인구의 증가와 경지면적의 감소 등으로 야기된 식량 문제의 대안으로 유전자변형생물체(Living Modified Organism; LMO)의 개발이 주목받기 시작했고, 1996년 첫 재배 승인이 된 후 LM 작물의 재배 면적은 급속도로 늘어나고 있다. 2014년 LM 작물의 재배 면적은 2013년 1억 7,530만 ha 보다 약 620만 ha 증가한 1억 8,150만 ha로, 이는 세계 전체 농지면적의 약 13% 수준에 해당한다. 미국, 브라질, 아르헨티나, 캐나다, 인도, 중국 등이 주요 LM 작물 재배 국가로서 콩, 면화, 옥수수, 캐놀라 등을 재배하고 있을 뿐만 아니라, 근래에는 더 많은 국가가 가세하고 있으며 재배작물의 종류도 확대되고 있다. 전 세계적으로 많이 재배하는 LM 작물인 콩, 옥수수, 면화 및 유채 등은 이들 작물의 전체 재배면적 대비 LMO 재배 면적이 약 50% 수준에 이른다(ISAAA 2014). 우리나라의 곡물 자급률은 1990년 43.1%에서 2000년 29.7%로 하락한 뒤 2012년 23.7%, 2013년에는 23.1%까지 감소하여, OECD 국가 중 매우 낮은 수준이다. 곡물의 수입의존도가 높은 우리나라의 경우 특히 사료용으로 가격이 저렴한 LM 작물의 수입이 계속 늘어나고 있다. 국내 축산농가에서 사용되는 사료용 곡물인 옥수수, 밀, 콩의 자급률은 2013년 기준으로 각각 0.5%, 1.0%, 9.7%로 사실상 해외에 절대적으로 의존하고 있다(MAFRA 2015). 2015년 2월 현재 국내에는 131개의 LMO가 식용, 사료용, 가공용으로 수입 및 유통되고 있다(KBCH 2015).

