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Journal of Plant Biotechnology 2015; 42(3): 135-153

Published online September 30, 2015

https://doi.org/10.5010/JPB.2015.42.3.135

© The Korean Society of Plant Biotechnology

식물에서 shikimate 및 방향족 아미노산 생합성 경로와 이의 대사공학적 응용

임선형1,*, 박상규1, 하선화2, 최민지1, 김다혜1, 이종렬1, 김영미1

1국립농업과학원, 농촌진흥청, 전주, 560-500, 대한민국,
2생명공학원, 경희대학교, 용인, 446-701, 대한민국

Received: 14 April 2015; Revised: 11 May 2015; Accepted: 29 May 2015

Biosynthetic pathway of shikimate and aromatic amino acid and its metabolic engineering in plants

Sun-Hyung Lim1,*, Sang Kyu Park1, Sun-Hwa Ha2, Min Ji Choi1, Da-Hye Kim1, Jong-Yeol Lee1, and Young-Mi Kim1

Author Info. +

1National Academy of Agricultural Science, Rural Development Administration, JeonJu, 560-500, Korea,
2Graduate School of Biotechnology, Kyung Hee University, Yongin, 446-701, Korea

Correspondence to : S.-H. Lim e-mail: limsh2@korea.kr

Received: 14 April 2015; Revised: 11 May 2015; Accepted: 29 May 2015

Abstract

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The aromatic amino acids, which are composed of ?-phenylalanine, ?-tyrosine and ?-tryptophan, are general components of protein synthesis as well as precursors for a wide range of secondary metabolites. These aromatic amino acids-derived compounds play important roles as ingredients of diverse phenolics including pigments and cell walls, and hormones like auxin and salicylic acid in plants. Moreover, they also serve as the natural products of alkaloids and glucosinolates, which have a high potential to promote human health and nutrition. The biosynthetic pathways of aromatic amino acids share a chorismate, the common intermediate, which is originated from shikimate pathway. Then, tryptophan is synthesized via anthranilate and the other phenylalanine and tyrosine are synthesized via prephenate, as intermediates. This review reports recent studies about all the enzymatic steps involved in aromatic amino acid biosynthetic pathways and their gene regulation on transcriptional/post-transcriptional levels. Furthermore, results of metabolic engineering are introduced as efforts to improve the production of the aromatic amino acids-derived secondary metabolites in plants.

Keywords Aromatic amino acid, Metabolic engineering

서론

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방향족 아미노산인 트립토판(?-Tryptophan), 페닐알라닌(?-phenylalanine), 티로신(?-tyrosine)은 모든 생명체의 단백질 생합성에 필수성분이다. 방향족 아미노산의 합성은 shikimate 경로와 chorismate 경로를 통해 이루어지며, 이러한 대사경로들은 몇몇 원생생물, 박테리아, 곰팡이, 식물에서 존재하나 동물에는 존재하지 않는다(Galili and Hoefgen 2002). 인간과 단위가축(monogastric)에 방향족 아미노산은 필수 영양물질일 뿐 아니라, 트립토판과 티로신은 각각 신경전달물질인 세라토닌과 카테콜라민의 전구체로서 중요성을 지닌다. 뿐만 아니라 방향족 아미노산과 그 유도체들은 약리적, 생리적 활성효과를 지니므로, 다양한 의약품, 화장품, 식품, 염료, 농약 및 기타 특수소재 등에 직, 간접적으로 광범위하게 사용되고 있다(Leonard et al. 2009).

방향족 아미노산은 식물의 성장과 발달, 생식, 방어, 환경적 반응 등에서 결정적 역할을 하는 매우 다양한 식물 이차 대사물질들의 전구체이다(Fig. 1). 트립토판은 식물 호르몬인 옥신(auxin)과 다양한 이차 대사물질, 알칼로이드(alkaloids), 파이토알렉신(phytoalexins), 인돌 글루코시놀레이트(indole glucosinolates)의 전구체이다. 또한 티로신은 이소퀴놀린 알칼로이드(isoquinoline alkaloids), 베타라인(betalains) 색소, 퀴논(quinones)의 전구체이다. 페닐알라닌은 다양한 페놀릭 화합물의 전구물질로 사용되는데, 대표적으로 플라보노이드(flavonoids), 중합 탄닌(condensed tannins), 리그닌 화합물(lignans, lignins), 휘발성 페닐프로파노이드/벤제노이드(phenylpropanoid/benzenoid volatiles) 화합물의 전구체이다. 또한 방향족 아미노산의 전구물질인 chorismate는 비타민 K1과 B9 및 식물 방어물질로 알려진 살리실산(salicylic acid)의 전구물질로 이용된다(Maeda and Dudareva 2012).

Fig. 1.

Schematic diagram of the shikimate and aromatic amino acid biosynthetic pathway in plant. Secondary metabolites derived from chorismate, tryptophan (Trp), both phenylalanine (Phe) and tyrosine (Tyr) was shown in a light purple box, a light green box and a light orange box, respectively. ADCS, aminodeoxychorismate synthase; AS, anthranilate synthase; CM, chorismate mutase; ICS, isochorismate synthase


본 리뷰에서는 인류 건강증진, 의약, 농업 등 다양한 산업 분야에서 중요하게 고려되는 식물의 방향족 아미노산 생산과 현재까지 규명된 관련 효소들의 분자적 특성, 전사 및 전사 후 조절에 대한 정보를 제공하며 또한 식물체 내의 방향족 아미노산 생산을 높이기 위해 시도된 그 동안의 대사공학적 접근에 대해 되짚어 보며 앞으로 연구되어야 할 과제들을 제시하고자 한다.

Shikimate 생합성 경로

Shikimate 경로는 1차 대사와 방향족 아미노산 생합성을 연결하는 경로로서, 해당과정을 통해 생산된 phosphoenolpyruvate (PEP)와 5탄당 인산화 과정을 통해 생산된 erythrose 4-phosphate (E4P)를 이용하여 7단계의 효소반응을 통해 chorismate를 합성한다(Fig. 2). Shikimate 경로 관련 효소들은 생화학적 특성이 규명되어왔고, 각각의 해당 유전자들이 미생물과 식물에서 밝혀져 왔다. 대표적인 애기장대, 토마토, 벼에서의 shikimate 경로 관련 효소의 유전자는 Table 1에 나타내었다. 식물에서의 shikimate 경로 관련 효소들에 대한 다양한 실험적 결과와 세포 내 위치 예측 분석을 수행한 결과 대다수의 효소는 색소체(plastid)에 존재하는 것으로 판단된다(Emanuelsson et al. 1999).

Fig. 2.

Shikimate and aromatic amino acid biosynthetic pathway. Through seven enzymatic reactions of the shikimate pathway, chorismate was produced. Trp is produced from chorismate via six enzymatic reactions of the Trp pathway (light green box), whereas Phe and Tyr are produced via three reactions in the arogenate or phenylpyruvate/4-hydroxyphenylpyruvate routes (light orange box). Other abbreviations: CdRP, 1-(o-carboxyphenylamino)-1-deoxy-ribulose 5-phosphate; DAHP, 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate; EPSP, 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate; G3P, glyceraldehyde 3-phosphate; Gln, glutamine; Glu, glutamate; HPP, 4-hydroxyphenylpyruvate; IGP, Indole-3-glycerol phosphate; α-KG, α-ketoglutarate; PRPP, 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate; PRA, 5-phosphoribosylanthranilate; S3P, shikimate-3-phosphate; Ser, serine. Enzyme abbreviations: ADH, arogenate dehydrogenase; ADT, arogenate dehydratase; ASα, anthranilate synthase α subunit; ASβ, anthranilate synthase β subunit; CM, chorismate mutase; CS, chorismate synthase; DAHPS, 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase; DHD-SDH, 3-dehydroquinate dehydratase-shikimate dehydrogenase; DHQS, 3-dehydroquinate synthase; EPSPS, 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase; HPP-AT, 4-hydroxyphenylpyruvate aminotransferase; IGPS, indole-3-glycerol phosphate synthase; PAI, phosphoribosylanthranilate isomerase; PAT, phosphoribosylanthranilate transferase; PDH, prephenate dehydrogenase; PDT, prephenate dehydratase; PPA-AT, prephenate aminotransferase; PPY-AT, phenylpyruvate aminotransferase; SDH, shikimate dehydrogenase; SK, shikimate kinase; TSα, tryptophan synthase α subunit; TSβ, tryptophan synthase β subunit


Table 1 Enzyme and genes involved in shikimate and aromatic amino acid biosynthetic pathway in Arabidopsis, rice and tomato

EnzymeAbbreviationArabidopsis thalianaaSolanum lycopersicumbOryza sativac
Shikimate Pathway
3-Deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthaseDAHPSAt1g22410Sl04g074480Os03g27230
At4g33510Sl11g009080Os07g42960
At4g39980Sl01g105390Os08g37790
Sl01g105420Os10g41480
3-Dehydroquinate synthaseDHQSAt5g66120Sl02g083590Os09g36800
Sl03g058860
3-Dehydroquianate dehydratase/shikimate dehydrogenaseDHD/SDHAt3g06350Sl01g067750Os01g27750
Sl06g084460Os01g27780
Sl09g011730Os12g34870
Sl10g038080
Shikimate kinaseSKAt2g21940Sl02g094420Os01g01302
At2g35500Sl04g051860Os02g51410
At3g26900Sl07g044970Os04g54800
At4g39540Sl08g076410Os06g12150
Os10g42700
5-Enolpyruvylshkimate 3-phosphate synthaseEPSPSAt1g48860Sl01g091190Os06g04280
At2g45300Sl05g050980
Sl09g005460
Chorismate synthaseCSAt1g48850Sl04g009620Os03g14990
Sl04g049350
Aminodeoxychorismate synthaseADCSAt2g28880Sl04g049360Os06g48620
Isochorismate synthaseICSAt1g73805Sl06g071030Os09g19734
At1g74710
Tryptophan Pathway
Anthranilate synthaseASAt1g24807Sl06g005980Os03g15780
At1g24909Sl06g006100Os03g50880
At1g25083Sl12g010180Os03g61120
At1g25155Os04g38950
At1g25220Os06g48620
At2g28880
At2g29690
At3g55870
At5g05730
At5g57890
Phosphoribosylanthranilate transferasePATAt5g17990Sl04g025540Os01g40480
At1g70570Sl06g071550Os02g44490
Sl12g035190Os02g57090
Os03g03450
Os03g44890
Os04g39680
Os04g58720
Os04g59520
Os05g30750
Os05g35480
Os06g41090
Os07g07070
Os07g30020
Phosphoribosylanthranilate isomerasePAIAt1g07780Sl02g076760Os02g16630
At1g29410Sl06g051410
At5g05590
Indole-3-glycerol phosphate synthaseIGPSAt2g04400Sl03g111850Os04g39270
At5g48220Os08g23150
Os09g08130
Tryptophan synthase alpha subunitTSAt3g54640Sl01g098550Os03g58260
At4g02610Os03g58290
Os03g58300
Os03g58320
Os07g08430
Tryptophan synthase beta subunitTSAt4g27070Sl05g046350Os06g42560
At5g28237Sl10g018380Os08g04180
At5g38530Sl07g064280
At5g54810Sl10g005320
Sl10g006400
Sl10g018390
Sl12g096190
Phenylalaine/Tyrosine Pathway
Chorismate mutaseCMAt1g69370Sl02g088460Os01g55870
At3g29200Sl11g017240Os02g08410
At5g10870Os08g34290
Os12g38900
Prephenate aminotransferasePPA-ATAt1g77670Sl03g120450Os01g65090
At1g80360Sl04g054710
At2g22250Sl11g013170
Arogenate dehydratase /prephenate dehydrataseADT /PDTAt1g08250Sl02g080620Os03g17730
At1g11790Sl06g050630Os04g33390
At2g27820Sl06g074530Os07g32774
At3g07630Sl07g007590Os07g49390
At3g44720Sl09g011870Os09g39230
At5g22630Sl11g066890Os10g37980
Sl11g072520
Arogenate dehydrogenase/prephenate dehydrogenaseADH/PDHAt1g15710Sl06g050630Os06g35050
At5g34930Sl06g060930Os06g49505
Sl07g007590Os06g49520
Sl09g011870
Phenylpyruvate/4-hydroxyphenylpyruvate aminotransferasesPPY-AT/HPP-ATAt2g20610Sl07g053710Os02g20360
At2g24850Sl07g053720Os06g23684
At4g23590Sl10g007110Os11g42510
At4g23600Sl10g008200
At4g28410
At4g28420
At5g36160
At5g53970

adata available from TAIR (http://www.arabidopsis.org/)

bdata available from TIGR (http://rice.plantbiology.msu.edu/)

cdata available from PLAZA 3.0 (http://plaza.psb.ugent.be/)

3-Deoxy-D-arabino-Heptulosonate 7-Phosphate Synthase (DAHPS)

Shikimate 경로의 첫 번째 단계 효소인 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase (DAHPS)는 PEP와 E4P의 알돌(aldol) 축합을 통해 DAHP를 생성한다. DAHPS는 2가 금속양이온(Mn2+, Co2+)을 포함하는 금속효소(metalloenzyme)이다(Huisman and Kosuge 1974; Rubin and Jesen 1985). 중심부는 원통(barrel)형 β/α motif가 8개 존재하는(β/α)8 단량체(monomer) 구조이고, 주변부는 방향족 아미노산에 의한 다른자리 입체성(allosteric)에 의해 조절되며 다양한 변이를 나타내고 있다. DAHPS는 아미노산 상동성에 따라서 2개의 유형으로 나누어진다(Tzin and Galili 2010). 미생물유래의 type I DAHPS에는 대장균의 AroF, AroG, AroH와 N말단 페닐알라닌/티로신 결합부위를 지닌 효모(Saccharomyces cerevisiae)의 Aro3, Aro4, 바실러스(Bacillus subtilis)의 chorismate mutase (CM)?DAHPS 활성을 지닌 이중기능성 효소가 해당된다(Benfey and Chua 1989; Wu and Woodard 2006). 식물과 몇몇 미생물(예로, Mycobacterium tuberculosis)에서 보고되는 type II DAHPS는 중심부 원통형 구조와 방향족 아미노산에 의해 피드백 저해(feedback inhibition)를 받는 다른자리 입체성 부위를 지니고 있다(Webby et al. 2005).

식물에서 보고되는 type II DAHPS는 비록 대장균과 효모와는 상동성이 매우 적으나, 이들 미생물의 DAHPS 돌연변이체를 이용한 상보성 검정(complementation test)을 수행하여 몇몇 식물 종에서 동형(isotype) DAHPS들이 분리되었다(Dyer et al. 1990; Keith et al. 1991). 애기장대의 경우에는 3개의 유전자가 DAHPS를 암호화하고 있는 것으로 밝혀져 있으나 몇몇 식물 종에서는 2개 또는 많게는 8개까지의 유전자가 암호화하고 있는 것으로 확인된다. 애기장대의 DAHPS1 유전자는 상처나 병원균 감염 1시간 이내에 강하게 발현이 유도되었고, 더불어 페닐프로파노이드 경로의 첫 번째 효소인 PAL 유전자의 발현도 증가하였다(Gorlach et al. 1995). 이러한 DAHPS와 PAL 유전자의 초기 발현증가는 상처나 병원균 감염과 관련한 방어물질 생산에 이들 유전자가 기능함을 시사한다. 반면, 애기장대 DAHPS2 유전자 발현은 변화되지 않았는데, 이것은 물질대사를 조절하는데 있어 두 유전자간 차이가 있으며 DAHPS1이 이차 대사물질 생합성의 변화에 대한 주요 효소를 암호화함을 시사한다.

3-Dehydroquinate Synthase (DHQS)

Shikimate 경로의 두 번째 효소인 3-dehydroquinate synthase (DHQS)는 Co2+와 같은 2가 양이온과 NAD+를 보조인자 (co-factor)로 사용하여 DAHP를 3-dehydroquinate로 변환시킨다. 곰팡이의 경우에는 AroM 복합체로 알려진 5중 기능성 효소가 DAHP를 5-enol pyruvylshikimate 3-phosphate (EPSP)로 변환시키는 5단계의 연속반응을 수행한다고 알려져 있는 반면, 대장균과 식물에서의 DHQS는 단일기능성 효소이다(Duncan et al. 1987; Bischoff et al. 1996). 대부분의 식물 종에서 DHQS 유전자는 1 copy로 존재하나, 콩의 경우 게놈 내에 2 copy로 존재한다(Tohge et al. 2013). 애기장대 AtDHQS 유전자는 1차 줄기 발달 과정에서 발현이 증가되는데, 이는 리그닌 생합성에 요구되는 페닐알라닌 생합성에 AtDHQS가 관여함을 말해준다(Ehlting et al. 2005). 애기장대의 경우, 대부분의 shikimate 생합성 유전자들의 발현은 페닐프로파노이드 물질 생산과 상관관계를 보였으나, DHQS 유전자의 발현은 그러한 경향을 보이지 않았다(Hamberger et al. 2006).

3-Dehydroquinate Dehydratase (DHD)?Shikimate Dehydrogenase (SDH)

3-Dehydroquinate dehydratase (DHD)와 shikimate:NADP+ oxidoreductase로도 불리는 shikimate dehydrogenase (SDH)는 shikimate 경로의 세 번째와 네 번째 효소반응을 촉매하여 shikimate를 생산한다. DHD는 3-dehydroquinate의 탈수화(dehydration)를 통해 3-dehydroshikimate를 생산하고, SDH는 NADPH를 보조인자로 사용하여 3-dehydroshikimate를 shikimate로 역 환원시킨다. 이들 효소의 구성은 생물계에 따라서 뚜렷한 차이를 나타낸다. 곰팡이에서 이들 효소는 AroM 복합체의 일부로 구성되고, 대장균의 AroD, AroE는 각각 단일기능성 효소이며, 식물의 경우에는 DHD-SDH 형태로 융합된 이중기능성 효소이다(Duncan et al. 1987; Anton and Coggins 1988; Bischoff et al. 2001). 식물에서 SDH 효소활성도는 DHD 효소활성보다 10배 이상 높게 나타나고 있으며, 생산된 3-dehydroshikimate를 효과적으로 shikimate로 변환시킨다(Fiedler and Schultz 1985). 이러한 이중기능성 효소들은 페놀릭 이차 대사경로의 물질 생산에 중요한 역할을 하리라 판단된다.

