J Plant Biotechnol 2017; 44(3): 220-228
Published online September 30, 2017
https://doi.org/10.5010/JPB.2017.44.3.220
© The Korean Society of Plant Biotechnology
김우남
제주대학교 생명자원과학대학,
제주대학교 아열대원예산업연구소,
동국대학교 과학기술대학
Correspondence to : e-mail: hyoyeon@jejunu.ac.kr
e-mail: yongikk@jejunu.ac.kr
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Many crops including cereals, tuber crops, feeds, and turf grasses are often damaged by various environmental stresses such as drought, salt, cold, and high temperature, causing the reduction of their productivity. Plants are sessile and cannot escape from environmental stresses. Thus, plants evolve in the direction of overcoming the environmental stresses. Some plant genes such as ARF, ABI3, NAC, HSF, and WRKY are known to respond to environmental stresses as they transcriptionally regulate the stress response pathways. For example, the OsWRKY76 gene contributes to the enhanced resistance to low temperatures and pathogenic infections. The AtWRKY28 also plays a role in environmental stresses. Zoysiagrass (Zoysia japonica Steud.) is popularly grown for gardens and golf courses. However, the function of the WRKY gene, another environmental stress-related gene, is not known in zoysiagrass. In this study, the ZjWRKY3 and ZjWRKY7 genes with one shared WRKY domain have been isolated in zoysiagrass. The expression of these genes increased in response to low temperature, drought, and salt stresses. Furthermore, the infection of the brown patch-causing Rhozoctonia solani induced the expression of ZjWRKY3 and ZjWRKY7. The corresponding proteins bind to the W-box of the Zjchi promoter, possibly regulating their transcriptions. The researchers suggest that the ZjWRKY3 and ZjWRKY7 genes transcriptionally regulate abiotic and biotic stress related downstream genes
Keywords Stress, Biotic stress, WRKY, Transcription factor, Zoysiagrass
식물은 가뭄, 저온, 고온 같은 다양한 환경 스트레스에 영향을 받는다(Smirnoff et al. 1988). 이로 인하여 생장지연, 종자생산량 감소, 잎의 노화 등이 대표적으로 관찰되며, 작물의 상품가치를 떨어뜨리고 작물의 생산량을 감소시키는 주요 원인이 된다. 특히 잔디와 같은 조경 식물은 공원, 스포츠 공원, 골프장 등에 식재 되어 일반작물보다 지속적으로 더 많은 환경스트레스에 노출되는 경우가 많다. 또한 잔디에 발생하는 병으로 인해서 시각적 효과감소, 골프장에서는 매출감소로 이어진다. 잔디에 발생하는 병은 갈색퍼짐병(large patch), 동전마름병(dollar spot), 피시움마름병(Pythium blight), 갈색마름병(brown patch), 탄저병(anthracnose), 황색엽부병(yellow patch)등 약 10여종이 알려져 있으며, 들잔디의 경우에는
들잔디(
WRKY는 다양한 식물에 보존되어 있으며 건조, 저온 등 다양한 환경스트레스에 관여하고 있다(Chen et al. 2012; Eulgem et al. 2000). 최근 보고된 논문에서 들잔디의