식량 문제의 대안 뿐만 아니라 바이오 연료를 활용한 에너지 자원화 및 난치병 치료의 해결 방법으로서 LMO의 생산?수입 및 유통에 대한 긍정적 견해가 있는 반면에 여전히 안전성에 대한 논쟁이 끊이지 않고 있다. LMO가 자연 생태계나 인체 및 동물에게 미치는 잠재적인 위해성은 교잡을 통한 유전자 이동으로 토종 품종의 손실, 생태계 교란, 잡초화, 토양미생물상의 변화, 비 표적 곤충류 피해, 먹이사슬의 파괴 및 지역적 생물 다양성의 감소 유발 가능 등에 관한 것이다(Agbios 2001). 해외 LMO 안전성 논란 사례로 2005년 영국의 ‘인디펜던스’가 폭로한 해충 저항성 옥수수인 MON863을 먹인 쥐의 내장과 간의 혈액 질환 현상, 신장 크기 이상에 대한 논란과 2012년부터 프랑스에서 논쟁이 벌어지고 있는 제초제 저항성 옥수수 NK603의 만성 독성에 대한 연구결과가 대표적이다(Seralini et al. 2012). 우리나라의 경우 각 부처에서 환경 위해성 평가 및 심사를 통해 LMO를 수입하지만, 안전성에 대한 불안함은 여전히 존재하며, 이미 국내에서의 비의도적인 LMO 환경 유출 사례도 여러 차례 보고되었다(Park et al. 2007; Lee et al. 2007). 이것은 LMO의 자연 생태계 유출 및 확산에 따른 생태계 위해 가능성이 항상 존재한다는 것을 나타낸다. 따라서 국내 유입 LMO의 자연환경 위해성 조사 및 과학적 사후관리 수행을 위한 신속하고 효율적인 분석 체계 구축이 필요하다. 국립환경과학원에서는 2009년부터 국내 5개 권역의 LM 작물 수입 경로 위주로 “LMO의 전국 자연환경 모니터링 및 사후관리 연구”를 수행하여 비의도적 환경방출 여부를 모니터링하고 있고, 비의도적으로 환경 방출된 LMO의 수가 2009년부터 2014년까지 꾸준히 증가하고 있다(Eom et al. 2013). 따라서 자연 생태계에서 발견되는 LMO의 확인과 제거를 목적으로 하는 효율적인 사후관리 체계를 확립하기 위해서 먼저 정확한 LMO 여부를 확인할 수 있는 신속·정확·표준화된 도입유전자 검출기법 확립이 필요하다. 하지만 현 ?유전자변형생물체의 국가 간 이동 등에 관한 법률(LMO법)?에 따라 개발사에서는 식품·의료기기용 및 농림축산업용 LMO의 수입 승인 책임기관인 식품의약품안전처와 농촌진흥청에 제한하여 식품용 및 사료용 LMO 검출기법을 제공하고 있어 국립생태원에서 효율적인 모니터링 및 사후관리 연구를 위해 자체적인 LMO 유전자 검출기법의 확립이 요구되고 있다. 국립환경과학원에서는 2011부터 2013년까지 콩 6개, 면화 6개, 유채 5개, 옥수수 15개, 사탕무 1개 총 5종 33개 이벤트(event)의 검출기법을 확립하였다(Kim et al. 2011; Yoon et al. 2012). 그래서 국립생태원은 현재 국내 수입·유통되고 있는 LM 작물 중에서 구매 가능한 7개 이벤트를 선정하여 유럽공인기법을 바탕으로 2014년 LMO에 도입된 유전자 검출기법 구축연구를 수행하였다. 본 연구 결과로 확립된 도입유전자 검출기법은 국내 도입 LMO의 80%를 검출할 수 있어 자연환경으로 유출된 LMO 판단의 과학적 근거를 제공할 것이다. 또한, LMO 자연 생태계 안전관리를 위한 사후 모니터링 체계 마련에 활용하고자 국립생태원에서는 지속적으로 LMO의 검출기법을 확립하고자 한다.

표준시료 확보

LM 작물에 도입된 유전자별 특성 조사 및 검출법 개발에 필요한 표준시료의 확보를 위해 2곳의 표준물질 연구소를 조사하였다. 유전자변형 면화(281/3006, GHB119) 및 비변형 면화의 표준시료를 표준물질 및 측정연구소(Institute for Reference Materials and Measurements, IRMM)의 대행 회사인 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)사에서 구매하였으며, 미국유지화학협회(American Oil Chemists’ Society (AOCS, Urbana, IL, USA))로부터 유전자변형 콩(CV127, MON87701, MON87705, FG72)과 유전자변형 옥수수(MON87460) 및 비변형 콩과 옥수수의 표준시료를 구매하였다. 표준시료의 자세한 정보는 Table 1과 같다(Table 1).

Table 1 . List of Seven LM events.

Kind of Crops	Event	Provide	Form
Soybean	CV127	AOCS	Powder (10 g)
	MON87701	AOCS	Powder (10 g)
	MON87705	AOCS	Powder (10 g)
	FG72	AOCS	DNA (10 μg)
Cotton	281/3006	IRMM	Powder (10 g)
	GHB119	IRMM	Powder (10 g)
Maize	MON87460	AOCS	Powder (10 g)