애기장대를 포함한 여러 식물 종에서 DHD-SDH는 단일 유전자로 존재하고 색소체 적중서열을 지니는 것으로 판단되어왔다(Bischoff et al. 2001; Singh and Christendat 2006). 애기장대 AtDHD-SDH 유전자는 자성 배우체 발달 및 기능에 요구되는 것으로 보여졌는데, 이는 shikimate 경로가 식물의 생식에도 관여함을 의미한다(Pagnussat et al. 2005). 예외적으로, 담배에서는 게놈 내에 색소체와 세포질의 DHD-SDH를 암호화하는 두 개의 유전자들이 보고되었다(Ding et al. 2007). 담배에서 색소체 NtDHD-SDH1 유전자의 RNAi 발현억제시 강한 생장억제와 더불어서 방향족 아미노산, 리그닌, chlorogenic acid의 생산이 감소되었고, 효소의 기질과 산물인 3-dehydroquinate와 shikimate가 축적되었다(Ding et al. 2007). 이것은 세포질 DHD-SDH 유전자인 NtDHD-SDH2의 효소 활성에 의해 dehydroquinate가 세포질에서 shikimate로 전환된 결과일 수 있지만, 아직까지 정확한 세포질 DHD-SDH의 역할이 밝혀지지 않고 있다.

Shikimate Kinase (SK)

Shikimate kinase (SK)는 ATP를 보조인자로 사용해서 shikimate를 인산화시켜 shikimate 3-phosphate를 생성시킨다. 대장균의 경우에는 2개의 SK 유전자가 존재하는데 식물에서는 종에 따라 그 수가 다양하다. 애기장대는 4개, 토마토는 4개, 벼(Oryza sativa)는 5개의 SK 유전자를 지닌다(Schmid et al. 1992; Kasai et al. 2005; Fucile et al. 2011). 애기장대의 AtSK1 발현은 고온 스트레스에 의해 10배 이상 증가하였고 효소 활성이 안정적인 반면, AtSK2의 발현은 변화되지 않았으며 열에 불안정한 활성을 나타냈다(Fucile et al. 2011). 식물이 고온 스트레스를 받을 경우 손상된 단백질을 대체하기 위해서 heat shock proteins (HSPs) 합성을 증가시키며, 산화적 손상으로부터 세포 보호를 위해 안토시아닌과 같은 페닐프로파노이드 물질 생산을 증가시킨다. 고온에 안정적인 AtSK1 유전자는 HSPs 합성에 필요한 방향족 아미노산 및 안토시아닌 생성을 위해 shikimate 경로의 metabolic flux를 증가시키는데 관여하는 것으로 보인다. 시금치(Spinacia oleracea)의 SK 단백질 실험에서는 ATP를 사용하는 다른 효소들과 마찬가지로, ATP, ADP, AMP의 상대적 농도에 따른 energy charge의 상태에 의해 활성이 조절된다고 보고되었다(Huang et al. 1975). 이것은 식물에서 SK가 shikimate 경로에서 요구되는 에너지와 세포 내의 에너지를 균형적으로 조절하는 데 중요한 역할을 하고 있음을 암시한다.

5-Enolpyruvylshikimate 3-Phosphate Synthase (EPSPS)

5-Enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase (EPSPS)는 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltranferase라고도 지칭되는 효소로 PEP의 enolpyruvyl unit을 shikimate 3-phosphate의 5-hydroxyl position으로 이동시킴으로써 EPSP의 생성을 촉매한다. EPSPS는 광범위하게 사용되는 제초제인 글리포세이트(glyphosate)의 목표 단백질로 알려져 있고, 글리포세이트에 대한 감응도에 따라 두 그룹으로 분류되어 왔다. 대장균을 포함한 대부분의 박테리아와 식물은 글리포세이트에 민감한 class I EPSPS를 지니는 반면에, 아그로박테리아(Agrobacterium sp. strain CP4)와 같은 몇몇 박테리아는 class II EPSPS를 지니며 이들은 글리포세이트에 저항성을 나타내므로 글리포세이트 저항성 작물 개발에 이용되어 왔다(Funke et al. 2006).

지금까지 애기장대, 사과, 포도 및 옥수수 등의 게놈 내에서 각각 2개의 EPSPS 유전자들이 보고되어왔다(Klee et al. 1987; Gasser et al. 1988; Forlani et al. 1994). 모든 식물 종의 EPSPS에는 LP(G/S)KSLSNRILLLAAL와 LFLGNAGTAMRPL 모티프가 보존되어 있다. 보존 아미노산 잔기는 EPSPS 효소의 촉매 기능과 글리포세이트와의 결합에 관여한다(Huynb et al. 1998). Shikimate 생합성 경로의 유전자들의 발현과 유사하게, 병원균 또는 유도인자에 의해서 EPSPS 유전자의 발현이 상향 조절되며, 일반적으로 EPSPS 유전자는 낮은 수준에서 상시 발현하지만, 페튜니아는 페닐알라닌 유래의 휘발성 물질이 생산되는 꽃잎 조직에서 발달단계별 조직특이적으로 발현되기도 한다(Gasser et al. 1988; Garg et al. 2014). 한편 EPSPS 유전자를 과발현시킨 작물의 경우에는 트립토판, 광합성률, 종자발아율 등과 같은 작물 적응력이 증가하였다(Wang et al. 2014).

Chorismate Synthase (CS)

Chorismate synthase (CS)는 EPSP의 3-phosphate와 C6-pro-R hydrogen을 제거하여 ring 구조에 두 번째 이중결합을 형성시킴으로써 chorismate를 생성하는 shikimate 경로의 마지막 반응을 촉매한다. 이 반응은 보조인자로 환원 플라빈 모노뉴클레오타이드(reduced Flavin mononucleotides, FMN)를 필요로 한다(Macheroux et al. 1999). 서로 다른 생물계의 CS들이 매우 높은 상동성과 단백질 구조의 유사성, 비슷한 보조인자 결합 특이성과 효소활성적 특성을 나타내지만, 산화된 FMN을 환원시키는 능력에 따라 두 그룹으로 구분되어 왔다(Schaller et al. 1991b; Maclean and Ali 2003; Quevillon-Cheruel et al. 2004). 곰팡이의 CS들은 이중기능성 효소의 일부로써 NADPH-dependent flavin reductase와 결합되어 기능을 지니는 반면, 대부분의 박테리아와 식물은 외부에서 공급되는 환원 플라빈 모노뉴클레오타이드에 의존하는 단일기능성 효소를 지닌다(Mousdale and Coggins 1986; Schaller et al. 1991a;1991b). 지금까지 CS를 암호화하는 유전자는 애기장대는 1개, 토마토는 2개를 지니는 것으로 밝혀져 왔다(Mousdale and Coggins 1986; Gorlach et al. 1993). 보리의 HvCS 유전자를 침입저항성에 감수성인 야생형 Mlo(Mildew resistance locus o) 개체에 과발현시켰을 때, 병원균에 대한 저항성이 크게 증가했다(Pingsha et al. 2009). 이것은 CS 유전자가 병원균의 침입 과정에서 생성되는 방어물질 생산에 관여하며 식물의 병에 대한 저항성을 부여함을 말해준다. 토마토의 경우, 1차 전사체의 선택적 스플라이싱에 의해 두 가지 LeCS1과 LeCS2 유전자를 가지며 조직별 발현 비율도 다르게 나타났다. 이것은 특정 환경인자 혹은 유도인자에 대한 두 유전자들의 발현양상이 차이를 보이며 조절 메커니즘도 다를 것이라 추측하게 한다(Gorlach et al. 1995).

CS 유전자에 의해서 합성된 chorismate는 shikimate 경로의 최종산물이자, 방향족 아미노산 합성을 위한 전구체이며, chorismate 유래의 대사산물을 제공하는 물질로도 사용된다. 생성된 chorismate를 기질로 하여 방향족 아미노산 및 chorismate 유래 대사물질들의 최초반응에 해당하는 효소들이 경쟁하게 된다. 비타민 B9으로 불리는 엽산(tetrahydrofolate)은 aminodeoxychorismate synthase (ADCS) 효소반응을 통해 생성되고, 식물호르몬인 살리실산 합성 및 비타민 K1으로 불리는 phylloquinone의 생합성은 isochorismate synthase (ICS) 효소반응으로 생성되며, 방향족 아미노산인 트립토판은 anthranilate synthase (AS) 효소반응을 거쳐 생성되고, 페닐알라닌과 티로신은 chorismate mutase (CM) 효소반응을 통해 생성된다(Wildermuth et al. 2001; Basset et al. 2004; Gross et al. 2006; Kim et al. 2008; Waller et al. 2010).

방향족 아미노산 생합성 경로

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트립토판 생합성 경로

방향족 아미노산인 트립토판은 chorismate를 기질로 하여 여섯 단계의 효소반응을 통해 생성된다. 트립토판 대사경로에 관여하는 모든 생합성 효소들은 색소체에 위치하거나 또는 위치하는 것으로 예측 된다(Zhao and Last 1995; Kriechbaumer et al. 2008). 미생물에서 종종 발견되는 트립토판 생합성 대사경로의 다중기능성 효소들과 달리 식물 효소들은 모두 단일기능성 효소들로 밝혀졌다(Radwanski and Last 1995a).

Anthranilate Synthase (AS)

트립토판 생합성의 첫 번째 단계인 anthranilate 생성을 촉매하는 효소는 anthranilate synthase (AS)이다. AS는 두 개의 알파 서브유닛(ASα)과 두 개의 베타 서브유닛(ASβ)으로 구성되며 α2/β2 사량체(tetramer)를 형성한다(Romero et al. 1995a). ASα는 chorismate에 결합하여 아미노화(amination) 반응과 pyruvate 제거반응을 촉매하는 활성을 지니고, ASβ는 glutamine을 가수분해하여 ASα에 암모니아(ammonia)를 제공하는 활성을 지닌다. 대부분의 고등식물은 두 개의 ASα 유전자와 하나의 ASβ 유전자를 지니는 것으로 알려져 있다. 2개의 ASα 유전자중 하나는 상시 발현하는 반면, 나머지 하나는 발생, 상처 처리, 병원균 처리에 의해 발현 유도된다(Niyogi and Fink 1992; Tozawa et al. 2001). 이러한 유전자 발현 양상은 트립토판 유래 천연물질의 생산이 식물 방어 기작에 관여한다는 것을 시사한다. 대부분의 식물 AS 효소는 ASα에 트립토판이 결합해 피드백 저해를 받는 것으로 알려지고 있다(Morollo and Eck 2001). 일반적으로 다양한 식물 종에서 피드백 비민감성(feedback insensitive) AS를 암호화하는 유전자를 과다발현시킬 경우 트립토판과 이차 대사산물의 생산이 증가한다(Li and Last 1996; Tozawa et al. 2001; Hughes et al. 2004).

애기장대의 ASβ 서브유닛의 유전자가 손상된 trp4 돌연변이체는 anthranilate의 생산이 억제된다. Anthranilate는 UV 광조건에서 강한 청색형광(blue fluorescence)을 나타내며 이러한 특성은 애기장대 식물체에서 트립토판 관련 돌연변이체를 확인하기 위한 표현형 마커로 사용되고 있다(Rose et al. 1992; Radwanski and Last 1995a; Radwanski et al. 1995b).

Phosphoribosylanthranilate Transferase (PAT)

트립토판 생합성의 두 번째 효소인 phosphoribosylanthranilate transferase (PAT)는 phosphoribosylpyrophosphate의 phosphoribosyl 그룹을 anthranilate로 전달하여 5-phosphoribosylanthranilate를 생성시킨다. PAT 유전자는 애기장대에서 상시 발현하며, 처음 두 개의 인트론(intron)이 전사 후 mRNA 양을 증가시키는 것으로 나타났다(Rose and Last 1997a). 애기장대의 PAT1 유전자의 돌연변이체인 trp1는 anthranilate glucosides 축적에 따른 청색형광이 나타날 뿐만 아니라 크기 및 정단우세현상(apical dominance)이 줄어드는 옥신(auxin) 결핍 표현형을 나타낸다(Rose et al. 1997b). trp1의 옥신 결핍 표현형은 트립토판을 첨가하여도 회복되지 않는데, 이러한 결과는 트립토판 생합성경로와는 독립적인 옥신 생합성경로가 있음을 시사한다.

Phosphoribosylanthranilate Isomerase (PAI)

Phosphoribosylanthranilate isomerase (PAI)는 5-phosphoribosylanthranilate에서 1-(o-carboxy-phenylamino)-1-deoxy-ribulose 5-phosphate (CdRP)로의 변환 반응을 촉매한다. 애기장대 Columbia 생태형은 3개의 PAI 유전자들을 지니고 있으며 이들 유전자의 발현 양상은 다양하다. 정상 생육 조건의 애기장대에서 PAI1과 PAI3는 PAI2보다 10배 높은 발현을 보일 뿐 아니라, 유전자의 발현은 UV광 조사, 질산염처리와 같은 환경 스트레스에 의해 조직 및 세포에 따라서 다르게 발현된다(Li et al. 1995b; He and Li 2001). 애기장대의 PAI1 유전자가 삭제(deletion)될 경우 비정상적인 성장이 관찰된다. 이것은 PAI1 유전자가 트립토판 생합성에 핵심적 역할을 수행함을 나타낸다. 한편 애기장대 Wassilewskija 생태형은 4개의 PAI 유전자들을 지니며 그 중 PAI1과 PAI4는 염색체상에 inverted repeats의 형태로 나란히 위치한다. 이러한 유전자 배열은 small RNA를 매개로 한 메틸화(methylation)를 촉발시키고 그에 따라 PAI2 유전자의 발현이 메틸화에 의해 억제된다(Bartee and Bender 2001; Melquist and Bender 2003). 기존의 트립토판 돌연변이체들과 마찬가지로, PAI 유전자 역방향 발현 식물체는 청색형광 표현형을 나타냈다. 각각의 PAI 유전자들의 트립토판 유래 인돌(indole) 화합물 생성에 미치는 기능은 추후에 밝혀져야 할 부분이다.

Indole-3-Glycerol Phosphate Synthase (IGPS)

Indole-3-glycerol phosphate synthase (IGPS)는 CdRP의 indole-3-glycerol phosphate (IGP)로의 변환 반응을 촉매한다. IGPS는 indole ring을 만드는 유일한 효소로서, 트립토판과 옥신 생합성에서 중요한 반응 단계의 효소이다. 애기장대에서는 2개의 IGPS 유전자를 지니고 있으며 그 중 애기장대의 IGPS1 유전자를 발현억제 시키면 트립토판과 옥신이 모두 감소하는 반면, tryptophan synthase (TS)가 돌연변이 되었을 경우에는 트립토판은 감소되고 트립토판 유래 옥신의 합성은 증가되었다(Ouyang et al. 2000). 이러한 결과는 IGP가 트립토판과 트핍토판 비유래 옥신 합성의 핵심 분기점임을 시사한다. 한편 곰팡이와 박테리아에서는 IGPS가 하나 또는 두 개의 다른 트립토판 생합성 효소들과 융합된 형태로 존재하는 반면, 식물에서는 일반적으로 단일기능성 효소로서 존재한다(Li et al. 1995a; 1995b). 애기장대의 IGPS 유전자는 자스몬산(jasmonic acid), 살리실산과 같은 호르몬뿐 아니라 다양한 방어기전에 의해 발현이 조절된다(Job et al. 2005; Sasaki-Sekimoto et al. 2005; Chibani et al. 2006; Rajjou et al. 2006; Dombrecht et al. 2007).

Tryptophan Synthase (TS)

트립토판 생합성 경로의 마지막 두 단계 반응은 tryptophan synthase 알파 서브유닛(TSα)과 베타 서브유닛(TSβ)에 의해 일어난다. TSα에 의해 IGP는 인돌(indole)과 glyceraldehyde 3-phosphate (G3P)로 분리되고, TSβ는 인돌과 serine을 결합시킴으로써 트립토판을 생성한다(Barends et al. 2008). 애기장대의 기능적으로 검증된 TSα1 외에도 65%의 아미노산 상동성을 나타내는 TSα homolog (At4g02610)는 특성 분석되어 indole synthase로 명명 되었다. 애기장대의 기능적 TSβ 유전자는 TSβ1과 TSβ2로 2개이며 그 외에 추정상의 유전자가 2개 더 알려져 있다. 트립토판 생합성에서 TSα1과 TSβ1의 필수적 역할은 trp3와 trp2 돌연변이 각각의 트립토판 영양요구성(Trp auxotrophic) 표현형을 바탕으로 유전적으로 증명되었으며, 이들 유전자는 α2β2 이형복합체(heterocomplex)를 형성함이 제시되었다(Radwanski et al. 1995b; Radwanski et al. 1996). 애기장대의 TSα1 유전자는 대장균 돌연변이를 이용한 상보성 검정을 실시한 결과 단량체로 기능함이 제시되었다(Bohlmann et al. 1995; Radwanski and Last 1995a; Radwanski et al. 1995b). 그러나 단량체 또는 이형복합체로서의 TS 효소 기능에 대해서는 추가적 연구가 필요하다.

페닐알라닌 및 티로신 생합성

방향족 아미노산인 페닐알라닌과 티로신은 shikimate 경로의 최종산물인 chorismate로부터 합성된다. Chorismate는 chorismate mutase (CM)에 의해 prephenate로 변환되고, 이를 기질로 하여 2가지 대사경로로 페닐알라닌과 티로신이 생성된다. 하나는 arogenate 경로로서, prephenate를 ?-arogenate로 변환한 후, arogenate dehydratase (ADT) 또는 arogenate dehydrogenase (ADH)에 의해 각각 탈수화(dehydration)/탈카르복실화(decarboxylation)을 거쳐 페닐알라닌을 생성하거나, 탈수소화(dehydrogenation)/탈카르복실화를 거쳐 티로신을 생성한다. 또 다른 경로는 phenylpyruvate와 4-hydroxyphenylpyruvate 경로로서, 각각 페닐알라닌과 티로신을 생성한다. Phenylpyruvate 경로에서는 prephenate가 prephenate dehydratase (PDT)에 의해 탈수화/탈카르복실화 되어 phenylpyruvate로 변환된 후, transamination 되어 페닐알라닌이 생성된다. 4-hydroxyphenylpyruvate 경로에서는 prephenate가 prephenate dehydrogenase (PDH)에 의해 탈수소화/탈카르복실화되어 4-hydroxyphenylpyruvate로 변환된 후, transamination 되어 티로신이 생성된다.

대부분의 미생물들은 페닐알라닌과 티로신 합성을 위해서 주로 phenylpyruvate 경로를 이용한다(Zamir et al. 1985). 식물의 페닐알라닌 합성의 경우에는 미생물과는 달리 arogenate 경로가 주요 경로임이 밝혀졌으며, 티로신 합성의 주요경로는 앞으로 규명되어야 할 것이다(Maeda et al. 2010). 식물에서의 방향족 아미노산인 페닐알라닌과 티로신의 생합성 경로가 정확하게 밝혀진다면 식물의 탄소흐름의 분할과 그 조절에 대해 이해할 수 있을 것이다.