식물들이 환경스트레스에 노출되면 스트레스를 인지함과 동시에 세포 내에서 신호전달에 변화가 생긴다. 외부 환경으로 받은 신호전달에 따라 환경스트레스에 반응하는 많은 유전자들이 전사 수준에서 조절되고 이 유전자들의 산물들이 스트레스에 대한 식물의 저항성을 높여준다(Shnozaki et al. 2000). 식물이 환경스트레스에 저항하기 위해서는 신호전달 유전자, 효소 유전자, 전자조절 유전자 등을 포함한 다양한 종류의 유전자가 필요하다. 이 중에서 외부 환경의 신호를 전달하는 신호전달 유전자가 환경에 반응하는 첫 단계로 알려져 있으며, 환경스트레스에 반응하는 대표적인 전사인자로는 DREB/CBFs, AREB/ABFs, NACs, NAMs, WRKY 등이 알려져 있다. 그 중에서 WRKY family 는 식물 특이적 전사인자로서, N 말단 지역에 보존된 WRKYGQK서열 과 C 말단 지역에 zinc finger-like motif를 가진다. WRKY 단백질은 domain의 구조에 따라 두 개의 WRKY domain을 포함하는 group I, 하나의 domain을 포함하는 group II 와 III로 구분 되며, group II 와 III는 C 말단에 존재하는 zinc finger motif의 종류로 구분된다. WRKY 단백질은 스트레스 반응 유전자의 프로모터에 존재하는
본 연구에서 유전자 클로닝을 위하여 난지형 잔디인 들잔디 (
기내 성장된 들잔디 seedling은 4°C에 24시간 처리한 후
Table 1 A set of primers for
Set | PCR types | Genes | Oligo sequences(5` → 3`) |
---|---|---|---|
1 | Degenerate PCR | Forward AAT GGM GGA AGT AYG GKC AGA | |
Reverse GWG ACG AGY GCC GCC TTG AA | |||
2 | Forward AAT GGM GGA AGT AYG GKC AGA | ||
Reverse GWG ACG AGY GCC GCC TTG AA | |||
3 | cDNA synthesis for3`-RACE | CTG TGA ATG CTG CGA CTA CGA TXX XXX(T)18 | |
4 | 3`-RACE | Forward AAG AAT CGG CAA GTG GCA AC | |
Reverse CTG TGA ATG CTG CGA CTA CGA TXXXX(T) | |||
5 | Forward GTA CGA GGG CGA GCA TAA C | ||
Reverse CTG TGA ATG CTG CGA CTA CGA TXXXX(T) | |||
6 | cDNA synthesis for 5`RACE | ⓟ*GAG GAC AAC ACC A | |
7 | ⓟ*GAG TGG CTA CTG TCA | ||
8 | 5`-RACE | Forward TGC AAC ACA AGC CTC TTA CC | |
Reverse GAG AAG GCT GTG CCA TCT TA | |||
9 | Forward AAG AAT CGG CAA GTG GCA AC | ||
Reverse GAG TAG GTA TCT CTG CAC TC | |||
10 | Forward CTT AGC CTC GTG GTG AAA GAC | ||
Reverse GGT TTG TAC TCC TCC CGG ATA | |||
11 | Forward GAA GTA CGG GCA GAA GGT GA | ||
Reverse GAC GTG CAC TCC ATC TGG T | |||
12 | Full-lengh | Forward CCC GGG TTA CAT CTG AGG ACC A | |
Reverse TCT AGA ATG GCC GGC ACA AG | |||
13 | Forward GCC ATG GAT CCG TGG ATC GGC C | ||
Reverse CTA CTG TTG CGT CGG CGA GAT AA | |||
14 | Real time PCR | Forward GGA TCC TGC ATG GCC GGC ACA | |
Reverse GAG CTC TTA CAT CTG AGG ACC | |||
15 | Forward GGA TCC ATG GAT CCG TGG ATC | ||
Reverse CGA CGC AAC AGT AGC CCG GG |
*phosphorylation
들잔디로부터
Table 2 A List of PCR conditions for zoysiagrass
Conditions | Reaction mixture | Genes | Initial denaturation | Denaturation | Annealing | Extension | Final extension | Cycle | |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
1 | Degenerate PCR | cDNA 30 ng, 10 × Ex Taq buffer 2 ul, dNTP mixture of each 2.5 mM 2 ul, 1 unit Ex taq DNA polymerase (Takara), 50 pmol each primer set 0.4 ul | 94°C 5 min | 94°C 30 sec | 55°C 30 sec | 72°C 30 sec | 72°C 10 min | 30 | |
