	26.4±9.6bz	5.4±1.4b	0.6±0.2e	-
BA	0.5	83	22.8±8.9b	5.7±1.2b	0.8±0.4de	-
	1	83	49.2±15.1a	8.0±1.7a	1.6±0.6bc	-
Zeatin	0.5	83	30.8±8.4b	5.5±1.2b	1.0±0.3cde	-
	1	83	30.2±8.0b	5.8±0.8b	1.9±0.7ab	-
Kinetin	0.5	83	25.2±4.6b	6.0±1.2b	1.1±0.2cde	-
	1	83	19.0±8.6b	5.9±1.3b	1.3±0.2bcde	-
TDZ	0.5	83	6.0±2.8c	5.0±1.9bc	1.4±1.1bcd	+
	1	67	3.5±2.5c	4.3±2.3c	2.5±0.6a	+++

^ZMean seperation within columns by Duncan’s multi range test (P ≤ 0.05).

본 연구에서 신초 유도 개수는 줄기길이와 반비례하는 경향을 나타냈다. 신초 유도개수가 가장 많았던 0.5 mg/L kinetin과 1.0 mg/L TDZ 처리에서의 줄기길이 신장은 가장 저조하였으며, 길이 생육이 좋았던 BA와 0.5 mg/L zeatin과 kinetin 처리구에서의 신초 유도수는 평균 2.4개 이하로 저조하였다. 식물호르몬 처리는 신초 증식과 줄기길이 생육을 위한 것으로 일반적으로 첨가한 호르몬의 농도가 증가할수록 증식과 생육이 증가한다. 그러나 어느 이상 지점이 되면 줄기 유도 개수는 증가하나 길이 신장 혹은 발근이 저조해지는 현상이 나타난다(Fratini and Ruiz 2002). 본 연구와 유사한 호르몬 조합을 처리한 렌틸콩(Lens culinaris Medik.)의 경우 줄기증식에서는 호르몬 농도가 증가할수록 신초 유도수가 증가하였으나, 이와 반비례로 길이 신장과 발근이 저조하였다고 보고하였다. 또한 저농도의 zeatin과 kinetin 처리에서는 줄기증식은 저조하였으나 길이 신장과 발근이 우수하여 증식을 위한 적정 호르몬 조건으로 선발하였다(Fratini and Ruiz 2002). 본 연구에서 또한 kinetin과 TDZ 처리구에서 신초 유도 개수가 가장 높게 나타났으나 길이 신장은 매우 저조하였고, BA와 zeatin 처리구에서는 길이 신장이 우수한 것으로 나타났다. 그중 엽장 및 엽면적 등이 우수한 BA 처리구를 줄기 증식을 위한 조건으로 선발하였다. TDZ 처리구는 모든 농도에서 신초 유도수를 제외한 모든 생육이 매우 저조하였다. Cytokinin의 한 종류인 TDZ은 최근 연구에서 높은 농도에서 길이 신장을 유도하는 gibberellic acid 생합성과정(flurprimidol, ancymidol 그리고 paclobutrazol 등)을 방해하여 줄기 생육을 억제한다고 보고하였다(Demir and Çelikel 2019; Miller 2012). 또한 고농도의 TDZ 처리는 캘러스 형성을 증가시켜 본 결과에서 TDZ 처리구에서만 줄기 기부에 캘러스가 형성되어 비정상적인 근계를 형성함으로써 지상부 생육에 좋지 않은 영향을 준 것으로 생각된다. 따라서 TDZ를 제외하고 BA 처리 뿐만 아니라 저농도의 cytokinin 처리는 삽주의 줄기증식 및 생육에 도움을 주는 것으로 판단된다. 기존 삽주 속 수종의 기내증식 연구에서는 cytokinin류 중 BA 처리가 증식에 적정하다고 보고하였고, 단독 처리보다 auxin 등과 혼합처리를 통한 연구가 대부분 이루어졌다. 본 연구에서는 BA 단독 처리에서도 신초 줄기 증식, 길이 신장, 엽면적 및 엽록소 함량 그리고 정상적인 발근 유도까지 모두 우수한 결과를 얻었다. 자생 삽주(A. ovata)는 종자를 이용한 증식이 어렵고 뿌리썩음병으로 인한 생산량 저하로 임가에서 어려움을 겪고 있다. 따라서 이러한 조직배양 방법을 이용한 무병주와 대량 종묘 생산을 위한 기반 기술을 개발함으로써 향후 농가 소득에 이바지할 수 있을 것으로 사료된다.

본 연구는 국내에서 소비되는 약용작물 중 경제적 가치는 높으나 국내 생산량이 적고 수입 의존도가 높은 Atractylodes의 식물 조직 배양 시스템을 구축하기 위해 수행되었다. 삽주는 A. ovata를 사용하였고, 4가지 cytokinins류, 6-benzylaminopurine (BA), zeatin, kinetin, thidiazuron (TDZ)을 2가지 농도(0.5, 1.0 mg/L)로 처리하였다. 4가지 유형의 cytokinin 중 BA 처리는 A. ovata의 신초유도와 뿌리 생육에 효과적이었다. 0.5 mg/L 및 1.0 mg/L BA 모두 BA 처리에서 유사한 결과를 나타내었지만 1.0 mg/L BA가 신초와 뿌리 생육을 촉진하는데 더 효과적이었다. 처리 중 신초의 개수와 뿌리의 생중량(FW)을 제외하고는 TDZ 처리가 신초와 뿌리생육에 효과적이지 않아 본 수종에서는 적합하지 않았다. 본 연구에서는 A. ovata의 아배양을 이용한 기내증식 시스템을 구축하였다. 위 결과는 기내 재분화를 이용한 산림약용자원 A. ovata의 안정적인 생산 및 증식을 위한 기반 기술로 사용될 것으로 사료된다.

본 연구는 산림청 국립산림과학원 연구개발사업(과제번호: FG0700-2018-02)의 지원에 의해 수행되었음.