Chorismate Mutase (CM)

Chorismate mutase (CM)는 페닐알라닌과 티로신 생합성의 첫 번째 반응인 chorismate의 prephenate로의 전환을 촉매한다. CM은 방향족 아미노산을 생산하는 여러 생물체에서 기능적, 구조적으로 다양한 형태로 존재한다. 자연계에서 CM은 일반적인 단일기능성 효소 이외에도 B. subtilis의 CM-DAHPS 또는 대장균에서 발견된 CM-PDT, CM-PDH와 같은 상당수의 이중기능성 효소들로서 존재한다(Romero et al. 1995b). 단백질 구조를 바탕으로 CM 효소들은 α-helical 구조를 지닌 AroQ 타입과 α/β-원통형구조를 지닌 AroH 타입으로 분류 되어왔다(Chook et al. 1993; Lee et al. 1995). 대부분의 박테리아와 곰팡이, 식물의 CM 효소들은 AroQ 타입의 구조를 지니고 있다.

애기장대에서는 3개의 CM 유전자가 밝혀졌다. 이들은 대장균과, 효모의 CM-결핍 균주들에 대한 상보성 검정을 통해 CM 활성이 규명되었다(Eberhard et al. 1996). 이들 유전자들은 다양한 조직 내에서 서로 다른 양상으로 발현한다. CM1과 CM3 유전자의 발현은 다양한 유도인자(elicitor)와 병원균 처리에 의해서 유도된다(Mobley et al. 1999; Ehlting et al. 2005). 색소체 적중서열을 지닌 CM1과 CM3는 페닐알라닌과 티로신에 의해 활성이 억제되며 트립토판에 의해 활성화된다(Gilchrist et al. 1972; Kuroki and Conn 1989; Benesova and Bode 1992; Mobley et al. 1999). 최근 페튜니아 CM1 유전자 RNAi를 이용한 발현억제 연구를 통해 꽃잎의 페닐알라닌 유래 휘발성 물질인 페닐프로파노이드/벤제노이드(benzenoids) 생성에 CM1이 관여한다는 것이 확인되었다(Colquhoun et al. 2010a).

한편 색소체 적중서열을 지니지 않은 CM2의 경우, 담배의 CM2는 세포질에 위치하나 아직 CM 효소활성도는 검증되지 않았으며 애기장대 AtCM2는 CM 효소활성도는 검증되었으나 아직 그 생리적 중요성은 파악되지 않고 있다(d’Amato et al. 1984; Eberhard et al. 1996; Rippert et al. 2009). 또한 토마토의 오직 하나뿐인 CM 효소는 세포질에 위치하는 것으로 보인다. 한편 이들 세포질의 CM들은 방향족 아미노산에 의한 다른자리 입체성 조절을 받지 않는다(Eberhard et al. 1996).

최근 식물 종양을 유발하는 병원성 곰팡이인 Ustilago maydis를 포함하는 여러 미생물에서 chorismate mutase인 Cmu1을 분비한다는 연구결과가 보고되었다(Djamei et al. 2011).병원균이 식물 세포 내로 침투하여 Cmu1를 분비하여 식물 방어 기작에 관여하는 살리실산 생합성의 전구체인 chorismate를 prephenate로 급격히 변환시킴으로써 살리실산 생합성을 감소시켜 식물체내로의 침투를 용이하게 하는 것으로 보여진다.

Prephenate Aminotransferase (PPA-AT)

페닐알라닌과 티로신 생합성에서 arogenate 경로의 시작 단계 효소인 prephenate aminotransferase (PPA-AT)는 transamination 반응을 통해 prephenate로부터 arogenate를 생성한다. PPA-AT 효소활성은 그 동안 수행되어온 광범위한 생화학적 특성분석에 의해 많은 식물종 뿐 아니라 몇몇 박테리아에서도 검출되어왔다(Stenmark et al. 1974; Bonner and Jensen 1985; Maeda et al. 2011). 애기장대와 페튜니아, 토마토에서의 PPA-AT 유전자 규명을 통해 PPA-AT 효소들이 glutamate, aspartate, prephenate와 같은 dicarboxylic acid 기질들의 인식에 중요한 부위인 109번째 lysine을 지니는 class Ib aspartate aminotransferases (AT)에 속한다는 것이 밝혀졌으며 또한 식물 PPA-AT는 arogenate보다 prephenate에 대해 약 10배 높은 기질 친화도를 보임을 확인하였다(Nobe et al. 1998). 이것은 PPA-AT 효소들은 정반응을 촉매하여 prephenate로부터 arogenate로의 탄소흐름을 주도한다는 것을 나타낸다(Maeda et al. 2011; Dornfeld et al. 2014). 광범위한 기질 특이성을 보이는 대부분의 AT들과 마찬가지로, 종종 식물 PPA-AT 효소들은 aspartate AT 효소활성도 역시 나타낸다. 그러나, 페튜니아 꽃잎에서의 PPA-AT 유전자 RNAi 발현억제 시 aspartate AT 활성에는 영향을 미치지 않고 오직 PPA-AT 활성만 크게 감소하였다(Maeda et al. 2011). 이것은 PPA-AT 유전자의 단백질은 prephenate의 arogenate로의 변환이 주요 역할이며 식물의 전체 aspartate AT 활성에는 기여하는 바가 미미하다는 것을 나타낸다.

Prephenate and Arogenate Dehydratases (PDT and ADT)

Prephenate dehydratase (PDT)는 페닐알라닌 생합성경로에서 phenylpyruvate 경로의 첫 번째 단계인 탈카르복실화와 탈가수화반응으로 prephenate의 phenylpyruvate로의 전환을 촉매한다. 반면 ADT는 arogenate 경로의 마지막 단계인 arogenate의 페닐알라닌으로의 전환을 촉매한다. PDT와 ADT 단백질들은 촉매도메인(catalytic domain)과 페닐알라닌에 의한 다른자리 입체성 조절에 관여하는 C말단의 ACT (aspartokinase, chorismate mutase, TyrA) 조절도메인(regulatory domain)으로 구성된다. 곰팡이와 대부분의 박테리아들은 단일기능성의 PDT 또는 ADT 효소들을 지니는 반면, 대장균 같은 몇몇 진정세균들은 N말단에 CM과 융합된 이중기능성 CM-PDT (PheA) 효소를 지닌다(Kleeb et al. 2006).

식물 ADT 효소를 암호화하는 유전자는 박테리아 PDT들과의 상동성 검색을 통해, 애기장대에서는 6개, 벼에서는 6개, 페튜니아에서는 3개가 확인되었다. 이들 효소는 세포 내 위치조사에 의해 색소체에 위치하는 것으로 추정되었고, 기질로 prephenate가 아닌 arogenate를 선호하는 기질특이성을 나타냈다(Cho et al. 2007; Yamada et al. 2008; Maeda et al. 2010). 벼의 5-methyl-Trp 저항성 돌연변이인 Mtr1 에서는 페닐알라닌과 트립토판, 그 외에 여러 페닐프로파노이드 물질들이 축적되었다. 이것은 벼의 ADT (또는 PDT) 활성을 지니는 유전자의 점돌연변이(point mutation)에 의해 페닐알라닌에 의한 피드백 저해가 일어나지 않기 때문인 것으로 보인다(Yamada et al. 2008). 한편 페튜니아에서 ADT 유전자의 RNAi 발현억제 시 페닐알라닌의 합성이 약 80% 감소하였다. 이러한 결과는 페튜니아에서의 페닐알라닌의 합성은 주로 arogenate 경로를 통해 생성된다는 것을 나타낸다. 페튜니아 꽃에서 arogenate 경로의 PPA-AT와 ADT 효소활성도를 비교 분석한 결과 PPA-AT 효소활성도가 3배 이상 높다는 것이 관찰되었다(Maeda et al. 2010; 2011). 이는 arogenate 경로를 통한 페닐알라닌 합성 시에 PPA-AT 보다는 ADT가 반응률 제한 단계(rate-limiting step)의 효소임을 나타낸다.

ADT 효소활성도는 다양한 식물 조직과 종에서 검출되어온 반면 PDT 활성은 백화된 애기장대의 어린 식물체에서만 나타났다. 그러나 애기장대의 6개 ADT 중 3개(ADT1, ADT2, ADT6)의 효소는 ADT 활성 뿐만 아니라 prephenate를 기질로 하여 phenylpyruvate를 생성하는 PDT 활성도 역시 지니는 것으로 확인되었다(Cho et al. 2007). 또한 최근에 페튜니아의 꽃잎에 shikimate를 처리하여 shikimate 경로로의 탄소 흐름을 증가시킬 경우 phenylpyruvate가 검출되며, 또한 ADT-RNAi 발현억제 형질전환 꽃잎에서 줄어들었던 페닐알라닌 함량이 shikimate 처리에 의해 복구됨이 확인되었다(Meada et al. 2010). 이와 더불어 많은 식물체에서 phenylpyruvate가 검출되고 이를 기질로 한 이차 대사산물인 phenylacetaldehyde, 2-phenylethanol 등이 검출된다는 사실은 비록 arogenate 경로가 식물 페닐알라닌 생합성의 주요 경로이지만 PDT 효소활성을 통한 phenylpyruvate 경로 또한 식물 페닐알라닌 생합성에 기여할 수 있음을 시사한다(Watanabe et al. 2002; Kaminaga et al. 2006).

In situ 현미경 분석의 결과는 애기장대의 모든 ADT 효소들이 색소체에 위치함을 보여준다(Rippert et al. 2009). 애기장대의 ADT3의 경우 heterotrimeric G-protein 복합체의 구성 단백질로서 plasma membrane에 존재하는 것으로 관찰되었다(Warpeha et al. 2006). 이와 같이 ADT는 특정 성장 단계나 생리적 조건에서 다른 단백질과의 복합체로써 관여할 수도 있음을 알 수 있다.

현재까지의 연구결과를 취합해 보면 식물은 주로 arogenate 경로를 통해서 페닐알라닌을 합성하게 되는데, 이러한 결과는 PPA-AT 효소활성에 기인한 것으로 생각된다. Arogenate 뿐만 아니라 prephenate 역시 기질로 사용할 수 있는 ADT 효소들은 prephenate 기질에 대해 PPA-AT 효소와 경쟁한다. 두 효소들 모두 prephenate에 대해 비슷한 Km값을 보이지만 PPA-AT들의 촉매효율이 ADT들 보다 50-250배 가량 높다(Cho et al. 2007; Yamada et al. 2008; Maeda et al. 2010). 이러한 PPA-AT의 높은 촉매 효율이 탄소 흐름을 prephenate로부터 arogenate 경로로 대사 흐름을 진행시키는 것으로 볼 수 있다.

Arogenate and Prephenate Dehydrogenases (ADH and PDH)

ADH와 PDH는 arogenate와 prephenate의 산화적 탈카르복실화를 촉매하여 각각 티로신과 4-hydroxyphenylpyruvate를 생성한다. ADH와 PDH들은 사량체로써 활성을 나타내며 각각의 단량체들은 N말단 핵산결합부위와 C말단 기질결합부위를 지닌다(Legrand et al. 2006). 페닐알라닌 결합조절부위를 지닌 PDT, ADT들과는 달리 PDH와 ADH들은 독립적인 티로신 결합부위가 없고, 생성된 티로신에 의해 경쟁적으로 arogenate 기질에 대한 효소활성 저해를 받는다(Connelly and Conn 1986; Rippert and Matringe 2002; Legrand et al. 2006).

담배, 옥수수, 수수, 애기장대에서 arogenate를 티로신으로 변환시키는 ADH 활성이 검출되어 왔다. 반면 PDH 활성은 오직 콩류에서만 검출되어왔다(Rubin and Jensen 1979). 식물의 ADH 유전자들은 애기장대에서 2개와 옥수수에서 4개가 존재하는 것으로 밝혀졌으며, 애기장대 ADH는 모두 색소체에 위치한다(Rippert and Matringe 2002; Holding et al. 2010). 애기장대 효소들의 생화학적 특성분석 결과, ADH1이 arogenate에 대한 엄격한 기질 특이성을 보이는 반면 ADH2는 arogenate 뿐만 아니라 prephenate 또한 기질로 취할 수 있으나 arogenate에 비해 1000배 가량 낮은 촉매효율을 보였다(Rippert and Matringe 2002). 따라서 실제 PDH 활성에 의해 4-hydroxyphenylpyruvate를 경유하는 식물 티로신 생합성의 alternative 경로의 존재 여부는 추가적 연구를 통해 밝혀져야 할 것이다.

ADH 효소의 식물체에서의 생체내 기능은 아직 명확하지 않으나, transposon 삽입을 통한 옥수수 ADH1 유전자 손상시 불투명 내배유의 표현형과 종자의 저장 단백질(zein) 감소가 나타나며 또한 자유 티로신 함량이 약간 감소되었는데, 이는 중복된 ADH 유전자들이 티로신 생합성에 영향을 미치거나 또 다른 티로신 생합성 경로가 존재하기 때문인 것으로 추측된다(Holding et al. 2010).

Phenylpyruvate and 4-Hydroxyphenylpyruvate Aminotransferases (PPY-AT and HPP-AT)

Phenylpyruvate aminotransferase (PPY-AT)는 phenylpyruvate의 transamination을 촉매하여 페닐알라닌을 생성한다. 이와 비슷한 방식으로, 4-hydroxyphenylpyruvate aminotransferase (HPP-AT)는 4-hydroxyphenylpyruvate을 티로신으로 변환시킨다. 애기장대에는 예측되는 8개의 티로신 aminotransferase 유전자들이 존재하며(Arabidopsis Genome Initiat 2000), 이 중 두 개의 효소들은 생화학적 특성분석이 되어왔다(Lopukhina et al. 2001; Jones et al. 2003; Prabhu and Hudson 2010). 최근에 페튜니아의 arogenate 경로의 ADT와 PPA-AT 모두를 RNAi 발현억제 시킨 형질전환체에서 페닐알라닌의 생합성이 확인되었으며 이는 식물의 주된 페닐알라닌 생합성 경로인 arogenate 경로를 억제시키면 phenylpyruvate 경로를 통해 페닐알라닌이 합성될 수 있음을 나타낸다(Yoo et al. 2013). 한편 phenylpyruvate 경로의 주된 효소로써 PPY-AT들이 관여하는 것으로 밝혀졌다. 이들은 기존의 방향족 아미노산 효소의 색소체 적중서열을 지니지 않고 세포질 내에 위치하며 arogenate 경로가 제한되었을 때 식물체의 페닐알라닌 생성에 관여하는 것으로 보여진다(Yoo et al. 2013). 그러나 색소체에서 생성된 phenylpyruvate의 세포질로의 이동과 세포질의 페닐알라닌 생합성과 관련한 효소들에 대한 연구는 앞으로 진행되어야 할 것이다.

Shikimate 및 방향족 아미노산 생합성 조절

미생물과 식물은 방향족 아미노산 생합성으로의 탄소흐름을 전사와 전사 후 수준에서 조절한다(Bentley 1990). 식물은 단백질 생합성뿐 아니라 식물의 주요 세포벽 구성성분, 방어물질 및 기능성 천연물질 생성을 위해 방향족 아미노산 생합성을 조절한다. 기능성 천연물질은 특정한 발달 단계 및 환경적 조건에 따라 그 수준이 급격하게 변동한다. 따라서 식물의 방향족 아미노산 생합성 조절은 하위의 기능성 천연물질 대사경로의 활성에 영향을 미치게 된다.

전사 조절

방향족 아미노산 생합성 효소들을 암호화하는 많은 유전자들은 발달 단계, 상처, 오존, 병원균 감염, elicitors 등과 같은 다양한 환경적 자극에 의해 그 발현이 조절된다(Entus et al. 2002; Devoto et al. 2005; Yan et al. 2007). 방향족 아미노산의 합성과 분해를 조절하는 전사인자의 규명은 공통의 스트레스 조건 및 공통 발현분석(co-expression analysis)을 통해서 이루어졌다. 예로, 방향족 아미노산인 페닐알라닌 유래의 이차 대사산물인 페닐프로파노이드 대사물질 함량의 증가는 페닐알라닌 생합성단계의 효소활성 증가와 일치한다는 결과가 관찰되었다(Ramsay and Glover 2005; Lepiniec et al. 2006; Stracke et al. 2007). 한편 식물체에서 shikimate 및 방향족 아미노산 생합성 경로의 유전자 발현을 직/간접적으로 조절하는 것으로 보이는 여러 전사인자들이 확인되었다.

또한 방향족 아미노산 유래의 천연물질들의 생합성을 조절하는 많은 전사인자들이 규명되어왔으며 그 중 몇 가지는 방향족 아미노산 생합성 유전자 발현을 조절한다. 트립토판 유래 이차 대사산물인 인돌글루코시놀레이트(indol glucosinolates)의 생합성 조절에는 altered Trp regulation1 (ATR1) 유전자가 관여하는 것으로 밝혀졌다(Malitsky et al. 2008). ATR1 유전자는 MYB계열의 전사인자인 MYB34로, 애기장대에서 과발현 시켰을 경우 shikimate 경로의 7단계 유전자중 6개의 유전자들(DAHPS, DHQS, DHD-SDH, EPSPS, CS)의 발현과 트립토판 생합성경로의 5개의 유전자(AS, PAT, PAI, IGPS, TS)의 발현이 모두 증가하였다.

페닐알라닌 유래의 이차 대사물질의 생합성과 관련한 많은 전사인자들이 밝혀져 왔다. 세포벽 형성과 관련한 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 NAC SECONDARY WALL THICKENING PROMOTING FACTOR1 (NST)의 경우, NST1과 NST3가 손상된 이중돌연변이체에서 페닐알라닌 생합성에 관여하는 유전자들의 발현이 감소되었다(Mitsuda et al. 2007). 또한 담배(Nicotiana attenuate)에서 초식동물(herbivores)에 대한 방어 기작에 필요한 페닐프로파노이드-폴리아민(polyamine) 결합체 생성과 관련한 MYB8 전사인자의 발현억제는 shikimate 경로의 모든 유전자들의 발현을 현저하게 감소시켰으며, 페닐프로파노이드-폴리아민 결합체의 생성을 저해시켰다(Kaur et al. 2010). 페닐프로파노이드계열의 향기물질인 휘발성 벤제노이드(benzenoid) 합성과 관련한 페튜니아의 전사인자인 ODORANT1 (ODO1) 유전자의 발현은 향기생성과 관련한 유전자의 발현을 증가시킬 뿐 아니라, shikimate 경로 및 방향족 아미노산 생합성 효소를 암호화하는 DAHPS, EPSPS, CM 유전자의 발현을 증가시켰다(Colquhoun et al. 2010b). 페튜니아 꽃에서 휘발성 향기물질의 시간적, 공간적 생성 및 배출에 관여하는 것으로 밝혀진 emission of benzenoid (EOBII) 전사인자의 발현억제 시 휘발성 물질 축적이 감소되었고, shikimate 경로의 CS, CM 유전자의 발현이 감소됨이 확인되었다(Spitzer-Rimon et al. 2010). 이러한 결과들은 다양한 천연 화합물 생성과 관련한 전사인자들이 shikimate 경로와 방향족 아미노산 생합성 유전자의 발현을 조절하는 방식을 보여준다. 이러한 전사인자에 의한 조절이 목적 유전자의 프로모터에 직접적 혹은 간접적으로 작용하는지의 여부는 앞으로 규명되어야 하며, 추가적인 전사인자들도 밝혀져야 할 것 이다.