2 | 3`-RACE | cDNA 50 ng, 10 × Ex Taq buffer 2 ul, dNTP mixture of each 2.5 mM 2 ul, 0.5 unit Ex taq DNA polymerase (Takara), 10 pmol each primer set 0.5 ul | 94°C 5 min | 94°C 30 sec | 60°C 30 sec | 72°C 30 sec | 72°C 10 min | 30 | |
3 | 5`-RACE | cDNA 30 ng, 10 × Ex Taq buffer 5 ul, dNTP mixture of each 2.5 mM 8 ul, 5 unit Ex taq DNA polymerase (Takara), 20 pmol each primer set 0.5 ul | 94°C 3 min | 94°C 30 sec | 58°C 30 sec | 72°C 30 sec | 72°C 10 min | 30 | |
4 | Nested PCR | PCR product 30 ng, 10 × Ex Taq buffer 5 ul, dNTP mixture of each 2.5 mM 8 ul, 5 unit Ex taq DNA polymerase (Takara), 20 pmol each primer set 0.5 ul | 94°C 3 min | 94°C 30 sec | 58°C 30 sec | 72°C 30 sec | 72°C 10 min | 30 | |
5 | Full-length PCR | cDNA 30 ng, 10 × Ex Taq buffer 3 ul, dNTP mixture of each 2.5 mM 3 ul, 1 unit Ex taq DNA polymerase (Takara), 10 pmol each primer set 0.4 ul | 94°C 3 min | 94°C 30 sec | 65°C 30 sec | 72°C 30 sec | 72°C 10 min | 30 | |
6 | Real time PCR | cDNA 30 ng, Sybergreen supermix 10ul, 10 pmol each primer set 0.5 ul, | 95°C 30 sec | 95°C 5sec | 60°C 30 sec | 40 | |||
증폭된 단편 유전자의 sequence에 기반하여, 5’`/3’`- Rapid amplification of cDNA ends (RACE) 는 Full RACE Core Set (Takara) 를 이용하여 수행되었다(Table 1, primer set 3 ~ 11; Table 2, condition 2 ~ 4). 마지막으로, 5’`/3’`-RACE sequence에 기반하여 두 개의 full-length WRKY 유전자들은 cloning되었다(Table 1, primer set 12, 13; Table 2, condition 5). 증폭된 모든 products는 pGEM-T easy vector (Promega) 를 이용하여 sequencing 하였다.
Phylogenetic tree 분석에는 MEGA 6 program을 이용하였다. NCBI GenBank database를 이용하여 이미 보고된 다른 WRKY의 아미노산 서열을 수집하였으며, 들잔디로부터 분리된 두 개의
들잔디로부터 분리된 두 개의
ZjWRKY가 W-box와의 결합 유무를 확인하기 위하여 Yeast one-hybrid assay (Matchmaker® Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System, Clontech)를 수행 하였다. Zoysiagrass Chitinases (
WRKY family유전자를 클로닝하기 위하여 NCBI를 통하여 기존에 보고된 환경스트레스에 반응하는 다른 작물의 WRKY family 유전자들의 염기서열을 수집하였다. 보존된 WRKY domain 지역을 이용하여 degenerate PCR을 수행 하였고, 그 후 3’`/5’` RACE 를 수행하였다. 3’`/5’ RACE 결과를 통하여 각 유전자의 full-length 염기서열을 예상할 수 있었고, 이 염기서열을 바탕으로 full-length WRKY유전자를 PCR한 결과 첫 번째 단편은 약 1.7 kbp, 두 번째 단편은 약 1 kbp에서 밴드가 형성되었다(Fig. 1A). full-length
Cloning of
Alignment of the cloned
기존에 보고된 기능이 알려진 다른 작물들의
Phylogenetic analysis of ZjWRKY in context with other related WRKY proteins. The bootstrapped tree was constructed using ClustalX and MEGA 6 software. Red box indicates the ZjWRKY3 and ZjWRKY7
ZjWRKY3과 ZjWRKY7은 하나의 domain을 포함하는 비교적 가까운 subfamily에 속하지만 아미노산 서열을 비교해본 결과 상동성이 20%에 불과하다. WRKY같은 subfamily유전자는 식물의 진화 과정에서 돌연변이에 의해 변화가 생기고, 이러한 변화로 인해 구조나 기능이 달라 질 수 있고, 이러한 차이 때문에 유전자 발현과정에서 변화가 생길 것으로 예상된다(Eulgem T et al. 2007).