DNA 정제

도입유전자별 특성 조사 및 검출법 개발을 위해 확보한 7개 LMO 표준시료 중, 1개의 DNA 상태(콩 FG72) 표준시료를 제외한 6개의 분말 시료와 비변형 표준시료에서 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)을 이용하여 genomic DNA를 순수분리·정제하였다. 유전자변형 콩을 포함한 모든 시료는 약 200?~?300 mg씩 멸균된 E-tube로 옮겨 AP1 Buffer 400 ?L와 RNase A 4 ?L를 첨가 후 혼합하여 65°C에서 10분 동안 반응시켰다. 그리고 AP2 Buffer를 130 ?L 첨가 후 혼합하여 5분 동안 얼음에서 반응 시킨 후, 14,000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 QIAshredder spin column에 옮겨 14,000 rpm으로 2분간 원심분리하였다. Column에 걸러진 반응(하층)액을 새로운 E-tube 옮긴 후 AP3/E를 넣고 혼합시켜 DNeasy mini spin column에 이동하였다. 8,000 rpm으로 1분간 원심분리 후, 하층액을 버리고 AW Buffer 500 ?L (70% ethanol)을 가하여 14,000 rpm으로 2분간 원심분리하였다. Ethanol 제거 후 건조한 다음 100 ?L의 멸균 수로 녹여 genomic DNA를 추출하였다. 정제된 genomic DNA는 1.0% agarose gel을 사용하여 전기영동을 통해 DNA band를 확인하였을 뿐만 아니라, Nano-drop (Thermo fisher scientific, Waltham, USA)을 이용하여 흡광도를 측정하여 260/280 nm의 값이 1.8 이상인 것을 사용하였다. 순수 분리된 genomic DNA는 -20°C에 보관하였다.

Primer 제작

각 작물의 내재유전자 primer는 NCBI GenBank 유전자 염기서열을 기초로 하여, 콩은 Lectin 1 (Le1, GenBank accession no. K00821), 면화 Alcohol DehydrogenaseC (AdhC, GenBank accession no. AF403330) 및 옥수수 Alcohol Dehydrogenase1 (Adh1, GenBank accession no. AF123535)의 primer를 제작하였다. 그리고 7개 LM 작물에 도입된 목적 유전자를 검출하기 위한 primer는 유럽위원회 공동연구센터(European Commission, Joint Research Centre, JRC)와 LM 환경 위해성 센터(Center for Environmental Risk Assessment, CERA)에서 LMO 이벤트의 도입유전자 특성과 프라이머 서열 정보 등을 바탕으로 제작하였다(JRC 2014)(Table 2). 모든 primer는 ㈜마크로젠에서 제작하여 사용 전까지 -20°C에 보관하였고 도입유전자 검출 PCR 반응 시 10 pM로 희석하여 사용하였다.

Table 2 . Oligonucleotide primers used in this study.

Primer name	Sequence (5’-3’)	Target	Amplicon size (bp)
Lectin1-F	CACCTTTCTCGCACCAATTGACA	Lectin1 (Soybean endogenous)	105
Lectin1-R	TCAAACTCAACAGCGACGAC
Alcohol DehydrogenaseC-F	CACATGACTTAGCCCATCTTTGC	AdhC (Cotton endogenous)	73
Alcohol DehydrogenaseC-R	CCCACCCTTTTTTGGTTTAGC
Alcohol Dehydrogenase1-F	CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC	Adh1 (Maize endogenous)	135
Alcohol Dehydrogenase1-R	CCACTCCGAGACCCTCAGTC
SE-127-F4	AACAGAAGTTTCCGTTGAGCTTTAAGAC	CV127	88
SE-127-R2	CATTCGTAGCTCGGATCGTGTAC
MON87701-F	CGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAA	MON87701	89
MON87701-R	TGGTGATATGAAGATACATGCTTAGCAT
MON87705-F	TTCCCGGACATGAAGCCATTTAC	MON87705	86
MON87705-R	ACAACGGTGCCTTGGCCCAAAG
MAE071-F	AGATTTGATCGGGCTGCAGG	FG72	70
SHA097-R	GCACGTATTGATGACCGCATTA
281-f1	CTCATTGCTGATCCATGTAGATTTC	281/3006	111
281-r2	GGACAATGCTGGGCTTTGTG
SHA021-F	CCAGTACTAAAATCCAGATCATGCA	GHB119	90
NEL109-R	GAAATTGCGTGACTCAAATTCC
MON87460-F	CACGTTGAAGGAAAATGGATTG	MON87460	82
MON87460-R	TCGCGATCCTCCTCAAAGAC