전사 후 조절

방향족 아미노산의 생산은 전사조절 이외에도 복잡한 전사 후 조절을 받음으로써 shikimate 경로와 방향족 아미노산 생성경로로의 탄소 흐름이 조절된다(Fig. 3).

Fig. 3.

Posttranscriptional regulation of the shikimate and aromatic amino acid biosynthesis pathways in plant. Enzyme abbreviations are written as in Figure 2. Solid blue arrows and solid red lines represent the positive and negative regulation, respectively. Dashed gray lines represent suggested, but not clearly proven


shikimate 경로로의 첫 대사 흐름의 유입을 결정하는 DAHPS 효소활성은 미생물의 경우에는 방향족 아미노산이 해당 효소의 다른자리 입체성 조절부위에 결합함으로써 피드백 억제(feedback inhibition)를 나타내는 반면에, 식물의 경우 DAHPS 효소활성 조절 방식이 아직 명확하지 않다(Herrmann and Weaver 1999; Knaggs 2001). 단, 예외적으로 옥수수 싹과 완두콩잎에서의 DAHPS 효소활성은 트립토판과 티로신에 의해서 피드백 억제를 받는 반면, 당근과 감자에서는 트립토판에 의해서 활성화됨이 밝혀져 왔다(Graziana and Boudet 1980; Reinink and Borstlap 1982; Suzich et al. 1985; Pinto et al. 1986). 시금치와 녹두에서는 페닐알라닌 합성경로의 중간대사물질인 arogenate가 in vitro 상에서 DAHPS 효소활성을 저해했지만, 식물체내에서의 arogenate에 의한 피드백 억제 현상은 보고되지 않았다(Rubin and Jensen 1985; Doong et al. 1993).

식물체의 방향족 아미노산 생합성 경로에서는 AS, CM, ADT, ADH 효소활성이 피드백 억제에 의해 조절 받는 것으로 보고되고 있다(Jung et al. 1986; Siehl and Conn 1988; Romero et al. 1995a;1995b; Rippert and Matringe 2002; Yamada et al. 2008). 특히 트립토판과 페닐알라닌/티로신 경로로의 탄소흐름 분할은 분지효소인 AS와 CM 활성과 밀접하게 연관되어 조절된다. 두 가지 효소 모두 기질인 chorismate에 대해 경쟁한다. AS와 CM은 각각의 대사경로의 최종산물인 트립토판, 페닐알라닌/티로신에 의해서 피드백 억제를 받는다. 또한 트립토판에 의해 CM이 활성화되어 트립토판 생합성에서 페닐알라닌/티로신 생합성으로의 방향전환이 일어난다. 마찬가지로, 페닐알라닌/티로신 생합성의 분지점에 위치하는 효소들인 ADT/ADH와 PDT/PDH는 각각 페닐알라닌과 티로신에 의해 피드백 억제를 받는다. 때로는 티로신 생합성에서 페닐알라닌 생합성으로의 방향전환을 위해 티로신이 ADT를 활성화시키기도 한다.

다양한 이차 대사산물의 전구체이자 주요 기능성 물질의 공급회로인 shikimate와 방향족 아미노산 생합성 경로에 대한 식물체내의 생합성 및 조절 기작 연구는 식물체내의 기능성 물질 생산을 이해하기 위한 필수적이고 중요한 정보를 제공할 것이다.

Shikimate 및 방향족 아미노산 생합성 대사공학

Shikimate 및 방향족 아미노산 생합성 경로를 통해 생산되는 일차 대사물질은 기능성 이차 대사물질 생성을 위한 전구물질로 이용될 수 있기 때문에 아미노산의 생성 흐름과 조절 기작에 대한 연구는 앞으로도 필요하다.

현재까지 shikimate와 방향족 아미노산 대사경로의 유전자들을 대사공학적으로 적용해 하위 대사산물에 미치는 효과에 대해 연구해온 사례는 Table 2와 같다. Shikimate 경로의 첫 번째 효소인 DAHPS 유전자를 이용한 애기장대, 토마토, 페튜니아로의 형질전환 연구의 경우, 방향족 아미노산에 의한 다른자리 입체성에 의한 피드백 억제를 막기 위해서 C말단의 다른자리 입체성 부위를 제거하였다(Tzin et al. 2012; 2013; Oliva et al. 2015). 형질전환된 애기장대에서는 shikimate 유래의 중간산물 뿐만 아니라, 페닐알라닌 유래의 페닐프로파노이드 물질들, 트립토판 유래의 글루코시놀레이트 및 옥신 등이 증가되었다. 토마토의 경우에는 페닐알라닌 유래의 향기물질이 크게 증가되었으나 반면 카로티노이드계 향기물질의 생산은 감소되었다. 흥미롭게도 후각실험결과 사람들이 선호하는 향기성분인 2-phenylethanol은 증가하고, 불쾌한 향과 관련이 있는 polyamine putrescine은 감소되었다. 페튜니아의 경우에는 꽃잎에서 페닐알라닌 함량이 증가되고, 벤젠노이드와 페닐프로파노이드 유래의 휘발성 물질들이 증가되었다. 이러한 결과들은 shikimate 유래의 대사산물의 증가는 연관된 다른 대사산물 생성에 영향을 미친다는 것을 보여준다.

Table 2 Metabolic engineering for enhancing of aromatic amino acid-derived metabolites in plant

Target plant or tissueTarget geneOrigin of geneFunction of genePromoterStrategyResultsReferences
ArabidopsisAroGE.coliPhe feedback-insensitive DHAPS enzyme activityCaMV35SoverexpressionIncreased shikimate intermediate metabolites, phenylalanine, tryptophan and broad classes of secondary metabolite, such as phenylpropanoids, glucosinolates, auxin and other hormone conjugatesTzin et al. (2012)
TomatoAroGE.coliPhe feedback-insensitive DHAPS enzyme activityE8 fruit specificoverexpressionIncreased shikimic acid, aromatic amino acids and improved tomato quality (flavor and aroma)Tzin et al. (2013)
PetuniaAroGE.coliPhe feedback-insensitive DHAPS enzyme activityCaMV35SoverexpressionIncreased Phe and acccumulated the level of fragrant benzenoid-phenylpropanoid volatiles in petalOliva et al. (2015)
Legume (Astragalus sinicus)ASA25-methyl-tryptophan (5MT)-resistant tobacco cell lineTrp feedback-insensitive ASα enzyme activityCaMV35SoverexpressionIncreased free Trp in leaves, stems and roots and exhibited 5-MT resistance activityCho et al. (2000)
Tobacco (Nicotiana tabacum)ASA25MT-resistant tobacco cell lineTrp feedback-insensitive ASα enzyme activityPlastid 16S rRNA operonoverexpressionNormal phenotype and fertility Increased free Trp in leaves and total Trp levels in seeds and exhibited 5-MT resistance activityZhang et al. (2001)
ArabidopsisOASA1 (D323N)Rice (Oryza sativa)Trp feedback-insensitive ASα enzyme activityCaMV35SoverexpressionIncreased free Trp in seedling, and Phe and Tyr in leaves and roots Enhanced indol-3-ylmethyl glucosinolate Reduced phenylpropanoids and flavonoidsIshihara et al. (2006)
Potato (Solanum tuberosum)OASA1 (D323N)RiceTrp feedback-insensitive ASα enzyme activityCaMV35SoverexpressionIncreased free Trp and IAA contents in the upper part of the shootMatsuda et al. (2005)
RiceOASA1 (D323N)RiceTrp feedback-insensitive ASα enzyme activitymaize ubiquitin 1 gene (Ubi1)overexpressionIncreased free Trp in calli and leaves of seedling and exhibited 5-MT resistance activityTozawa et al. (2001)
Ubi1overexpressionIncreased free Trp, IAA and indole-alkaloid glucosideMorino et al. (2005)
ArabidopsisPheAE.coliCM/PDT bifunctional enzyme activityCaMV35SoverexpressionAccumulated Phe and Phe-, Tyr-derived metabolites Reduced Trp-derived metabolitesTzin et al. (2009)
TobaccoTyr1Yeast (Saccharomyces cerevisiae)Tyr feedback-insensitive PDH enzyme activityduplicated of Arabidopsis Histone gene H4748Co-expressionIncreased tocotrienol and resistance toward the herbicidal HPPD inhibitor diketonitrilRippert et al. (2004)
AtHPPDp-hydroxy phenyl pyruvate dioxygenase enzyme activityCatalyzed enzyme for final step in homogentisate synthesis

한편 방향족 아미노산 대사경로의 주요 분지점 효소가 각각의 방향족 아미노산 대사에 미치는 영향에 대한 연구가 진행되었다. 트립토판 생합성을 위한 첫 번째 분지점의 효소인 ASα의 피드백 둔감형 효소를 담배, 콩, 벼 등에 과발현시킨 결과 자유 트립토판 수준이 10배-400배 이상 증가하였다(Cho et al. 2000; Tozawa et al. 2001; Zhang et al. 2001; Matsuda et al. 2005). 이러한 결과는 피드백 둔감형 ASα의 과다발현이 트립토판 축적을 강화시킨다는 것을 보여준다. 트립토판의 축적 정도는 생물학적 시스템에 따라 달라진다. 애기장대의 트립토판 과다생산 형질전환체들에서는 페닐알라닌과 티로신 함량도 높게 나타났다(Ishihara et al. 2006). 이러한 결과는 고농도의 트립토판이 CM을 활성화시켜 페닐알라닌, 티로신 유래 이차 대사물질 생성에 영향을 미치는 것으로 보여진다. 피드백 둔감형 ASα를 과발현시킨 벼 캘러스와 감자에서 살펴보면, 트립토판 유래의 이차 대사산물인 indole-3-acetic acid가 각각 57배와 39배 증가하였다(Matsuda et al. 2005; Morino et al. 2005). 반면 애기장대의 경우에는 트립토판의 함량이 200배 이상 증가하지만, 병원균 접종시 인돌글루코시놀레이트의 함량이 오직 2배 증가하였다(Ishihara et al. 2006). 이러한 결과는 트립토판 함량이 인돌글루코시놀레이트 생성의 주요 제한 요인이 아니라는 것을 보여준다. 따라서 트립토판 유래의 이차 대사산물을 증진시키려면, 트립토판 생합성 경로 유전자와 더불어서 목적 이차 대사산물과 관련한 대사경로 유전자를 동반 과발현하는 전략이 필요하다고 보여진다.

페닐알라닌/티로신 합성을 위한 첫 번째 단계인 chorismate로부터 prephenate를 경유하여 phenylpyruvate를 합성하는 박테리아의 이중기능성 효소인 CM/PDT를 페닐알라닌에 의한 피드백 억제현상을 차단하기 위해 CM/PDT의 다른자리 입체성 조절부위를 제거하여 애기장대에서 과발현시켰을 경우, 형질전환체에서 대조구 식물체에 비해 100배 가량 페닐알라닌 함량이 증가되었다(Tzin et al. 2009). 이것은 도입된 박테리아 효소에 의해 만들어진 phenylpyruvate를 페닐알라닌으로 변환시키는 내재적 aminotransferase 활성을 애기장대가 지니고 있음을 나타낸다. 또한 형질전환체에서는 페닐알라닌유래 또는 티로신유래의 대사산물들인 페닐프로파노이드 및 비타민 E 등이 증가되었으며 반면, 트립토판유래의 이차 대사산물들은 감소되었다. 이러한 결과는 피드백 둔감형 CM/PDT에 의해서 chorismate가 페닐알라닌 생합성에 다량으로 사용되면서 트립토판 생합성을 위한 기질공급이 제한되었기 때문이라고 추측된다.

식물체내의 페닐알라닌과 티로신의 생합성은 arogenate 수준에서 나누어진다. 일반적으로 페닐프로파노이드계 물질 생성을 위해 페닐알라닌 생합성 쪽으로 탄소흐름이 치우치는 양상을 나타내고, 적은 양의 탄소가 티로신 생합성 쪽으로 유입되어 비타민 E의 전구체인 4-hydroxyphenylpyruvate로 변환된다(Rippert et al. 2004). 비타민 E의 생산을 목적으로 4-hydroxyphenylpyruvate로의 대사흐름을 증가시키기 위해서 효모유래의 티로신 비민감성 PDH 유전자를 담배의 색소체에서 발현시킨 결과 prephenate가 4-hydroxyphenylpyruvate로 변환되었으나 미량의 tocotrienols가 축적되었다. 반면 4-hydroxyphenylpyruvate를 homogentisate로 변환시키는 애기장대의 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD)를 티로신 비민감성 효모 PDH와 공동발현 시켰을 경우에는 다량의 tocotrienols가 축적되었다. 이전의 연구결과에서는 애기장대의 HPPD 유전자를 단독으로 과발현시킨 경우엔 tocopherol 생산이 제한적이었다고 보고되었다(Tsegaye et al. 2002; Falk et al. 2003). 이와 같이 식물체내 비타민 E 축적을 위해서는 전구물질인 4-hydroxyphenylpyruvate의 충분한 공급을 위한 PDH와 homogentisate로의 변환을 위한 HPPD의 발현이 동시에 충족되어야 한다는 것이 확인되었다.

결론적으로, 방향족 아미노산유래의 기능성 이차 물질 생산을 위한 대사공학을 위해서는 피드백 비민감성 효소들을 발현시킴으로써 전사 후 억제조절을 배제시켜 방향족 아미노산 생산을 증가시키는 전략과 더불어서 유용 이차 대사물질의 보다 효과적인 대량생산을 위해서는 해당 물질의 생합성 유전자의 과다발현이 동반되어야 할 것이다.

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Article

Review

Journal of Plant Biotechnology 2015; 42(3): 135-153

Published online September 30, 2015 https://doi.org/10.5010/JPB.2015.42.3.135

Copyright © The Korean Society of Plant Biotechnology.

식물에서 shikimate 및 방향족 아미노산 생합성 경로와 이의 대사공학적 응용

임선형1,*, 박상규1, 하선화2, 최민지1, 김다혜1, 이종렬1, 김영미1

1국립농업과학원, 농촌진흥청, 전주, 560-500, 대한민국,
2생명공학원, 경희대학교, 용인, 446-701, 대한민국

Received: 14 April 2015; Revised: 11 May 2015; Accepted: 29 May 2015

Biosynthetic pathway of shikimate and aromatic amino acid and its metabolic engineering in plants

Sun-Hyung Lim1,*, Sang Kyu Park1, Sun-Hwa Ha2, Min Ji Choi1, Da-Hye Kim1, Jong-Yeol Lee1, and Young-Mi Kim1

1National Academy of Agricultural Science, Rural Development Administration, JeonJu, 560-500, Korea,
2Graduate School of Biotechnology, Kyung Hee University, Yongin, 446-701, Korea

Correspondence to:S.-H. Lim e-mail: limsh2@korea.kr

Received: 14 April 2015; Revised: 11 May 2015; Accepted: 29 May 2015

Abstract

The aromatic amino acids, which are composed of ?-phenylalanine, ?-tyrosine and ?-tryptophan, are general components of protein synthesis as well as precursors for a wide range of secondary metabolites. These aromatic amino acids-derived compounds play important roles as ingredients of diverse phenolics including pigments and cell walls, and hormones like auxin and salicylic acid in plants. Moreover, they also serve as the natural products of alkaloids and glucosinolates, which have a high potential to promote human health and nutrition. The biosynthetic pathways of aromatic amino acids share a chorismate, the common intermediate, which is originated from shikimate pathway. Then, tryptophan is synthesized via anthranilate and the other phenylalanine and tyrosine are synthesized via prephenate, as intermediates. This review reports recent studies about all the enzymatic steps involved in aromatic amino acid biosynthetic pathways and their gene regulation on transcriptional/post-transcriptional levels. Furthermore, results of metabolic engineering are introduced as efforts to improve the production of the aromatic amino acids-derived secondary metabolites in plants.

Keywords: Aromatic amino acid, Metabolic engineering

서론

방향족 아미노산인 트립토판(?-Tryptophan), 페닐알라닌(?-phenylalanine), 티로신(?-tyrosine)은 모든 생명체의 단백질 생합성에 필수성분이다. 방향족 아미노산의 합성은 shikimate 경로와 chorismate 경로를 통해 이루어지며, 이러한 대사경로들은 몇몇 원생생물, 박테리아, 곰팡이, 식물에서 존재하나 동물에는 존재하지 않는다(Galili and Hoefgen 2002). 인간과 단위가축(monogastric)에 방향족 아미노산은 필수 영양물질일 뿐 아니라, 트립토판과 티로신은 각각 신경전달물질인 세라토닌과 카테콜라민의 전구체로서 중요성을 지닌다. 뿐만 아니라 방향족 아미노산과 그 유도체들은 약리적, 생리적 활성효과를 지니므로, 다양한 의약품, 화장품, 식품, 염료, 농약 및 기타 특수소재 등에 직, 간접적으로 광범위하게 사용되고 있다(Leonard et al. 2009).

방향족 아미노산은 식물의 성장과 발달, 생식, 방어, 환경적 반응 등에서 결정적 역할을 하는 매우 다양한 식물 이차 대사물질들의 전구체이다(Fig. 1). 트립토판은 식물 호르몬인 옥신(auxin)과 다양한 이차 대사물질, 알칼로이드(alkaloids), 파이토알렉신(phytoalexins), 인돌 글루코시놀레이트(indole glucosinolates)의 전구체이다. 또한 티로신은 이소퀴놀린 알칼로이드(isoquinoline alkaloids), 베타라인(betalains) 색소, 퀴논(quinones)의 전구체이다. 페닐알라닌은 다양한 페놀릭 화합물의 전구물질로 사용되는데, 대표적으로 플라보노이드(flavonoids), 중합 탄닌(condensed tannins), 리그닌 화합물(lignans, lignins), 휘발성 페닐프로파노이드/벤제노이드(phenylpropanoid/benzenoid volatiles) 화합물의 전구체이다. 또한 방향족 아미노산의 전구물질인 chorismate는 비타민 K1과 B9 및 식물 방어물질로 알려진 살리실산(salicylic acid)의 전구물질로 이용된다(Maeda and Dudareva 2012).

Figure 1.

Schematic diagram of the shikimate and aromatic amino acid biosynthetic pathway in plant. Secondary metabolites derived from chorismate, tryptophan (Trp), both phenylalanine (Phe) and tyrosine (Tyr) was shown in a light purple box, a light green box and a light orange box, respectively. ADCS, aminodeoxychorismate synthase; AS, anthranilate synthase; CM, chorismate mutase; ICS, isochorismate synthase


본 리뷰에서는 인류 건강증진, 의약, 농업 등 다양한 산업 분야에서 중요하게 고려되는 식물의 방향족 아미노산 생산과 현재까지 규명된 관련 효소들의 분자적 특성, 전사 및 전사 후 조절에 대한 정보를 제공하며 또한 식물체 내의 방향족 아미노산 생산을 높이기 위해 시도된 그 동안의 대사공학적 접근에 대해 되짚어 보며 앞으로 연구되어야 할 과제들을 제시하고자 한다.