WRKY는 외부 환경의 신호를 전달하는 전사인자로 보고되어 있다(Eulgem T et al. 2000). 들잔디에서 분리한
Expression profiles of
들잔디에서 주요한 병원균의 하나인 갈색퍼짐병(large patch)의 병원균(
Expression profiles of
식물 WRKY는 수많은 방어관련 유전자의 프로모터에서 TGAC core sequence을 포함하는 다양한 W-box에 대해 높은 결합 친화도를 갖는다(Yu et al. 2001). 앞서 수행한 발현분석 결과에서
Analysis of the W-box binding activity of ZjWRKY using a yeast one-hybrid system. (A) Schematic diagrams. (B) Positive control. (C) ZjWRKY3 bind to W-box (P1, P2). (D) ZjWRKY7 bind to W-box(P1, P2). (E) P1, promoter region 1. P2, promoter region 2
ZjWRKY3, ZjWRKY7은 들잔디의 병원균인
식용작물, 사료, 잔디를 포함하는 모든 작물은 건조, 염, 저온, 고온 등의 여러 가지 환경스트레스의 영향을 빈번히 받기 때문에 작물의 생산성이 떨어지게 된다. 식물은 환경스트레스 상황에서 스스로 벗어날 수 없다. 따라서 식물은 환경 스트레스를 극복하는 방향으로 진화하였다. ARF, ABI3, NAC, HSF, WRKY 같은 환경 스트레스에 반응하는 유전자들이 식물에서 보고되었다. 이 유전자들은 환경스트레스에 반응하는 전사인자로, 식물의 스트레스반응 경로에 연관되어 있다.
이 논문은 농촌진흥청 차세대 바이오그린21사업(PJ011860)과 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업임(NRF2011-0014959, 2016R1A6A1A03012862).
J Plant Biotechnol 2017; 44(3): 220-228
Published online September 30, 2017 https://doi.org/10.5010/JPB.2017.44.3.220
Copyright © The Korean Society of Plant Biotechnology.
김우남
제주대학교 생명자원과학대학,
제주대학교 아열대원예산업연구소,
동국대학교 과학기술대학
Woo-Nam Kim
Faculty of Biotechnology, Jeju National University, Jeju 63243, Korea,
Subtropical Horticulture Research Institute, Jeju National University, Jeju 63243, Korea,
Department of Medical Bioscience, Dongguk University, Gyeongju 38866, Korea
Correspondence to: e-mail: hyoyeon@jejunu.ac.kr
e-mail: yongikk@jejunu.ac.kr
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Many crops including cereals, tuber crops, feeds, and turf grasses are often damaged by various environmental stresses such as drought, salt, cold, and high temperature, causing the reduction of their productivity. Plants are sessile and cannot escape from environmental stresses. Thus, plants evolve in the direction of overcoming the environmental stresses. Some plant genes such as ARF, ABI3, NAC, HSF, and WRKY are known to respond to environmental stresses as they transcriptionally regulate the stress response pathways. For example, the OsWRKY76 gene contributes to the enhanced resistance to low temperatures and pathogenic infections. The AtWRKY28 also plays a role in environmental stresses. Zoysiagrass (Zoysia japonica Steud.) is popularly grown for gardens and golf courses. However, the function of the WRKY gene, another environmental stress-related gene, is not known in zoysiagrass. In this study, the ZjWRKY3 and ZjWRKY7 genes with one shared WRKY domain have been isolated in zoysiagrass. The expression