PCR 반응조건

매회 50 ng의 genomic DNA를 사용하여 한 시료당 최종 부피가 30 ?L가 되도록 2X EF-Taq PCR Pre-Mix (Solgent, Daejeon, Korea)와 혼합하여 PCR 실험을 수행하였다(Proplex PCR system, Applied Biosystems, Waltham, USA). PCR 반응 조건은 95°C에서 5분간 수행 후, 다음 단계에서 95°C 15초, 60°C 20초간 40 cycle을 반응시킨 뒤 4°C에서 PCR 산물을 보관하였다. PCR 산물은 2.5% agarose gel 상에서 100 V로 전기영동 하여 확인하였다.

PCR 산물의 염기서열 분석

7개 LM 작물의 내재유전자와 도입유전자에 특이적인 primer를 이용하여 얻은 PCR 산물은 PCR Purification system으로 정제하였다(Biofact, Daejeon, Korea). 그 후에, T-blunt PCR Cloning system (Solgent, Daejeon, Korea)을 이용하여 cloning 한 후에 염기서열을 분석하였다. 최종적으로 Bioedit program을 이용하여 도입 유전자와 주변 염기서열을 비교 분석하였다.

7개 LM 표준시료 확보 및 DNA 정제

2014년 2월까지 국내에 승인된 LMO 이벤트 현황은 한국 바이오안전성정보센터(Korea Biosafety Clearing House, KBCH)로부터 수집되었고, 미생물, 분말로 수입되는 감자, 알팔파, 사탕무 및 Stack 수입품을 제외한 국내 자연환경 유출 가능성이 큰 단일 품목 7개의 LMO를 선별하였다(Table 1). 7개 LM 작물과 비변형 콩, 면화 및 옥수수 Non-LM 표준시료로부터 genomic DNA를 정제하고 Nano-drop을 이용하여 DNA 정확한 농도를 측정하였고 1.0% agarose gel을 사용하여 전기영동을 통해 DNA band를 확인한 결과, Non-LM과 LM 표준시료의 DNA가 손상되지 않은 상태로 순수 분리되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 분리된 genomic DNA는 멸균 수로 희석하여 매회 50 ng의 genomic DNA를 도입유전자 검출을 위한 증폭 실험에 사용되었다. 표준 DNA 시료의 경우 10 ㎍으로 제공되어, 분말 시료와 동일하게 농도를 희석해 50 ng의 시료를 유전자 증폭 실험을 위해 사용하였다.

Figure 1.

Agarose gel electrophoresis of genomic DNA isolated from Non-LM and LM. (A) Genomic DNA of Non-LM were displayed by 1% agarose gel electrophoresis (Lane M: 1Kb DNA Ladder, Lane 1: Maize, Lane 2: Cotton, Lane 3: Soybean). (B) Genomic DNA of seven LM events were displayed by 1% agarose gel electrophoresis (Lane M: 1Kb DNA Ladder, Lane 1: LM soybean CV127, Lane 2: LM soybean MON87701, Lane 3: LM soybean MON87705, Lane 4: LM soybean FG72, Lane 5: LM Cotton 281/3006, Lane 6: LM Cotton GHB119, Lane 7: LM Maize MON87460)