Shikimate 생합성 경로

Shikimate 경로는 1차 대사와 방향족 아미노산 생합성을 연결하는 경로로서, 해당과정을 통해 생산된 phosphoenolpyruvate (PEP)와 5탄당 인산화 과정을 통해 생산된 erythrose 4-phosphate (E4P)를 이용하여 7단계의 효소반응을 통해 chorismate를 합성한다(Fig. 2). Shikimate 경로 관련 효소들은 생화학적 특성이 규명되어왔고, 각각의 해당 유전자들이 미생물과 식물에서 밝혀져 왔다. 대표적인 애기장대, 토마토, 벼에서의 shikimate 경로 관련 효소의 유전자는 Table 1에 나타내었다. 식물에서의 shikimate 경로 관련 효소들에 대한 다양한 실험적 결과와 세포 내 위치 예측 분석을 수행한 결과 대다수의 효소는 색소체(plastid)에 존재하는 것으로 판단된다(Emanuelsson et al. 1999).

Figure 2.

Shikimate and aromatic amino acid biosynthetic pathway. Through seven enzymatic reactions of the shikimate pathway, chorismate was produced. Trp is produced from chorismate via six enzymatic reactions of the Trp pathway (light green box), whereas Phe and Tyr are produced via three reactions in the arogenate or phenylpyruvate/4-hydroxyphenylpyruvate routes (light orange box). Other abbreviations: CdRP, 1-(o-carboxyphenylamino)-1-deoxy-ribulose 5-phosphate; DAHP, 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate; EPSP, 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate; G3P, glyceraldehyde 3-phosphate; Gln, glutamine; Glu, glutamate; HPP, 4-hydroxyphenylpyruvate; IGP, Indole-3-glycerol phosphate; α-KG, α-ketoglutarate; PRPP, 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate; PRA, 5-phosphoribosylanthranilate; S3P, shikimate-3-phosphate; Ser, serine. Enzyme abbreviations: ADH, arogenate dehydrogenase; ADT, arogenate dehydratase; ASα, anthranilate synthase α subunit; ASβ, anthranilate synthase β subunit; CM, chorismate mutase; CS, chorismate synthase; DAHPS, 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase; DHD-SDH, 3-dehydroquinate dehydratase-shikimate dehydrogenase; DHQS, 3-dehydroquinate synthase; EPSPS, 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase; HPP-AT, 4-hydroxyphenylpyruvate aminotransferase; IGPS, indole-3-glycerol phosphate synthase; PAI, phosphoribosylanthranilate isomerase; PAT, phosphoribosylanthranilate transferase; PDH, prephenate dehydrogenase; PDT, prephenate dehydratase; PPA-AT, prephenate aminotransferase; PPY-AT, phenylpyruvate aminotransferase; SDH, shikimate dehydrogenase; SK, shikimate kinase; TSα, tryptophan synthase α subunit; TSβ, tryptophan synthase β subunit


Table 1 . Enzyme and genes involved in shikimate and aromatic amino acid biosynthetic pathway in Arabidopsis, rice and tomato.

EnzymeAbbreviationArabidopsis thalianaaSolanum lycopersicumbOryza sativac
Shikimate Pathway
3-Deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthaseDAHPSAt1g22410Sl04g074480Os03g27230
At4g33510Sl11g009080Os07g42960
At4g39980Sl01g105390Os08g37790
Sl01g105420Os10g41480
3-Dehydroquinate synthaseDHQSAt5g66120Sl02g083590Os09g36800
Sl03g058860
3-Dehydroquianate dehydratase/shikimate dehydrogenaseDHD/SDHAt3g06350Sl01g067750Os01g27750
Sl06g084460Os01g27780
Sl09g011730Os12g34870
Sl10g038080
Shikimate kinaseSKAt2g21940Sl02g094420Os01g01302
At2g35500Sl04g051860Os02g51410
At3g26900Sl07g044970Os04g54800
At4g39540Sl08g076410Os06g12150
Os10g42700
5-Enolpyruvylshkimate 3-phosphate synthaseEPSPSAt1g48860Sl01g091190Os06g04280
At2g45300Sl05g050980
Sl09g005460
Chorismate synthaseCSAt1g48850Sl04g009620Os03g14990
Sl04g049350
Aminodeoxychorismate synthaseADCSAt2g28880Sl04g049360Os06g48620
Isochorismate synthaseICSAt1g73805Sl06g071030Os09g19734
At1g74710
Tryptophan Pathway
Anthranilate synthaseASAt1g24807Sl06g005980Os03g15780
At1g24909Sl06g006100Os03g50880
At1g25083Sl12g010180Os03g61120
At1g25155Os04g38950
At1g25220Os06g48620
At2g28880
At2g29690
At3g55870
At5g05730
At5g57890
Phosphoribosylanthranilate transferasePATAt5g17990Sl04g025540Os01g40480
At1g70570Sl06g071550Os02g44490
Sl12g035190Os02g57090
Os03g03450
Os03g44890
Os04g39680
Os04g58720
Os04g59520
Os05g30750
Os05g35480
Os06g41090
Os07g07070
Os07g30020
Phosphoribosylanthranilate isomerasePAIAt1g07780Sl02g076760Os02g16630
At1g29410Sl06g051410
At5g05590
Indole-3-glycerol phosphate synthaseIGPSAt2g04400Sl03g111850Os04g39270
At5g48220Os08g23150
Os09g08130
Tryptophan synthase alpha subunitTSAt3g54640Sl01g098550Os03g58260
At4g02610Os03g58290
Os03g58300
Os03g58320
Os07g08430
Tryptophan synthase beta subunitTSAt4g27070Sl05g046350Os06g42560
At5g28237Sl10g018380Os08g04180
At5g38530Sl07g064280
At5g54810Sl10g005320
Sl10g006400
Sl10g018390
Sl12g096190
Phenylalaine/Tyrosine Pathway
Chorismate mutaseCMAt1g69370Sl02g088460Os01g55870
At3g29200Sl11g017240Os02g08410
At5g10870Os08g34290
Os12g38900
Prephenate aminotransferasePPA-ATAt1g77670Sl03g120450Os01g65090
At1g80360Sl04g054710
At2g22250Sl11g013170
Arogenate dehydratase /prephenate dehydrataseADT /PDTAt1g08250Sl02g080620Os03g17730
At1g11790Sl06g050630Os04g33390
At2g27820Sl06g074530Os07g32774
At3g07630Sl07g007590Os07g49390
At3g44720Sl09g011870Os09g39230
At5g22630Sl11g066890Os10g37980
Sl11g072520
Arogenate dehydrogenase/prephenate dehydrogenaseADH/PDHAt1g15710Sl06g050630Os06g35050
At5g34930Sl06g060930Os06g49505
Sl07g007590Os06g49520
Sl09g011870
Phenylpyruvate/4-hydroxyphenylpyruvate aminotransferasesPPY-AT/HPP-ATAt2g20610Sl07g053710Os02g20360
At2g24850Sl07g053720Os06g23684
At4g23590Sl10g007110Os11g42510
At4g23600Sl10g008200
At4g28410
At4g28420
At5g36160
At5g53970

adata available from TAIR (http://www.arabidopsis.org/)

bdata available from TIGR (http://rice.plantbiology.msu.edu/)

cdata available from PLAZA 3.0 (http://plaza.psb.ugent.be/)

3-Deoxy-D-arabino-Heptulosonate 7-Phosphate Synthase (DAHPS)

Shikimate 경로의 첫 번째 단계 효소인 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase (DAHPS)는 PEP와 E4P의 알돌(aldol) 축합을 통해 DAHP를 생성한다. DAHPS는 2가 금속양이온(Mn2+, Co2+)을 포함하는 금속효소(metalloenzyme)이다(Huisman and Kosuge 1974; Rubin and Jesen 1985). 중심부는 원통(barrel)형 β/α motif가 8개 존재하는(β/α)8 단량체(monomer) 구조이고, 주변부는 방향족 아미노산에 의한 다른자리 입체성(allosteric)에 의해 조절되며 다양한 변이를 나타내고 있다. DAHPS는 아미노산 상동성에 따라서 2개의 유형으로 나누어진다(Tzin and Galili 2010). 미생물유래의 type I DAHPS에는 대장균의 AroF, AroG, AroH와 N말단 페닐알라닌/티로신 결합부위를 지닌 효모(Saccharomyces cerevisiae)의 Aro3, Aro4, 바실러스(Bacillus subtilis)의 chorismate mutase (CM)?DAHPS 활성을 지닌 이중기능성 효소가 해당된다(Benfey and Chua 1989; Wu and Woodard 2006). 식물과 몇몇 미생물(예로, Mycobacterium tuberculosis)에서 보고되는 type II DAHPS는 중심부 원통형 구조와 방향족 아미노산에 의해 피드백 저해(feedback inhibition)를 받는 다른자리 입체성 부위를 지니고 있다(Webby et al. 2005).

식물에서 보고되는 type II DAHPS는 비록 대장균과 효모와는 상동성이 매우 적으나, 이들 미생물의 DAHPS 돌연변이체를 이용한 상보성 검정(complementation test)을 수행하여 몇몇 식물 종에서 동형(isotype) DAHPS들이 분리되었다(Dyer et al. 1990; Keith et al. 1991). 애기장대의 경우에는 3개의 유전자가 DAHPS를 암호화하고 있는 것으로 밝혀져 있으나 몇몇 식물 종에서는 2개 또는 많게는 8개까지의 유전자가 암호화하고 있는 것으로 확인된다. 애기장대의 DAHPS1 유전자는 상처나 병원균 감염 1시간 이내에 강하게 발현이 유도되었고, 더불어 페닐프로파노이드 경로의 첫 번째 효소인 PAL 유전자의 발현도 증가하였다(Gorlach et al. 1995). 이러한 DAHPS와 PAL 유전자의 초기 발현증가는 상처나 병원균 감염과 관련한 방어물질 생산에 이들 유전자가 기능함을 시사한다. 반면, 애기장대 DAHPS2 유전자 발현은 변화되지 않았는데, 이것은 물질대사를 조절하는데 있어 두 유전자간 차이가 있으며 DAHPS1이 이차 대사물질 생합성의 변화에 대한 주요 효소를 암호화함을 시사한다.

3-Dehydroquinate Synthase (DHQS)

Shikimate 경로의 두 번째 효소인 3-dehydroquinate synthase (DHQS)는 Co2+와 같은 2가 양이온과 NAD+를 보조인자 (co-factor)로 사용하여 DAHP를 3-dehydroquinate로 변환시킨다. 곰팡이의 경우에는 AroM 복합체로 알려진 5중 기능성 효소가 DAHP를 5-enol pyruvylshikimate 3-phosphate (EPSP)로 변환시키는 5단계의 연속반응을 수행한다고 알려져 있는 반면, 대장균과 식물에서의 DHQS는 단일기능성 효소이다(Duncan et al. 1987; Bischoff et al. 1996). 대부분의 식물 종에서 DHQS 유전자는 1 copy로 존재하나, 콩의 경우 게놈 내에 2 copy로 존재한다(Tohge et al. 2013). 애기장대 AtDHQS 유전자는 1차 줄기 발달 과정에서 발현이 증가되는데, 이는 리그닌 생합성에 요구되는 페닐알라닌 생합성에 AtDHQS가 관여함을 말해준다(Ehlting et al. 2005). 애기장대의 경우, 대부분의 shikimate 생합성 유전자들의 발현은 페닐프로파노이드 물질 생산과 상관관계를 보였으나, DHQS 유전자의 발현은 그러한 경향을 보이지 않았다(Hamberger et al. 2006).

3-Dehydroquinate Dehydratase (DHD)?Shikimate Dehydrogenase (SDH)

3-Dehydroquinate dehydratase (DHD)와 shikimate:NADP+ oxidoreductase로도 불리는 shikimate dehydrogenase (SDH)는 shikimate 경로의 세 번째와 네 번째 효소반응을 촉매하여 shikimate를 생산한다. DHD는 3-dehydroquinate의 탈수화(dehydration)를 통해 3-dehydroshikimate를 생산하고, SDH는 NADPH를 보조인자로 사용하여 3-dehydroshikimate를 shikimate로 역 환원시킨다. 이들 효소의 구성은 생물계에 따라서 뚜렷한 차이를 나타낸다. 곰팡이에서 이들 효소는 AroM 복합체의 일부로 구성되고, 대장균의 AroD, AroE는 각각 단일기능성 효소이며, 식물의 경우에는 DHD-SDH 형태로 융합된 이중기능성 효소이다(Duncan et al. 1987; Anton and Coggins 1988; Bischoff et al. 2001). 식물에서 SDH 효소활성도는 DHD 효소활성보다 10배 이상 높게 나타나고 있으며, 생산된 3-dehydroshikimate를 효과적으로 shikimate로 변환시킨다(Fiedler and Schultz 1985). 이러한 이중기능성 효소들은 페놀릭 이차 대사경로의 물질 생산에 중요한 역할을 하리라 판단된다.

애기장대를 포함한 여러 식물 종에서 DHD-SDH는 단일 유전자로 존재하고 색소체 적중서열을 지니는 것으로 판단되어왔다(Bischoff et al. 2001; Singh and Christendat 2006). 애기장대 AtDHD-SDH 유전자는 자성 배우체 발달 및 기능에 요구되는 것으로 보여졌는데, 이는 shikimate 경로가 식물의 생식에도 관여함을 의미한다(Pagnussat et al. 2005). 예외적으로, 담배에서는 게놈 내에 색소체와 세포질의 DHD-SDH를 암호화하는 두 개의 유전자들이 보고되었다(Ding et al. 2007). 담배에서 색소체 NtDHD-SDH1 유전자의 RNAi 발현억제시 강한 생장억제와 더불어서 방향족 아미노산, 리그닌, chlorogenic acid의 생산이 감소되었고, 효소의 기질과 산물인 3-dehydroquinate와 shikimate가 축적되었다(Ding et al. 2007). 이것은 세포질 DHD-SDH 유전자인 NtDHD-SDH2의 효소 활성에 의해 dehydroquinate가 세포질에서 shikimate로 전환된 결과일 수 있지만, 아직까지 정확한 세포질 DHD-SDH의 역할이 밝혀지지 않고 있다.

Shikimate Kinase (SK)

Shikimate kinase (SK)는 ATP를 보조인자로 사용해서 shikimate를 인산화시켜 shikimate 3-phosphate를 생성시킨다. 대장균의 경우에는 2개의 SK 유전자가 존재하는데 식물에서는 종에 따라 그 수가 다양하다. 애기장대는 4개, 토마토는 4개, 벼(Oryza sativa)는 5개의 SK 유전자를 지닌다(Schmid et al. 1992; Kasai et al. 2005; Fucile et al. 2011). 애기장대의 AtSK1 발현은 고온 스트레스에 의해 10배 이상 증가하였고 효소 활성이 안정적인 반면, AtSK2의 발현은 변화되지 않았으며 열에 불안정한 활성을 나타냈다(Fucile et al. 2011). 식물이 고온 스트레스를 받을 경우 손상된 단백질을 대체하기 위해서 heat shock proteins (HSPs) 합성을 증가시키며, 산화적 손상으로부터 세포 보호를 위해 안토시아닌과 같은 페닐프로파노이드 물질 생산을 증가시킨다. 고온에 안정적인 AtSK1 유전자는 HSPs 합성에 필요한 방향족 아미노산 및 안토시아닌 생성을 위해 shikimate 경로의 metabolic flux를 증가시키는데 관여하는 것으로 보인다. 시금치(Spinacia oleracea)의 SK 단백질 실험에서는 ATP를 사용하는 다른 효소들과 마찬가지로, ATP, ADP, AMP의 상대적 농도에 따른 energy charge의 상태에 의해 활성이 조절된다고 보고되었다(Huang et al. 1975). 이것은 식물에서 SK가 shikimate 경로에서 요구되는 에너지와 세포 내의 에너지를 균형적으로 조절하는 데 중요한 역할을 하고 있음을 암시한다.

5-Enolpyruvylshikimate 3-Phosphate Synthase (EPSPS)

5-Enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase (EPSPS)는 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltranferase라고도 지칭되는 효소로 PEP의 enolpyruvyl unit을 shikimate 3-phosphate의 5-hydroxyl position으로 이동시킴으로써 EPSP의 생성을 촉매한다. EPSPS는 광범위하게 사용되는 제초제인 글리포세이트(glyphosate)의 목표 단백질로 알려져 있고, 글리포세이트에 대한 감응도에 따라 두 그룹으로 분류되어 왔다. 대장균을 포함한 대부분의 박테리아와 식물은 글리포세이트에 민감한 class I EPSPS를 지니는 반면에, 아그로박테리아(Agrobacterium sp. strain CP4)와 같은 몇몇 박테리아는 class II EPSPS를 지니며 이들은 글리포세이트에 저항성을 나타내므로 글리포세이트 저항성 작물 개발에 이용되어 왔다(Funke et al. 2006).

지금까지 애기장대, 사과, 포도 및 옥수수 등의 게놈 내에서 각각 2개의 EPSPS 유전자들이 보고되어왔다(Klee et al. 1987; Gasser et al. 1988; Forlani et al. 1994). 모든 식물 종의 EPSPS에는 LP(G/S)KSLSNRILLLAAL와 LFLGNAGTAMRPL 모티프가 보존되어 있다. 보존 아미노산 잔기는 EPSPS 효소의 촉매 기능과 글리포세이트와의 결합에 관여한다(Huynb et al. 1998). Shikimate 생합성 경로의 유전자들의 발현과 유사하게, 병원균 또는 유도인자에 의해서 EPSPS 유전자의 발현이 상향 조절되며, 일반적으로 EPSPS 유전자는 낮은 수준에서 상시 발현하지만, 페튜니아는 페닐알라닌 유래의 휘발성 물질이 생산되는 꽃잎 조직에서 발달단계별 조직특이적으로 발현되기도 한다(Gasser et al. 1988; Garg et al. 2014). 한편 EPSPS 유전자를 과발현시킨 작물의 경우에는 트립토판, 광합성률, 종자발아율 등과 같은 작물 적응력이 증가하였다(Wang et al. 2014).