of these genes increased in response to low temperature, drought, and salt stresses. Furthermore, the infection of the brown patch-causing Rhozoctonia solani induced the expression of ZjWRKY3 and ZjWRKY7. The corresponding proteins bind to the W-box of the Zjchi promoter, possibly regulating their transcriptions. The researchers suggest that the ZjWRKY3 and ZjWRKY7 genes transcriptionally regulate abiotic and biotic stress related downstream genes
Keywords: Stress, Biotic stress, WRKY, Transcription factor, Zoysiagrass
식물은 가뭄, 저온, 고온 같은 다양한 환경 스트레스에 영향을 받는다(Smirnoff et al. 1988). 이로 인하여 생장지연, 종자생산량 감소, 잎의 노화 등이 대표적으로 관찰되며, 작물의 상품가치를 떨어뜨리고 작물의 생산량을 감소시키는 주요 원인이 된다. 특히 잔디와 같은 조경 식물은 공원, 스포츠 공원, 골프장 등에 식재 되어 일반작물보다 지속적으로 더 많은 환경스트레스에 노출되는 경우가 많다. 또한 잔디에 발생하는 병으로 인해서 시각적 효과감소, 골프장에서는 매출감소로 이어진다. 잔디에 발생하는 병은 갈색퍼짐병(large patch), 동전마름병(dollar spot), 피시움마름병(Pythium blight), 갈색마름병(brown patch), 탄저병(anthracnose), 황색엽부병(yellow patch)등 약 10여종이 알려져 있으며, 들잔디의 경우에는
들잔디(
WRKY는 다양한 식물에 보존되어 있으며 건조, 저온 등 다양한 환경스트레스에 관여하고 있다(Chen et al. 2012; Eulgem et al. 2000). 최근 보고된 논문에서 들잔디의
식물들이 환경스트레스에 노출되면 스트레스를 인지함과 동시에 세포 내에서 신호전달에 변화가 생긴다. 외부 환경으로 받은 신호전달에 따라 환경스트레스에 반응하는 많은 유전자들이 전사 수준에서 조절되고 이 유전자들의 산물들이 스트레스에 대한 식물의 저항성을 높여준다(Shnozaki et al. 2000). 식물이 환경스트레스에 저항하기 위해서는 신호전달 유전자, 효소 유전자, 전자조절 유전자 등을 포함한 다양한 종류의 유전자가 필요하다. 이 중에서 외부 환경의 신호를 전달하는 신호전달 유전자가 환경에 반응하는 첫 단계로 알려져 있으며, 환경스트레스에 반응하는 대표적인 전사인자로는 DREB/CBFs, AREB/ABFs, NACs, NAMs, WRKY 등이 알려져 있다. 그 중에서 WRKY family 는 식물 특이적 전사인자로서, N 말단 지역에 보존된 WRKYGQK서열 과 C 말단 지역에 zinc finger-like motif를 가진다. WRKY 단백질은 domain의 구조에 따라 두 개의 WRKY domain을 포함하는 group I, 하나의 domain을 포함하는 group II 와 III로 구분 되며, group II 와 III는 C 말단에 존재하는 zinc finger motif의 종류로 구분된다. WRKY 단백질은 스트레스 반응 유전자의 프로모터에 존재하는
본 연구에서 유전자 클로닝을 위하여 난지형 잔디인 들잔디 (
기내 성장된 들잔디 seedling은 4°C에 24시간 처리한 후
Table 1 . A set of primers for
Set | PCR types | Genes | Oligo sequences(5` → 3`) |
---|---|---|---|
1 | Degenerate PCR | Forward AAT GGM GGA AGT AYG GKC AGA | |
Reverse GWG ACG AGY GCC GCC TTG AA | |||
2 | Forward AAT GGM GGA AGT AYG GKC AGA | ||
Reverse GWG ACG AGY GCC GCC TTG AA | |||
3 | cDNA synthesis for3`-RACE | CTG TGA ATG CTG CGA CTA CGA TXX XXX(T)18 | |
4 | 3`-RACE | Forward AAG AAT CGG CAA GTG GCA AC | |
Reverse CTG TGA ATG CTG CGA CTA CGA TXXXX(T) | |||
5 | Forward GTA CGA GGG CGA GCA TAA C | ||
Reverse CTG TGA ATG CTG CGA CTA CGA TXXXX(T) | |||
6 | cDNA synthesis for 5`RACE | ⓟ*GAG GAC AAC ACC A | |
7 | ⓟ*GAG TGG CTA CTG TCA | ||
8 | 5`-RACE | Forward TGC AAC ACA AGC CTC TTA CC | |
Reverse GAG AAG GCT GTG CCA TCT TA | |||