Primer 특이성 확인 및 도입유전자 검출기법 확립

KBCH와 JRC로부터 수집된 7개 LM 작물별 특성, 도입 유전자 특성, 검출을 위해 필요한 primer의 서열, 최적 검출을 위한 DNA 주형 농도와 연쇄 중합 효소 반응 조건 등에 관한 정보와 문헌 자료를 바탕으로 각 LM 작물과 형태학적 유사한 근연종과의 식별을 위한 내재유전자 및 이벤트 특이적 목적유전자를 검출할 수 있는 primer를 합성하였다(Table 2). PCR 실험을 통해 7개 LM 이벤트에서 제작한 내재유전자(Lectin1, AdhC와 Adh1) 특이적인 primer가 작용하여 PCR 산물을 확인할 수 있었으며(Fig. 2), 이벤트 특이적 primer가 7개 LM 이벤트에서 잘 작용하는 것을 검증하였다(Fig. 3). 따라서 검증된 내재 primer와 이벤트 특이적 primer를 이용하여 7개 LM 표준시료와 Non-LM 표준시료에서 도입유전자 검출기법을 확립하기 위한 실험을 수행하였다(Savini et al. 2011; Savini et al. 2012a; Charles et al. 2011; Savini et al. 2012b; Mazzara et al. 2006; Mazzara et al. 2012; Savini et al. 2012c).

Figure 2.

Sensitivity analysis for endogenous genes in seven LM crops. Endogenous genes (soybean, Lectin1; cotton, Alcohol DehydrogenaseC; maize, Alcohol Dehydrogenase1) of seven LM events were detected by 2.5% agarose gel electrophoresis (Lane M: 1Kb DNA Ladder, Lane 1: LM soybean CV127, Lane 2: LM soybean MON87701, Lane 3: LM soybean MON87705, Lane 4: LM soybean FG72, Lane 5: LM Cotton 281/3006, Lane 6: LM Cotton GHB119, Lane 7: LM Maize MON87460)

Figure 3.

Sensitivity analysis for event-specific genes in seven LM crops. Event-specific PCR products of seven LM events were detected by 2.5% agarose gel electrophoresis (Lane M: 100 bp DNA Ladder, Lane 1: LM soybean CV127, Lane 2: LM soybean MON87701, Lane 3: LM soybean MON87705, Lane 4: LM soybean FG72, Lane 5: LM Cotton 281/3006, Lane 6: LM Cotton GHB119, Lane 7: LM Maize MON87460)

콩은 제초제 저항성 특성을 목적으로 개발된 CV127 (Csr1-2 유전자 삽입), FG72 (2mEPSPS와 hppdPfW336 유전자 삽입) 와 MON87701 (Cry1Ac와 CP4 EPSPS 유전자 삽입) 및 고올레산 생산유전자인 Fad2-1A, Fatb1-A이 삽입된 MON87705 등 4개 LM 이벤트를 대상으로 검출기법을 확립하고자 하였다. 그 결과, 모든 Non-LM 표준시료와 LM 표준시료에서 내재유전자가 증폭되어 대상 작물인 콩을 확인하였고, 각 이벤트별 특이 primer는 LM 표준시료에서만 특이적으로 작용하여 4개 LM 콩 이벤트의 도입유전자 검출기법이 잘 확립되었다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 마찬가지로 해충 및 제초제 저항성 특성을 목적으로 개발된 281/3006 (Cry1Ac, Cry1F, PAT 유전자 삽입)과 GHB119 (Cry2Ae, PAT 유전자 삽입) 등 2개의 LM 면화와 가뭄 저항성 특성을 목적으로 개발된 MON87460 (CspB 유전자 삽입) LM 옥수수를 대상으로 PCR 실험을 수행하였다. Fig. 5와 Fig. 6에서 보는 것과 같이 유전자변형 면화와 옥수수에 대해서만 특이적인 PCR 산물이 확인되어 281/3006, GHB119와 MON87460 이벤트의 도입유전자 특이적 검출기법 또한 잘 확립되었다는 것을 각각 확인할 수 있었다.

Figure 4.

Establishment of PCR amplification for LM Soybeans. PCR analysis were performed by using the endogenous gene Lectin 1 and event-specific primers. PCR products of CV127 (A), MON87701 (B), MON87705 (C) and FG72 (D) were electrophoresed on a 2.5% agarose gel

Figure 5.