Chorismate Synthase (CS)

Chorismate synthase (CS)는 EPSP의 3-phosphate와 C6-pro-R hydrogen을 제거하여 ring 구조에 두 번째 이중결합을 형성시킴으로써 chorismate를 생성하는 shikimate 경로의 마지막 반응을 촉매한다. 이 반응은 보조인자로 환원 플라빈 모노뉴클레오타이드(reduced Flavin mononucleotides, FMN)를 필요로 한다(Macheroux et al. 1999). 서로 다른 생물계의 CS들이 매우 높은 상동성과 단백질 구조의 유사성, 비슷한 보조인자 결합 특이성과 효소활성적 특성을 나타내지만, 산화된 FMN을 환원시키는 능력에 따라 두 그룹으로 구분되어 왔다(Schaller et al. 1991b; Maclean and Ali 2003; Quevillon-Cheruel et al. 2004). 곰팡이의 CS들은 이중기능성 효소의 일부로써 NADPH-dependent flavin reductase와 결합되어 기능을 지니는 반면, 대부분의 박테리아와 식물은 외부에서 공급되는 환원 플라빈 모노뉴클레오타이드에 의존하는 단일기능성 효소를 지닌다(Mousdale and Coggins 1986; Schaller et al. 1991a;1991b). 지금까지 CS를 암호화하는 유전자는 애기장대는 1개, 토마토는 2개를 지니는 것으로 밝혀져 왔다(Mousdale and Coggins 1986; Gorlach et al. 1993). 보리의 HvCS 유전자를 침입저항성에 감수성인 야생형 Mlo(Mildew resistance locus o) 개체에 과발현시켰을 때, 병원균에 대한 저항성이 크게 증가했다(Pingsha et al. 2009). 이것은 CS 유전자가 병원균의 침입 과정에서 생성되는 방어물질 생산에 관여하며 식물의 병에 대한 저항성을 부여함을 말해준다. 토마토의 경우, 1차 전사체의 선택적 스플라이싱에 의해 두 가지 LeCS1과 LeCS2 유전자를 가지며 조직별 발현 비율도 다르게 나타났다. 이것은 특정 환경인자 혹은 유도인자에 대한 두 유전자들의 발현양상이 차이를 보이며 조절 메커니즘도 다를 것이라 추측하게 한다(Gorlach et al. 1995).

CS 유전자에 의해서 합성된 chorismate는 shikimate 경로의 최종산물이자, 방향족 아미노산 합성을 위한 전구체이며, chorismate 유래의 대사산물을 제공하는 물질로도 사용된다. 생성된 chorismate를 기질로 하여 방향족 아미노산 및 chorismate 유래 대사물질들의 최초반응에 해당하는 효소들이 경쟁하게 된다. 비타민 B9으로 불리는 엽산(tetrahydrofolate)은 aminodeoxychorismate synthase (ADCS) 효소반응을 통해 생성되고, 식물호르몬인 살리실산 합성 및 비타민 K1으로 불리는 phylloquinone의 생합성은 isochorismate synthase (ICS) 효소반응으로 생성되며, 방향족 아미노산인 트립토판은 anthranilate synthase (AS) 효소반응을 거쳐 생성되고, 페닐알라닌과 티로신은 chorismate mutase (CM) 효소반응을 통해 생성된다(Wildermuth et al. 2001; Basset et al. 2004; Gross et al. 2006; Kim et al. 2008; Waller et al. 2010).

방향족 아미노산 생합성 경로

트립토판 생합성 경로

방향족 아미노산인 트립토판은 chorismate를 기질로 하여 여섯 단계의 효소반응을 통해 생성된다. 트립토판 대사경로에 관여하는 모든 생합성 효소들은 색소체에 위치하거나 또는 위치하는 것으로 예측 된다(Zhao and Last 1995; Kriechbaumer et al. 2008). 미생물에서 종종 발견되는 트립토판 생합성 대사경로의 다중기능성 효소들과 달리 식물 효소들은 모두 단일기능성 효소들로 밝혀졌다(Radwanski and Last 1995a).

Anthranilate Synthase (AS)

트립토판 생합성의 첫 번째 단계인 anthranilate 생성을 촉매하는 효소는 anthranilate synthase (AS)이다. AS는 두 개의 알파 서브유닛(ASα)과 두 개의 베타 서브유닛(ASβ)으로 구성되며 α2/β2 사량체(tetramer)를 형성한다(Romero et al. 1995a). ASα는 chorismate에 결합하여 아미노화(amination) 반응과 pyruvate 제거반응을 촉매하는 활성을 지니고, ASβ는 glutamine을 가수분해하여 ASα에 암모니아(ammonia)를 제공하는 활성을 지닌다. 대부분의 고등식물은 두 개의 ASα 유전자와 하나의 ASβ 유전자를 지니는 것으로 알려져 있다. 2개의 ASα 유전자중 하나는 상시 발현하는 반면, 나머지 하나는 발생, 상처 처리, 병원균 처리에 의해 발현 유도된다(Niyogi and Fink 1992; Tozawa et al. 2001). 이러한 유전자 발현 양상은 트립토판 유래 천연물질의 생산이 식물 방어 기작에 관여한다는 것을 시사한다. 대부분의 식물 AS 효소는 ASα에 트립토판이 결합해 피드백 저해를 받는 것으로 알려지고 있다(Morollo and Eck 2001). 일반적으로 다양한 식물 종에서 피드백 비민감성(feedback insensitive) AS를 암호화하는 유전자를 과다발현시킬 경우 트립토판과 이차 대사산물의 생산이 증가한다(Li and Last 1996; Tozawa et al. 2001; Hughes et al. 2004).

애기장대의 ASβ 서브유닛의 유전자가 손상된 trp4 돌연변이체는 anthranilate의 생산이 억제된다. Anthranilate는 UV 광조건에서 강한 청색형광(blue fluorescence)을 나타내며 이러한 특성은 애기장대 식물체에서 트립토판 관련 돌연변이체를 확인하기 위한 표현형 마커로 사용되고 있다(Rose et al. 1992; Radwanski and Last 1995a; Radwanski et al. 1995b).

Phosphoribosylanthranilate Transferase (PAT)

트립토판 생합성의 두 번째 효소인 phosphoribosylanthranilate transferase (PAT)는 phosphoribosylpyrophosphate의 phosphoribosyl 그룹을 anthranilate로 전달하여 5-phosphoribosylanthranilate를 생성시킨다. PAT 유전자는 애기장대에서 상시 발현하며, 처음 두 개의 인트론(intron)이 전사 후 mRNA 양을 증가시키는 것으로 나타났다(Rose and Last 1997a). 애기장대의 PAT1 유전자의 돌연변이체인 trp1는 anthranilate glucosides 축적에 따른 청색형광이 나타날 뿐만 아니라 크기 및 정단우세현상(apical dominance)이 줄어드는 옥신(auxin) 결핍 표현형을 나타낸다(Rose et al. 1997b). trp1의 옥신 결핍 표현형은 트립토판을 첨가하여도 회복되지 않는데, 이러한 결과는 트립토판 생합성경로와는 독립적인 옥신 생합성경로가 있음을 시사한다.

Phosphoribosylanthranilate Isomerase (PAI)

Phosphoribosylanthranilate isomerase (PAI)는 5-phosphoribosylanthranilate에서 1-(o-carboxy-phenylamino)-1-deoxy-ribulose 5-phosphate (CdRP)로의 변환 반응을 촉매한다. 애기장대 Columbia 생태형은 3개의 PAI 유전자들을 지니고 있으며 이들 유전자의 발현 양상은 다양하다. 정상 생육 조건의 애기장대에서 PAI1과 PAI3는 PAI2보다 10배 높은 발현을 보일 뿐 아니라, 유전자의 발현은 UV광 조사, 질산염처리와 같은 환경 스트레스에 의해 조직 및 세포에 따라서 다르게 발현된다(Li et al. 1995b; He and Li 2001). 애기장대의 PAI1 유전자가 삭제(deletion)될 경우 비정상적인 성장이 관찰된다. 이것은 PAI1 유전자가 트립토판 생합성에 핵심적 역할을 수행함을 나타낸다. 한편 애기장대 Wassilewskija 생태형은 4개의 PAI 유전자들을 지니며 그 중 PAI1과 PAI4는 염색체상에 inverted repeats의 형태로 나란히 위치한다. 이러한 유전자 배열은 small RNA를 매개로 한 메틸화(methylation)를 촉발시키고 그에 따라 PAI2 유전자의 발현이 메틸화에 의해 억제된다(Bartee and Bender 2001; Melquist and Bender 2003). 기존의 트립토판 돌연변이체들과 마찬가지로, PAI 유전자 역방향 발현 식물체는 청색형광 표현형을 나타냈다. 각각의 PAI 유전자들의 트립토판 유래 인돌(indole) 화합물 생성에 미치는 기능은 추후에 밝혀져야 할 부분이다.

Indole-3-Glycerol Phosphate Synthase (IGPS)

Indole-3-glycerol phosphate synthase (IGPS)는 CdRP의 indole-3-glycerol phosphate (IGP)로의 변환 반응을 촉매한다. IGPS는 indole ring을 만드는 유일한 효소로서, 트립토판과 옥신 생합성에서 중요한 반응 단계의 효소이다. 애기장대에서는 2개의 IGPS 유전자를 지니고 있으며 그 중 애기장대의 IGPS1 유전자를 발현억제 시키면 트립토판과 옥신이 모두 감소하는 반면, tryptophan synthase (TS)가 돌연변이 되었을 경우에는 트립토판은 감소되고 트립토판 유래 옥신의 합성은 증가되었다(Ouyang et al. 2000). 이러한 결과는 IGP가 트립토판과 트핍토판 비유래 옥신 합성의 핵심 분기점임을 시사한다. 한편 곰팡이와 박테리아에서는 IGPS가 하나 또는 두 개의 다른 트립토판 생합성 효소들과 융합된 형태로 존재하는 반면, 식물에서는 일반적으로 단일기능성 효소로서 존재한다(Li et al. 1995a; 1995b). 애기장대의 IGPS 유전자는 자스몬산(jasmonic acid), 살리실산과 같은 호르몬뿐 아니라 다양한 방어기전에 의해 발현이 조절된다(Job et al. 2005; Sasaki-Sekimoto et al. 2005; Chibani et al. 2006; Rajjou et al. 2006; Dombrecht et al. 2007).

Tryptophan Synthase (TS)

트립토판 생합성 경로의 마지막 두 단계 반응은 tryptophan synthase 알파 서브유닛(TSα)과 베타 서브유닛(TSβ)에 의해 일어난다. TSα에 의해 IGP는 인돌(indole)과 glyceraldehyde 3-phosphate (G3P)로 분리되고, TSβ는 인돌과 serine을 결합시킴으로써 트립토판을 생성한다(Barends et al. 2008). 애기장대의 기능적으로 검증된 TSα1 외에도 65%의 아미노산 상동성을 나타내는 TSα homolog (At4g02610)는 특성 분석되어 indole synthase로 명명 되었다. 애기장대의 기능적 TSβ 유전자는 TSβ1과 TSβ2로 2개이며 그 외에 추정상의 유전자가 2개 더 알려져 있다. 트립토판 생합성에서 TSα1과 TSβ1의 필수적 역할은 trp3와 trp2 돌연변이 각각의 트립토판 영양요구성(Trp auxotrophic) 표현형을 바탕으로 유전적으로 증명되었으며, 이들 유전자는 α2β2 이형복합체(heterocomplex)를 형성함이 제시되었다(Radwanski et al. 1995b; Radwanski et al. 1996). 애기장대의 TSα1 유전자는 대장균 돌연변이를 이용한 상보성 검정을 실시한 결과 단량체로 기능함이 제시되었다(Bohlmann et al. 1995; Radwanski and Last 1995a; Radwanski et al. 1995b). 그러나 단량체 또는 이형복합체로서의 TS 효소 기능에 대해서는 추가적 연구가 필요하다.

페닐알라닌 및 티로신 생합성

방향족 아미노산인 페닐알라닌과 티로신은 shikimate 경로의 최종산물인 chorismate로부터 합성된다. Chorismate는 chorismate mutase (CM)에 의해 prephenate로 변환되고, 이를 기질로 하여 2가지 대사경로로 페닐알라닌과 티로신이 생성된다. 하나는 arogenate 경로로서, prephenate를 ?-arogenate로 변환한 후, arogenate dehydratase (ADT) 또는 arogenate dehydrogenase (ADH)에 의해 각각 탈수화(dehydration)/탈카르복실화(decarboxylation)을 거쳐 페닐알라닌을 생성하거나, 탈수소화(dehydrogenation)/탈카르복실화를 거쳐 티로신을 생성한다. 또 다른 경로는 phenylpyruvate와 4-hydroxyphenylpyruvate 경로로서, 각각 페닐알라닌과 티로신을 생성한다. Phenylpyruvate 경로에서는 prephenate가 prephenate dehydratase (PDT)에 의해 탈수화/탈카르복실화 되어 phenylpyruvate로 변환된 후, transamination 되어 페닐알라닌이 생성된다. 4-hydroxyphenylpyruvate 경로에서는 prephenate가 prephenate dehydrogenase (PDH)에 의해 탈수소화/탈카르복실화되어 4-hydroxyphenylpyruvate로 변환된 후, transamination 되어 티로신이 생성된다.

대부분의 미생물들은 페닐알라닌과 티로신 합성을 위해서 주로 phenylpyruvate 경로를 이용한다(Zamir et al. 1985). 식물의 페닐알라닌 합성의 경우에는 미생물과는 달리 arogenate 경로가 주요 경로임이 밝혀졌으며, 티로신 합성의 주요경로는 앞으로 규명되어야 할 것이다(Maeda et al. 2010). 식물에서의 방향족 아미노산인 페닐알라닌과 티로신의 생합성 경로가 정확하게 밝혀진다면 식물의 탄소흐름의 분할과 그 조절에 대해 이해할 수 있을 것이다.

Chorismate Mutase (CM)

Chorismate mutase (CM)는 페닐알라닌과 티로신 생합성의 첫 번째 반응인 chorismate의 prephenate로의 전환을 촉매한다. CM은 방향족 아미노산을 생산하는 여러 생물체에서 기능적, 구조적으로 다양한 형태로 존재한다. 자연계에서 CM은 일반적인 단일기능성 효소 이외에도 B. subtilis의 CM-DAHPS 또는 대장균에서 발견된 CM-PDT, CM-PDH와 같은 상당수의 이중기능성 효소들로서 존재한다(Romero et al. 1995b). 단백질 구조를 바탕으로 CM 효소들은 α-helical 구조를 지닌 AroQ 타입과 α/β-원통형구조를 지닌 AroH 타입으로 분류 되어왔다(Chook et al. 1993; Lee et al. 1995). 대부분의 박테리아와 곰팡이, 식물의 CM 효소들은 AroQ 타입의 구조를 지니고 있다.

애기장대에서는 3개의 CM 유전자가 밝혀졌다. 이들은 대장균과, 효모의 CM-결핍 균주들에 대한 상보성 검정을 통해 CM 활성이 규명되었다(Eberhard et al. 1996). 이들 유전자들은 다양한 조직 내에서 서로 다른 양상으로 발현한다. CM1과 CM3 유전자의 발현은 다양한 유도인자(elicitor)와 병원균 처리에 의해서 유도된다(Mobley et al. 1999; Ehlting et al. 2005). 색소체 적중서열을 지닌 CM1과 CM3는 페닐알라닌과 티로신에 의해 활성이 억제되며 트립토판에 의해 활성화된다(Gilchrist et al. 1972; Kuroki and Conn 1989; Benesova and Bode 1992; Mobley et al. 1999). 최근 페튜니아 CM1 유전자 RNAi를 이용한 발현억제 연구를 통해 꽃잎의 페닐알라닌 유래 휘발성 물질인 페닐프로파노이드/벤제노이드(benzenoids) 생성에 CM1이 관여한다는 것이 확인되었다(Colquhoun et al. 2010a).

한편 색소체 적중서열을 지니지 않은 CM2의 경우, 담배의 CM2는 세포질에 위치하나 아직 CM 효소활성도는 검증되지 않았으며 애기장대 AtCM2는 CM 효소활성도는 검증되었으나 아직 그 생리적 중요성은 파악되지 않고 있다(d’Amato et al. 1984; Eberhard et al. 1996; Rippert et al. 2009). 또한 토마토의 오직 하나뿐인 CM 효소는 세포질에 위치하는 것으로 보인다. 한편 이들 세포질의 CM들은 방향족 아미노산에 의한 다른자리 입체성 조절을 받지 않는다(Eberhard et al. 1996).

최근 식물 종양을 유발하는 병원성 곰팡이인 Ustilago maydis를 포함하는 여러 미생물에서 chorismate mutase인 Cmu1을 분비한다는 연구결과가 보고되었다(Djamei et al. 2011).병원균이 식물 세포 내로 침투하여 Cmu1를 분비하여 식물 방어 기작에 관여하는 살리실산 생합성의 전구체인 chorismate를 prephenate로 급격히 변환시킴으로써 살리실산 생합성을 감소시켜 식물체내로의 침투를 용이하게 하는 것으로 보여진다.

Prephenate Aminotransferase (PPA-AT)

페닐알라닌과 티로신 생합성에서 arogenate 경로의 시작 단계 효소인 prephenate aminotransferase (PPA-AT)는 transamination 반응을 통해 prephenate로부터 arogenate를 생성한다. PPA-AT 효소활성은 그 동안 수행되어온 광범위한 생화학적 특성분석에 의해 많은 식물종 뿐 아니라 몇몇 박테리아에서도 검출되어왔다(Stenmark et al. 1974; Bonner and Jensen 1985; Maeda et al. 2011). 애기장대와 페튜니아, 토마토에서의 PPA-AT 유전자 규명을 통해 PPA-AT 효소들이 glutamate, aspartate, prephenate와 같은 dicarboxylic acid 기질들의 인식에 중요한 부위인 109번째 lysine을 지니는 class Ib aspartate aminotransferases (AT)에 속한다는 것이 밝혀졌으며 또한 식물 PPA-AT는 arogenate보다 prephenate에 대해 약 10배 높은 기질 친화도를 보임을 확인하였다(Nobe et al. 1998). 이것은 PPA-AT 효소들은 정반응을 촉매하여 prephenate로부터 arogenate로의 탄소흐름을 주도한다는 것을 나타낸다(Maeda et al. 2011; Dornfeld et al. 2014). 광범위한 기질 특이성을 보이는 대부분의 AT들과 마찬가지로, 종종 식물 PPA-AT 효소들은 aspartate AT 효소활성도 역시 나타낸다. 그러나, 페튜니아 꽃잎에서의 PPA-AT 유전자 RNAi 발현억제 시 aspartate AT 활성에는 영향을 미치지 않고 오직 PPA-AT 활성만 크게 감소하였다(Maeda et al. 2011). 이것은 PPA-AT 유전자의 단백질은 prephenate의 arogenate로의 변환이 주요 역할이며 식물의 전체 aspartate AT 활성에는 기여하는 바가 미미하다는 것을 나타낸다.