9 | Forward AAG AAT CGG CAA GTG GCA AC | ||
Reverse GAG TAG GTA TCT CTG CAC TC | |||
10 | Forward CTT AGC CTC GTG GTG AAA GAC | ||
Reverse GGT TTG TAC TCC TCC CGG ATA | |||
11 | Forward GAA GTA CGG GCA GAA GGT GA | ||
Reverse GAC GTG CAC TCC ATC TGG T | |||
12 | Full-lengh | Forward CCC GGG TTA CAT CTG AGG ACC A | |
Reverse TCT AGA ATG GCC GGC ACA AG | |||
13 | Forward GCC ATG GAT CCG TGG ATC GGC C | ||
Reverse CTA CTG TTG CGT CGG CGA GAT AA | |||
14 | Real time PCR | Forward GGA TCC TGC ATG GCC GGC ACA | |
Reverse GAG CTC TTA CAT CTG AGG ACC | |||
15 | Forward GGA TCC ATG GAT CCG TGG ATC | ||
Reverse CGA CGC AAC AGT AGC CCG GG |
*phosphorylation
들잔디로부터
Table 2 . A List of PCR conditions for zoysiagrass
Conditions | Reaction mixture | Genes | Initial denaturation | Denaturation | Annealing | Extension | Final extension | Cycle | |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
1 | Degenerate PCR | cDNA 30 ng, 10 × Ex Taq buffer 2 ul, dNTP mixture of each 2.5 mM 2 ul, 1 unit Ex taq DNA polymerase (Takara), 50 pmol each primer set 0.4 ul | 94°C 5 min | 94°C 30 sec | 55°C 30 sec | 72°C 30 sec | 72°C 10 min | 30 | |
2 | 3`-RACE | cDNA 50 ng, 10 × Ex Taq buffer 2 ul, dNTP mixture of each 2.5 mM 2 ul, 0.5 unit Ex taq DNA polymerase (Takara), 10 pmol each primer set 0.5 ul | 94°C 5 min | 94°C 30 sec | 60°C 30 sec | 72°C 30 sec | 72°C 10 min | 30 | |
3 | 5`-RACE | cDNA 30 ng, 10 × Ex Taq buffer 5 ul, dNTP mixture of each 2.5 mM 8 ul, 5 unit Ex taq DNA polymerase (Takara), 20 pmol each primer set 0.5 ul | 94°C 3 min | 94°C 30 sec | 58°C 30 sec | 72°C 30 sec | 72°C 10 min | 30 | |
4 | Nested PCR | PCR product 30 ng, 10 × Ex Taq buffer 5 ul, dNTP mixture of each 2.5 mM 8 ul, 5 unit Ex taq DNA polymerase (Takara), 20 pmol each primer set 0.5 ul | 94°C 3 min | 94°C 30 sec | 58°C 30 sec | 72°C 30 sec | 72°C 10 min | 30 | |
5 | Full-length PCR | cDNA 30 ng, 10 × Ex Taq buffer 3 ul, dNTP mixture of each 2.5 mM 3 ul, 1 unit Ex taq DNA polymerase (Takara), 10 pmol each primer set 0.4 ul | 94°C 3 min | 94°C 30 sec | 65°C 30 sec | 72°C 30 sec | 72°C 10 min | 30 | |
6 | Real time PCR | cDNA 30 ng, Sybergreen supermix 10ul, 10 pmol each primer set 0.5 ul, | 95°C 30 sec | 95°C 5sec | 60°C 30 sec | 40 | |||
증폭된 단편 유전자의 sequence에 기반하여, 5’`/3’`- Rapid amplification of cDNA ends (RACE) 는 Full RACE Core Set (Takara) 를 이용하여 수행되었다(Table 1, primer set 3 ~ 11; Table 2, condition 2 ~ 4). 마지막으로, 5’`/3’`-RACE sequence에 기반하여 두 개의 full-length WRKY 유전자들은 cloning되었다(Table 1, primer set 12, 13; Table 2, condition 5). 증폭된 모든 products는 pGEM-T easy vector (Promega) 를 이용하여 sequencing 하였다.