Establishment of PCR amplification for LM Cottons. PCR analysis were performed by using the endogenous gene Alcohol DehydrogenaseC (AdhC) and event-specific primers. PCR products of 281/3006 (A) and GHB119 (B) were electrophoresed on a 2.5% agarose gel

Figure 6.

Establishment of PCR amplification for LM Maize MON87460. PCR analysis were performed by using the endogenous gene Alcohol Dehydrogenase1 (Adh1) and event-specific primers. PCR products were electrophoresed on a 2.5% agarose gel

도입유전자의 특성 및 주변 염기서열의 유전 정보 획득

CERA 및 GMO Detection Method Database (GMDD)로부터 7개 LM 작물의 개발 목적, 도입유전자의 특성, 이벤트 특이적 primer의 위치와 정보 및 중합반응 조건 및 반응 횟수, 생성물의 크기에 관한 내용을 수집하였다. 또한, BIOSAFETY SCANNER Website로부터 제공된 정보를 통해 각 이벤트별 도입유전자의 특성과 발현을 위해 사용된 프로모터와 종결인자의 종류, 분자생물학적 특성 및 주변 염기서열의 유전 정보를 파악할 수 있었다. 따라서 도입유전자의 삽입된 위치 정보와 검출기법의 정확성을 확인하기 위하여 PCR 산물을 이용한 염기서열 분석 및 alignment를 실시한 결과, Table 3에서 보듯이 7개 이벤트 모두 도입유전자의 오른쪽 또는 왼쪽 경계 염기서열과 LM 작물 유전자가 상보적으로 설계되었으며 기존에 수집된 LMO의 유전정보와 일치함을 확인하였다(Fig. 7). 이들 정보는 7개 이벤트 특이적 도입유전자 검출을 위한 PCR 반응으로부터 생성된 최종 생성물의 염기서열을 분석하는 데 활용하였고 Table 3에 정리하였다(Table 3). 이는 각각의 이벤트를 특이적으로 검출할 수 있도록 구성되어 있음을 나타내주는 결과이다.

Table 3 . Sequencing result of seven LM events.

Kinds of crop	Events	Sequence (5’-3’)
Soybean	CV127	AACAGAAGTTTCCGTTGAGCTTTAAGACGTTTGGGGAAGCTGTCCCATGCCCATCAAAGAAGACAGTACACGATCCGAGCTACGAATG
	MON88701	CGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTTGACACACACACTAAGCGTGCCTGGGGCATGCTAAGCATGTATCTTCATATCACCA
	MON88705	TTCCCGGACATGAAGCCATTTACAATTGAAGAGACTCAGGGTGTTGTTATCACTGCGGTTTGGCCTTTGGGCCAAGGCACCGTTGT
	FG72	AGATTTGATCGGGCTGCAGGAATTAATGTGGTTCATCCGTCTTTTTGTTAATGCGGTCATCAATACGTGC
Cotton	281/3006	CTCATTGCTGATCCATGTAGATTTCCCTTACTTGTCTCCCTCTAATCTGACTTTATTAACCCAAAGCAATTGCTTATTTGTTCCCCACGCCCACAAAGCCCAGCATTGTCC
	GHB119	CCAGTACTAAAATCCAGATCATGCATGGACCTGCAGGTAGACGGCCGAGTACTGTTTTATTTTTAACAGGAATTTGAGTCACGCAATTTC
Maize	MON87460	CACGTTGAAGGAAAATGGATTGGAGGGAGTATGTAGATAAATTTTCAAAGCGTTAGACGGCTGTCTTTGAGGAGGATCGCGA

Figure 7.

Schematic diagram of the genetic elements of event-specific transformants in 7 LM crops. Location and direction of primers are indicated by F and R. All primer pairs were designed with nucleotide sequences of the DNA flanking region and the inserted DNA cassette. (LB, left border; RB, right border; , promoter; , encoding gene; , 3’ terminator)