Prephenate and Arogenate Dehydratases (PDT and ADT)

Prephenate dehydratase (PDT)는 페닐알라닌 생합성경로에서 phenylpyruvate 경로의 첫 번째 단계인 탈카르복실화와 탈가수화반응으로 prephenate의 phenylpyruvate로의 전환을 촉매한다. 반면 ADT는 arogenate 경로의 마지막 단계인 arogenate의 페닐알라닌으로의 전환을 촉매한다. PDT와 ADT 단백질들은 촉매도메인(catalytic domain)과 페닐알라닌에 의한 다른자리 입체성 조절에 관여하는 C말단의 ACT (aspartokinase, chorismate mutase, TyrA) 조절도메인(regulatory domain)으로 구성된다. 곰팡이와 대부분의 박테리아들은 단일기능성의 PDT 또는 ADT 효소들을 지니는 반면, 대장균 같은 몇몇 진정세균들은 N말단에 CM과 융합된 이중기능성 CM-PDT (PheA) 효소를 지닌다(Kleeb et al. 2006).

식물 ADT 효소를 암호화하는 유전자는 박테리아 PDT들과의 상동성 검색을 통해, 애기장대에서는 6개, 벼에서는 6개, 페튜니아에서는 3개가 확인되었다. 이들 효소는 세포 내 위치조사에 의해 색소체에 위치하는 것으로 추정되었고, 기질로 prephenate가 아닌 arogenate를 선호하는 기질특이성을 나타냈다(Cho et al. 2007; Yamada et al. 2008; Maeda et al. 2010). 벼의 5-methyl-Trp 저항성 돌연변이인 Mtr1 에서는 페닐알라닌과 트립토판, 그 외에 여러 페닐프로파노이드 물질들이 축적되었다. 이것은 벼의 ADT (또는 PDT) 활성을 지니는 유전자의 점돌연변이(point mutation)에 의해 페닐알라닌에 의한 피드백 저해가 일어나지 않기 때문인 것으로 보인다(Yamada et al. 2008). 한편 페튜니아에서 ADT 유전자의 RNAi 발현억제 시 페닐알라닌의 합성이 약 80% 감소하였다. 이러한 결과는 페튜니아에서의 페닐알라닌의 합성은 주로 arogenate 경로를 통해 생성된다는 것을 나타낸다. 페튜니아 꽃에서 arogenate 경로의 PPA-AT와 ADT 효소활성도를 비교 분석한 결과 PPA-AT 효소활성도가 3배 이상 높다는 것이 관찰되었다(Maeda et al. 2010; 2011). 이는 arogenate 경로를 통한 페닐알라닌 합성 시에 PPA-AT 보다는 ADT가 반응률 제한 단계(rate-limiting step)의 효소임을 나타낸다.

ADT 효소활성도는 다양한 식물 조직과 종에서 검출되어온 반면 PDT 활성은 백화된 애기장대의 어린 식물체에서만 나타났다. 그러나 애기장대의 6개 ADT 중 3개(ADT1, ADT2, ADT6)의 효소는 ADT 활성 뿐만 아니라 prephenate를 기질로 하여 phenylpyruvate를 생성하는 PDT 활성도 역시 지니는 것으로 확인되었다(Cho et al. 2007). 또한 최근에 페튜니아의 꽃잎에 shikimate를 처리하여 shikimate 경로로의 탄소 흐름을 증가시킬 경우 phenylpyruvate가 검출되며, 또한 ADT-RNAi 발현억제 형질전환 꽃잎에서 줄어들었던 페닐알라닌 함량이 shikimate 처리에 의해 복구됨이 확인되었다(Meada et al. 2010). 이와 더불어 많은 식물체에서 phenylpyruvate가 검출되고 이를 기질로 한 이차 대사산물인 phenylacetaldehyde, 2-phenylethanol 등이 검출된다는 사실은 비록 arogenate 경로가 식물 페닐알라닌 생합성의 주요 경로이지만 PDT 효소활성을 통한 phenylpyruvate 경로 또한 식물 페닐알라닌 생합성에 기여할 수 있음을 시사한다(Watanabe et al. 2002; Kaminaga et al. 2006).

In situ 현미경 분석의 결과는 애기장대의 모든 ADT 효소들이 색소체에 위치함을 보여준다(Rippert et al. 2009). 애기장대의 ADT3의 경우 heterotrimeric G-protein 복합체의 구성 단백질로서 plasma membrane에 존재하는 것으로 관찰되었다(Warpeha et al. 2006). 이와 같이 ADT는 특정 성장 단계나 생리적 조건에서 다른 단백질과의 복합체로써 관여할 수도 있음을 알 수 있다.

현재까지의 연구결과를 취합해 보면 식물은 주로 arogenate 경로를 통해서 페닐알라닌을 합성하게 되는데, 이러한 결과는 PPA-AT 효소활성에 기인한 것으로 생각된다. Arogenate 뿐만 아니라 prephenate 역시 기질로 사용할 수 있는 ADT 효소들은 prephenate 기질에 대해 PPA-AT 효소와 경쟁한다. 두 효소들 모두 prephenate에 대해 비슷한 Km값을 보이지만 PPA-AT들의 촉매효율이 ADT들 보다 50-250배 가량 높다(Cho et al. 2007; Yamada et al. 2008; Maeda et al. 2010). 이러한 PPA-AT의 높은 촉매 효율이 탄소 흐름을 prephenate로부터 arogenate 경로로 대사 흐름을 진행시키는 것으로 볼 수 있다.

Arogenate and Prephenate Dehydrogenases (ADH and PDH)

ADH와 PDH는 arogenate와 prephenate의 산화적 탈카르복실화를 촉매하여 각각 티로신과 4-hydroxyphenylpyruvate를 생성한다. ADH와 PDH들은 사량체로써 활성을 나타내며 각각의 단량체들은 N말단 핵산결합부위와 C말단 기질결합부위를 지닌다(Legrand et al. 2006). 페닐알라닌 결합조절부위를 지닌 PDT, ADT들과는 달리 PDH와 ADH들은 독립적인 티로신 결합부위가 없고, 생성된 티로신에 의해 경쟁적으로 arogenate 기질에 대한 효소활성 저해를 받는다(Connelly and Conn 1986; Rippert and Matringe 2002; Legrand et al. 2006).

담배, 옥수수, 수수, 애기장대에서 arogenate를 티로신으로 변환시키는 ADH 활성이 검출되어 왔다. 반면 PDH 활성은 오직 콩류에서만 검출되어왔다(Rubin and Jensen 1979). 식물의 ADH 유전자들은 애기장대에서 2개와 옥수수에서 4개가 존재하는 것으로 밝혀졌으며, 애기장대 ADH는 모두 색소체에 위치한다(Rippert and Matringe 2002; Holding et al. 2010). 애기장대 효소들의 생화학적 특성분석 결과, ADH1이 arogenate에 대한 엄격한 기질 특이성을 보이는 반면 ADH2는 arogenate 뿐만 아니라 prephenate 또한 기질로 취할 수 있으나 arogenate에 비해 1000배 가량 낮은 촉매효율을 보였다(Rippert and Matringe 2002). 따라서 실제 PDH 활성에 의해 4-hydroxyphenylpyruvate를 경유하는 식물 티로신 생합성의 alternative 경로의 존재 여부는 추가적 연구를 통해 밝혀져야 할 것이다.

ADH 효소의 식물체에서의 생체내 기능은 아직 명확하지 않으나, transposon 삽입을 통한 옥수수 ADH1 유전자 손상시 불투명 내배유의 표현형과 종자의 저장 단백질(zein) 감소가 나타나며 또한 자유 티로신 함량이 약간 감소되었는데, 이는 중복된 ADH 유전자들이 티로신 생합성에 영향을 미치거나 또 다른 티로신 생합성 경로가 존재하기 때문인 것으로 추측된다(Holding et al. 2010).

Phenylpyruvate and 4-Hydroxyphenylpyruvate Aminotransferases (PPY-AT and HPP-AT)

Phenylpyruvate aminotransferase (PPY-AT)는 phenylpyruvate의 transamination을 촉매하여 페닐알라닌을 생성한다. 이와 비슷한 방식으로, 4-hydroxyphenylpyruvate aminotransferase (HPP-AT)는 4-hydroxyphenylpyruvate을 티로신으로 변환시킨다. 애기장대에는 예측되는 8개의 티로신 aminotransferase 유전자들이 존재하며(Arabidopsis Genome Initiat 2000), 이 중 두 개의 효소들은 생화학적 특성분석이 되어왔다(Lopukhina et al. 2001; Jones et al. 2003; Prabhu and Hudson 2010). 최근에 페튜니아의 arogenate 경로의 ADT와 PPA-AT 모두를 RNAi 발현억제 시킨 형질전환체에서 페닐알라닌의 생합성이 확인되었으며 이는 식물의 주된 페닐알라닌 생합성 경로인 arogenate 경로를 억제시키면 phenylpyruvate 경로를 통해 페닐알라닌이 합성될 수 있음을 나타낸다(Yoo et al. 2013). 한편 phenylpyruvate 경로의 주된 효소로써 PPY-AT들이 관여하는 것으로 밝혀졌다. 이들은 기존의 방향족 아미노산 효소의 색소체 적중서열을 지니지 않고 세포질 내에 위치하며 arogenate 경로가 제한되었을 때 식물체의 페닐알라닌 생성에 관여하는 것으로 보여진다(Yoo et al. 2013). 그러나 색소체에서 생성된 phenylpyruvate의 세포질로의 이동과 세포질의 페닐알라닌 생합성과 관련한 효소들에 대한 연구는 앞으로 진행되어야 할 것이다.

Shikimate 및 방향족 아미노산 생합성 조절

미생물과 식물은 방향족 아미노산 생합성으로의 탄소흐름을 전사와 전사 후 수준에서 조절한다(Bentley 1990). 식물은 단백질 생합성뿐 아니라 식물의 주요 세포벽 구성성분, 방어물질 및 기능성 천연물질 생성을 위해 방향족 아미노산 생합성을 조절한다. 기능성 천연물질은 특정한 발달 단계 및 환경적 조건에 따라 그 수준이 급격하게 변동한다. 따라서 식물의 방향족 아미노산 생합성 조절은 하위의 기능성 천연물질 대사경로의 활성에 영향을 미치게 된다.

전사 조절

방향족 아미노산 생합성 효소들을 암호화하는 많은 유전자들은 발달 단계, 상처, 오존, 병원균 감염, elicitors 등과 같은 다양한 환경적 자극에 의해 그 발현이 조절된다(Entus et al. 2002; Devoto et al. 2005; Yan et al. 2007). 방향족 아미노산의 합성과 분해를 조절하는 전사인자의 규명은 공통의 스트레스 조건 및 공통 발현분석(co-expression analysis)을 통해서 이루어졌다. 예로, 방향족 아미노산인 페닐알라닌 유래의 이차 대사산물인 페닐프로파노이드 대사물질 함량의 증가는 페닐알라닌 생합성단계의 효소활성 증가와 일치한다는 결과가 관찰되었다(Ramsay and Glover 2005; Lepiniec et al. 2006; Stracke et al. 2007). 한편 식물체에서 shikimate 및 방향족 아미노산 생합성 경로의 유전자 발현을 직/간접적으로 조절하는 것으로 보이는 여러 전사인자들이 확인되었다.

또한 방향족 아미노산 유래의 천연물질들의 생합성을 조절하는 많은 전사인자들이 규명되어왔으며 그 중 몇 가지는 방향족 아미노산 생합성 유전자 발현을 조절한다. 트립토판 유래 이차 대사산물인 인돌글루코시놀레이트(indol glucosinolates)의 생합성 조절에는 altered Trp regulation1 (ATR1) 유전자가 관여하는 것으로 밝혀졌다(Malitsky et al. 2008). ATR1 유전자는 MYB계열의 전사인자인 MYB34로, 애기장대에서 과발현 시켰을 경우 shikimate 경로의 7단계 유전자중 6개의 유전자들(DAHPS, DHQS, DHD-SDH, EPSPS, CS)의 발현과 트립토판 생합성경로의 5개의 유전자(AS, PAT, PAI, IGPS, TS)의 발현이 모두 증가하였다.

페닐알라닌 유래의 이차 대사물질의 생합성과 관련한 많은 전사인자들이 밝혀져 왔다. 세포벽 형성과 관련한 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 NAC SECONDARY WALL THICKENING PROMOTING FACTOR1 (NST)의 경우, NST1과 NST3가 손상된 이중돌연변이체에서 페닐알라닌 생합성에 관여하는 유전자들의 발현이 감소되었다(Mitsuda et al. 2007). 또한 담배(Nicotiana attenuate)에서 초식동물(herbivores)에 대한 방어 기작에 필요한 페닐프로파노이드-폴리아민(polyamine) 결합체 생성과 관련한 MYB8 전사인자의 발현억제는 shikimate 경로의 모든 유전자들의 발현을 현저하게 감소시켰으며, 페닐프로파노이드-폴리아민 결합체의 생성을 저해시켰다(Kaur et al. 2010). 페닐프로파노이드계열의 향기물질인 휘발성 벤제노이드(benzenoid) 합성과 관련한 페튜니아의 전사인자인 ODORANT1 (ODO1) 유전자의 발현은 향기생성과 관련한 유전자의 발현을 증가시킬 뿐 아니라, shikimate 경로 및 방향족 아미노산 생합성 효소를 암호화하는 DAHPS, EPSPS, CM 유전자의 발현을 증가시켰다(Colquhoun et al. 2010b). 페튜니아 꽃에서 휘발성 향기물질의 시간적, 공간적 생성 및 배출에 관여하는 것으로 밝혀진 emission of benzenoid (EOBII) 전사인자의 발현억제 시 휘발성 물질 축적이 감소되었고, shikimate 경로의 CS, CM 유전자의 발현이 감소됨이 확인되었다(Spitzer-Rimon et al. 2010). 이러한 결과들은 다양한 천연 화합물 생성과 관련한 전사인자들이 shikimate 경로와 방향족 아미노산 생합성 유전자의 발현을 조절하는 방식을 보여준다. 이러한 전사인자에 의한 조절이 목적 유전자의 프로모터에 직접적 혹은 간접적으로 작용하는지의 여부는 앞으로 규명되어야 하며, 추가적인 전사인자들도 밝혀져야 할 것 이다.

전사 후 조절

방향족 아미노산의 생산은 전사조절 이외에도 복잡한 전사 후 조절을 받음으로써 shikimate 경로와 방향족 아미노산 생성경로로의 탄소 흐름이 조절된다(Fig. 3).

Figure 3.

Posttranscriptional regulation of the shikimate and aromatic amino acid biosynthesis pathways in plant. Enzyme abbreviations are written as in Figure 2. Solid blue arrows and solid red lines represent the positive and negative regulation, respectively. Dashed gray lines represent suggested, but not clearly proven


shikimate 경로로의 첫 대사 흐름의 유입을 결정하는 DAHPS 효소활성은 미생물의 경우에는 방향족 아미노산이 해당 효소의 다른자리 입체성 조절부위에 결합함으로써 피드백 억제(feedback inhibition)를 나타내는 반면에, 식물의 경우 DAHPS 효소활성 조절 방식이 아직 명확하지 않다(Herrmann and Weaver 1999; Knaggs 2001). 단, 예외적으로 옥수수 싹과 완두콩잎에서의 DAHPS 효소활성은 트립토판과 티로신에 의해서 피드백 억제를 받는 반면, 당근과 감자에서는 트립토판에 의해서 활성화됨이 밝혀져 왔다(Graziana and Boudet 1980; Reinink and Borstlap 1982; Suzich et al. 1985; Pinto et al. 1986). 시금치와 녹두에서는 페닐알라닌 합성경로의 중간대사물질인 arogenate가 in vitro 상에서 DAHPS 효소활성을 저해했지만, 식물체내에서의 arogenate에 의한 피드백 억제 현상은 보고되지 않았다(Rubin and Jensen 1985; Doong et al. 1993).

식물체의 방향족 아미노산 생합성 경로에서는 AS, CM, ADT, ADH 효소활성이 피드백 억제에 의해 조절 받는 것으로 보고되고 있다(Jung et al. 1986; Siehl and Conn 1988; Romero et al. 1995a;1995b; Rippert and Matringe 2002; Yamada et al. 2008). 특히 트립토판과 페닐알라닌/티로신 경로로의 탄소흐름 분할은 분지효소인 AS와 CM 활성과 밀접하게 연관되어 조절된다. 두 가지 효소 모두 기질인 chorismate에 대해 경쟁한다. AS와 CM은 각각의 대사경로의 최종산물인 트립토판, 페닐알라닌/티로신에 의해서 피드백 억제를 받는다. 또한 트립토판에 의해 CM이 활성화되어 트립토판 생합성에서 페닐알라닌/티로신 생합성으로의 방향전환이 일어난다. 마찬가지로, 페닐알라닌/티로신 생합성의 분지점에 위치하는 효소들인 ADT/ADH와 PDT/PDH는 각각 페닐알라닌과 티로신에 의해 피드백 억제를 받는다. 때로는 티로신 생합성에서 페닐알라닌 생합성으로의 방향전환을 위해 티로신이 ADT를 활성화시키기도 한다.

다양한 이차 대사산물의 전구체이자 주요 기능성 물질의 공급회로인 shikimate와 방향족 아미노산 생합성 경로에 대한 식물체내의 생합성 및 조절 기작 연구는 식물체내의 기능성 물질 생산을 이해하기 위한 필수적이고 중요한 정보를 제공할 것이다.

Shikimate 및 방향족 아미노산 생합성 대사공학

Shikimate 및 방향족 아미노산 생합성 경로를 통해 생산되는 일차 대사물질은 기능성 이차 대사물질 생성을 위한 전구물질로 이용될 수 있기 때문에 아미노산의 생성 흐름과 조절 기작에 대한 연구는 앞으로도 필요하다.

현재까지 shikimate와 방향족 아미노산 대사경로의 유전자들을 대사공학적으로 적용해 하위 대사산물에 미치는 효과에 대해 연구해온 사례는 Table 2와 같다. Shikimate 경로의 첫 번째 효소인 DAHPS 유전자를 이용한 애기장대, 토마토, 페튜니아로의 형질전환 연구의 경우, 방향족 아미노산에 의한 다른자리 입체성에 의한 피드백 억제를 막기 위해서 C말단의 다른자리 입체성 부위를 제거하였다(Tzin et al. 2012; 2013; Oliva et al. 2015). 형질전환된 애기장대에서는 shikimate 유래의 중간산물 뿐만 아니라, 페닐알라닌 유래의 페닐프로파노이드 물질들, 트립토판 유래의 글루코시놀레이트 및 옥신 등이 증가되었다. 토마토의 경우에는 페닐알라닌 유래의 향기물질이 크게 증가되었으나 반면 카로티노이드계 향기물질의 생산은 감소되었다. 흥미롭게도 후각실험결과 사람들이 선호하는 향기성분인 2-phenylethanol은 증가하고, 불쾌한 향과 관련이 있는 polyamine putrescine은 감소되었다. 페튜니아의 경우에는 꽃잎에서 페닐알라닌 함량이 증가되고, 벤젠노이드와 페닐프로파노이드 유래의 휘발성 물질들이 증가되었다. 이러한 결과들은 shikimate 유래의 대사산물의 증가는 연관된 다른 대사산물 생성에 영향을 미친다는 것을 보여준다.

Table 2 . Metabolic engineering for enhancing of aromatic amino acid-derived metabolites in plant.

Target plant or tissueTarget geneOrigin of geneFunction of genePromoterStrategyResultsReferences
ArabidopsisAroGE.coliPhe feedback-insensitive DHAPS enzyme activityCaMV35SoverexpressionIncreased shikimate intermediate metabolites, phenylalanine, tryptophan and broad classes of secondary metabolite, such as phenylpropanoids, glucosinolates, auxin and other hormone conjugatesTzin et al. (2012)
TomatoAroGE.coliPhe feedback-insensitive DHAPS enzyme activityE8 fruit specificoverexpressionIncreased shikimic acid, aromatic amino acids and improved tomato quality (flavor and aroma)Tzin et al. (2013)
PetuniaAroGE.coliPhe feedback-insensitive DHAPS enzyme activityCaMV35SoverexpressionIncreased Phe and acccumulated the level of fragrant benzenoid-phenylpropanoid volatiles in petalOliva et al. (2015)
Legume (Astragalus sinicus)ASA25-methyl-tryptophan (5MT)-resistant tobacco cell lineTrp feedback-insensitive ASα enzyme activityCaMV35SoverexpressionIncreased free Trp in leaves, stems and roots and exhibited 5-MT resistance activityCho et al. (2000)
Tobacco (Nicotiana tabacum)ASA25MT-resistant tobacco cell lineTrp feedback-insensitive ASα enzyme activityPlastid 16S rRNA operonoverexpressionNormal phenotype and fertility Increased free Trp in leaves and total Trp levels in seeds and exhibited 5-MT resistance activityZhang et al. (2001)
ArabidopsisOASA1 (D323N)Rice (Oryza sativa)Trp feedback-insensitive ASα enzyme activityCaMV35SoverexpressionIncreased free Trp in seedling, and Phe and Tyr in leaves and roots Enhanced indol-3-ylmethyl glucosinolate Reduced phenylpropanoids and flavonoidsIshihara et al. (2006)
Potato (Solanum tuberosum)OASA1 (D323N)RiceTrp feedback-insensitive ASα enzyme activityCaMV35SoverexpressionIncreased free Trp and IAA contents in the upper part of the shootMatsuda et al. (2005)
RiceOASA1 (D323N)RiceTrp feedback-insensitive ASα enzyme activitymaize ubiquitin 1 gene (Ubi1)overexpressionIncreased free Trp in calli and leaves of seedling and exhibited 5-MT resistance activityTozawa et al. (2001)
Ubi1overexpressionIncreased free Trp, IAA and indole-alkaloid glucosideMorino et al. (2005)
ArabidopsisPheAE.coliCM/PDT bifunctional enzyme activityCaMV35SoverexpressionAccumulated Phe and Phe-, Tyr-derived metabolites Reduced Trp-derived metabolitesTzin et al. (2009)
TobaccoTyr1Yeast (Saccharomyces cerevisiae)Tyr feedback-insensitive PDH enzyme activityduplicated of Arabidopsis Histone gene H4748Co-expressionIncreased tocotrienol and resistance toward the herbicidal HPPD inhibitor diketonitrilRippert et al. (2004)
AtHPPDp-hydroxy phenyl pyruvate dioxygenase enzyme activityCatalyzed enzyme for final step in homogentisate synthesis

한편 방향족 아미노산 대사경로의 주요 분지점 효소가 각각의 방향족 아미노산 대사에 미치는 영향에 대한 연구가 진행되었다. 트립토판 생합성을 위한 첫 번째 분지점의 효소인 ASα의 피드백 둔감형 효소를 담배, 콩, 벼 등에 과발현시킨 결과 자유 트립토판 수준이 10배-400배 이상 증가하였다(Cho et al. 2000; Tozawa et al. 2001; Zhang et al. 2001; Matsuda et al. 2005). 이러한 결과는 피드백 둔감형 ASα의 과다발현이 트립토판 축적을 강화시킨다는 것을 보여준다. 트립토판의 축적 정도는 생물학적 시스템에 따라 달라진다. 애기장대의 트립토판 과다생산 형질전환체들에서는 페닐알라닌과 티로신 함량도 높게 나타났다(Ishihara et al. 2006). 이러한 결과는 고농도의 트립토판이 CM을 활성화시켜 페닐알라닌, 티로신 유래 이차 대사물질 생성에 영향을 미치는 것으로 보여진다. 피드백 둔감형 ASα를 과발현시킨 벼 캘러스와 감자에서 살펴보면, 트립토판 유래의 이차 대사산물인 indole-3-acetic acid가 각각 57배와 39배 증가하였다(Matsuda et al. 2005; Morino et al. 2005). 반면 애기장대의 경우에는 트립토판의 함량이 200배 이상 증가하지만, 병원균 접종시 인돌글루코시놀레이트의 함량이 오직 2배 증가하였다(Ishihara et al. 2006). 이러한 결과는 트립토판 함량이 인돌글루코시놀레이트 생성의 주요 제한 요인이 아니라는 것을 보여준다. 따라서 트립토판 유래의 이차 대사산물을 증진시키려면, 트립토판 생합성 경로 유전자와 더불어서 목적 이차 대사산물과 관련한 대사경로 유전자를 동반 과발현하는 전략이 필요하다고 보여진다.

페닐알라닌/티로신 합성을 위한 첫 번째 단계인 chorismate로부터 prephenate를 경유하여 phenylpyruvate를 합성하는 박테리아의 이중기능성 효소인 CM/PDT를 페닐알라닌에 의한 피드백 억제현상을 차단하기 위해 CM/PDT의 다른자리 입체성 조절부위를 제거하여 애기장대에서 과발현시켰을 경우, 형질전환체에서 대조구 식물체에 비해 100배 가량 페닐알라닌 함량이 증가되었다(Tzin et al. 2009). 이것은 도입된 박테리아 효소에 의해 만들어진 phenylpyruvate를 페닐알라닌으로 변환시키는 내재적 aminotransferase 활성을 애기장대가 지니고 있음을 나타낸다. 또한 형질전환체에서는 페닐알라닌유래 또는 티로신유래의 대사산물들인 페닐프로파노이드 및 비타민 E 등이 증가되었으며 반면, 트립토판유래의 이차 대사산물들은 감소되었다. 이러한 결과는 피드백 둔감형 CM/PDT에 의해서 chorismate가 페닐알라닌 생합성에 다량으로 사용되면서 트립토판 생합성을 위한 기질공급이 제한되었기 때문이라고 추측된다.

식물체내의 페닐알라닌과 티로신의 생합성은 arogenate 수준에서 나누어진다. 일반적으로 페닐프로파노이드계 물질 생성을 위해 페닐알라닌 생합성 쪽으로 탄소흐름이 치우치는 양상을 나타내고, 적은 양의 탄소가 티로신 생합성 쪽으로 유입되어 비타민 E의 전구체인 4-hydroxyphenylpyruvate로 변환된다(Rippert et al. 2004). 비타민 E의 생산을 목적으로 4-hydroxyphenylpyruvate로의 대사흐름을 증가시키기 위해서 효모유래의 티로신 비민감성 PDH 유전자를 담배의 색소체에서 발현시킨 결과 prephenate가 4-hydroxyphenylpyruvate로 변환되었으나 미량의 tocotrienols가 축적되었다. 반면 4-hydroxyphenylpyruvate를 homogentisate로 변환시키는 애기장대의 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD)를 티로신 비민감성 효모 PDH와 공동발현 시켰을 경우에는 다량의 tocotrienols가 축적되었다. 이전의 연구결과에서는 애기장대의 HPPD 유전자를 단독으로 과발현시킨 경우엔 tocopherol 생산이 제한적이었다고 보고되었다(Tsegaye et al. 2002; Falk et al. 2003). 이와 같이 식물체내 비타민 E 축적을 위해서는 전구물질인 4-hydroxyphenylpyruvate의 충분한 공급을 위한 PDH와 homogentisate로의 변환을 위한 HPPD의 발현이 동시에 충족되어야 한다는 것이 확인되었다.

결론적으로, 방향족 아미노산유래의 기능성 이차 물질 생산을 위한 대사공학을 위해서는 피드백 비민감성 효소들을 발현시킴으로써 전사 후 억제조절을 배제시켜 방향족 아미노산 생산을 증가시키는 전략과 더불어서 유용 이차 대사물질의 보다 효과적인 대량생산을 위해서는 해당 물질의 생합성 유전자의 과다발현이 동반되어야 할 것이다.

Fig 1.

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Figure 1.

Schematic diagram of the shikimate and aromatic amino acid biosynthetic pathway in plant. Secondary metabolites derived from chorismate, tryptophan (Trp), both phenylalanine (Phe) and tyrosine (Tyr) was shown in a light purple box, a light green box and a light orange box, respectively. ADCS, aminodeoxychorismate synthase; AS, anthranilate synthase; CM, chorismate mutase; ICS, isochorismate synthase

Journal of Plant Biotechnology 2015; 42: 135-153https://doi.org/10.5010/JPB.2015.42.3.135

Fig 2.

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Figure 2.

Shikimate and aromatic amino acid biosynthetic pathway. Through seven enzymatic reactions of the shikimate pathway, chorismate was produced. Trp is produced from chorismate via six enzymatic reactions of the Trp pathway (light green box), whereas Phe and Tyr are produced via three reactions in the arogenate or phenylpyruvate/4-hydroxyphenylpyruvate routes (light orange box). Other abbreviations: CdRP, 1-(o-carboxyphenylamino)-1-deoxy-ribulose 5-phosphate; DAHP, 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate; EPSP, 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate; G3P, glyceraldehyde 3-phosphate; Gln, glutamine; Glu, glutamate; HPP, 4-hydroxyphenylpyruvate; IGP, Indole-3-glycerol phosphate; α-KG, α-ketoglutarate; PRPP, 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate; PRA, 5-phosphoribosylanthranilate; S3P, shikimate-3-phosphate; Ser, serine. Enzyme abbreviations: ADH, arogenate dehydrogenase; ADT, arogenate dehydratase; ASα, anthranilate synthase α subunit; ASβ, anthranilate synthase β subunit; CM, chorismate mutase; CS, chorismate synthase; DAHPS, 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase; DHD-SDH, 3-dehydroquinate dehydratase-shikimate dehydrogenase; DHQS, 3-dehydroquinate synthase; EPSPS, 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase; HPP-AT, 4-hydroxyphenylpyruvate aminotransferase; IGPS, indole-3-glycerol phosphate synthase; PAI, phosphoribosylanthranilate isomerase; PAT, phosphoribosylanthranilate transferase; PDH, prephenate dehydrogenase; PDT, prephenate dehydratase; PPA-AT, prephenate aminotransferase; PPY-AT, phenylpyruvate aminotransferase; SDH, shikimate dehydrogenase; SK, shikimate kinase; TSα, tryptophan synthase α subunit; TSβ, tryptophan synthase β subunit

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Fig 3.

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Figure 3.

Posttranscriptional regulation of the shikimate and aromatic amino acid biosynthesis pathways in plant. Enzyme abbreviations are written as in Figure 2. Solid blue arrows and solid red lines represent the positive and negative regulation, respectively. Dashed gray lines represent suggested, but not clearly proven

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Table 1 . Enzyme and genes involved in shikimate and aromatic amino acid biosynthetic pathway in Arabidopsis, rice and tomato.

EnzymeAbbreviationArabidopsis thalianaaSolanum lycopersicumbOryza sativac
Shikimate Pathway
3-Deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthaseDAHPSAt1g22410Sl04g074480Os03g27230
At4g33510Sl11g009080Os07g42960
At4g39980Sl01g105390Os08g37790
Sl01g105420Os10g41480
3-Dehydroquinate synthaseDHQSAt5g66120Sl02g083590Os09g36800
Sl03g058860
3-Dehydroquianate dehydratase/shikimate dehydrogenaseDHD/SDHAt3g06350Sl01g067750Os01g27750
Sl06g084460Os01g27780
Sl09g011730Os12g34870
Sl10g038080
Shikimate kinaseSKAt2g21940Sl02g094420Os01g01302
At2g35500Sl04g051860Os02g51410
At3g26900Sl07g044970Os04g54800
At4g39540Sl08g076410Os06g12150
Os10g42700
5-Enolpyruvylshkimate 3-phosphate synthaseEPSPSAt1g48860Sl01g091190Os06g04280
At2g45300Sl05g050980
Sl09g005460
Chorismate synthaseCSAt1g48850Sl04g009620Os03g14990
Sl04g049350
Aminodeoxychorismate synthaseADCSAt2g28880Sl04g049360Os06g48620
Isochorismate synthaseICSAt1g73805Sl06g071030Os09g19734
At1g74710
Tryptophan Pathway
Anthranilate synthaseASAt1g24807Sl06g005980Os03g15780
At1g24909Sl06g006100Os03g50880
At1g25083Sl12g010180Os03g61120
At1g25155Os04g38950
At1g25220Os06g48620
At2g28880
At2g29690
At3g55870
At5g05730
At5g57890
Phosphoribosylanthranilate transferasePATAt5g17990Sl04g025540Os01g40480
At1g70570Sl06g071550Os02g44490
Sl12g035190Os02g57090
Os03g03450
Os03g44890
Os04g39680
Os04g58720
Os04g59520
Os05g30750
Os05g35480
Os06g41090
Os07g07070
Os07g30020
Phosphoribosylanthranilate isomerasePAIAt1g07780Sl02g076760Os02g16630
At1g29410Sl06g051410
At5g05590
Indole-3-glycerol phosphate synthaseIGPSAt2g04400Sl03g111850Os04g39270
At5g48220Os08g23150
Os09g08130
Tryptophan synthase alpha subunitTSAt3g54640Sl01g098550Os03g58260
At4g02610Os03g58290
Os03g58300
Os03g58320
Os07g08430
Tryptophan synthase beta subunitTSAt4g27070Sl05g046350Os06g42560
At5g28237Sl10g018380Os08g04180
At5g38530Sl07g064280
At5g54810Sl10g005320
Sl10g006400
Sl10g018390
Sl12g096190
Phenylalaine/Tyrosine Pathway
Chorismate mutaseCMAt1g69370Sl02g088460Os01g55870
At3g29200Sl11g017240Os02g08410
At5g10870Os08g34290
Os12g38900
Prephenate aminotransferasePPA-ATAt1g77670Sl03g120450Os01g65090
At1g80360Sl04g054710
At2g22250Sl11g013170
Arogenate dehydratase /prephenate dehydrataseADT /PDTAt1g08250Sl02g080620Os03g17730
At1g11790Sl06g050630Os04g33390
At2g27820Sl06g074530Os07g32774
At3g07630Sl07g007590Os07g49390
At3g44720Sl09g011870Os09g39230
At5g22630Sl11g066890Os10g37980
Sl11g072520
Arogenate dehydrogenase/prephenate dehydrogenaseADH/PDHAt1g15710Sl06g050630Os06g35050
At5g34930Sl06g060930Os06g49505
Sl07g007590Os06g49520
Sl09g011870
Phenylpyruvate/4-hydroxyphenylpyruvate aminotransferasesPPY-AT/HPP-ATAt2g20610Sl07g053710Os02g20360
At2g24850Sl07g053720Os06g23684
At4g23590Sl10g007110Os11g42510
At4g23600Sl10g008200
At4g28410
At4g28420
At5g36160
At5g53970

adata available from TAIR (http://www.arabidopsis.org/)

bdata available from TIGR (http://rice.plantbiology.msu.edu/)

cdata available from PLAZA 3.0 (http://plaza.psb.ugent.be/)

Table 2 . Metabolic engineering for enhancing of aromatic amino acid-derived metabolites in plant.

Target plant or tissueTarget geneOrigin of geneFunction of genePromoterStrategyResultsReferences
ArabidopsisAroGE.coliPhe feedback-insensitive DHAPS enzyme activityCaMV35SoverexpressionIncreased shikimate intermediate metabolites, phenylalanine, tryptophan and broad classes of secondary metabolite, such as phenylpropanoids, glucosinolates, auxin and other hormone conjugatesTzin et al. (2012)
TomatoAroGE.coliPhe feedback-insensitive DHAPS enzyme activityE8 fruit specificoverexpressionIncreased shikimic acid, aromatic amino acids and improved tomato quality (flavor and aroma)Tzin et al. (2013)
PetuniaAroGE.coliPhe feedback-insensitive DHAPS enzyme activityCaMV35SoverexpressionIncreased Phe and acccumulated the level of fragrant benzenoid-phenylpropanoid volatiles in petalOliva et al. (2015)
Legume (Astragalus sinicus)ASA25-methyl-tryptophan (5MT)-resistant tobacco cell lineTrp feedback-insensitive ASα enzyme activityCaMV35SoverexpressionIncreased free Trp in leaves, stems and roots and exhibited 5-MT resistance activityCho et al. (2000)
Tobacco (Nicotiana tabacum)ASA25MT-resistant tobacco cell lineTrp feedback-insensitive ASα enzyme activityPlastid 16S rRNA operonoverexpressionNormal phenotype and fertility Increased free Trp in leaves and total Trp levels in seeds and exhibited 5-MT resistance activityZhang et al. (2001)
ArabidopsisOASA1 (D323N)Rice (Oryza sativa)Trp feedback-insensitive ASα enzyme activityCaMV35SoverexpressionIncreased free Trp in seedling, and Phe and Tyr in leaves and roots Enhanced indol-3-ylmethyl glucosinolate Reduced phenylpropanoids and flavonoidsIshihara et al. (2006)
Potato (Solanum tuberosum)OASA1 (D323N)RiceTrp feedback-insensitive ASα enzyme activityCaMV35SoverexpressionIncreased free Trp and IAA contents in the upper part of the shootMatsuda et al. (2005)
RiceOASA1 (D323N)RiceTrp feedback-insensitive ASα enzyme activitymaize ubiquitin 1 gene (Ubi1)overexpressionIncreased free Trp in calli and leaves of seedling and exhibited 5-MT resistance activityTozawa et al. (2001)
Ubi1overexpressionIncreased free Trp, IAA and indole-alkaloid glucosideMorino et al. (2005)
ArabidopsisPheAE.coliCM/PDT bifunctional enzyme activityCaMV35SoverexpressionAccumulated Phe and Phe-, Tyr-derived metabolites Reduced Trp-derived metabolitesTzin et al. (2009)
TobaccoTyr1Yeast (Saccharomyces cerevisiae)Tyr feedback-insensitive PDH enzyme activityduplicated of Arabidopsis Histone gene H4748Co-expressionIncreased tocotrienol and resistance toward the herbicidal HPPD inhibitor diketonitrilRippert et al. (2004)
AtHPPDp-hydroxy phenyl pyruvate dioxygenase enzyme activityCatalyzed enzyme for final step in homogentisate synthesis

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pISSN 1229-2818
eISSN 2384-1397
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