Phylogenetic tree 분석에는 MEGA 6 program을 이용하였다. NCBI GenBank database를 이용하여 이미 보고된 다른 WRKY의 아미노산 서열을 수집하였으며, 들잔디로부터 분리된 두 개의
들잔디로부터 분리된 두 개의
ZjWRKY가 W-box와의 결합 유무를 확인하기 위하여 Yeast one-hybrid assay (Matchmaker® Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System, Clontech)를 수행 하였다. Zoysiagrass Chitinases (
WRKY family유전자를 클로닝하기 위하여 NCBI를 통하여 기존에 보고된 환경스트레스에 반응하는 다른 작물의 WRKY family 유전자들의 염기서열을 수집하였다. 보존된 WRKY domain 지역을 이용하여 degenerate PCR을 수행 하였고, 그 후 3’`/5’` RACE 를 수행하였다. 3’`/5’ RACE 결과를 통하여 각 유전자의 full-length 염기서열을 예상할 수 있었고, 이 염기서열을 바탕으로 full-length WRKY유전자를 PCR한 결과 첫 번째 단편은 약 1.7 kbp, 두 번째 단편은 약 1 kbp에서 밴드가 형성되었다(Fig. 1A). full-length
Cloning of
Alignment of the cloned
기존에 보고된 기능이 알려진 다른 작물들의
Phylogenetic analysis of ZjWRKY in context with other related WRKY proteins. The bootstrapped tree was constructed using ClustalX and MEGA 6 software. Red box indicates the ZjWRKY3 and ZjWRKY7
ZjWRKY3과 ZjWRKY7은 하나의 domain을 포함하는 비교적 가까운 subfamily에 속하지만 아미노산 서열을 비교해본 결과 상동성이 20%에 불과하다. WRKY같은 subfamily유전자는 식물의 진화 과정에서 돌연변이에 의해 변화가 생기고, 이러한 변화로 인해 구조나 기능이 달라 질 수 있고, 이러한 차이 때문에 유전자 발현과정에서 변화가 생길 것으로 예상된다(Eulgem T et al. 2007).
WRKY는 외부 환경의 신호를 전달하는 전사인자로 보고되어 있다(Eulgem T et al. 2000). 들잔디에서 분리한
Expression profiles of
들잔디에서 주요한 병원균의 하나인 갈색퍼짐병(large patch)의 병원균(
Expression profiles of
식물 WRKY는 수많은 방어관련 유전자의 프로모터에서 TGAC core sequence을 포함하는 다양한 W-box에 대해 높은 결합 친화도를 갖는다(Yu et al. 2001). 앞서 수행한 발현분석 결과에서
Analysis of the W-box binding activity of ZjWRKY using a yeast one-hybrid system. (A) Schematic diagrams. (B) Positive control. (C) ZjWRKY3 bind to W-box (P1, P2). (D) ZjWRKY7 bind to W-box(P1, P2). (E) P1, promoter region 1. P2, promoter region 2
ZjWRKY3, ZjWRKY7은 들잔디의 병원균인
식용작물, 사료, 잔디를 포함하는 모든 작물은 건조, 염, 저온, 고온 등의 여러 가지 환경스트레스의 영향을 빈번히 받기 때문에 작물의 생산성이 떨어지게 된다. 식물은 환경스트레스 상황에서 스스로 벗어날 수 없다. 따라서 식물은 환경 스트레스를 극복하는 방향으로 진화하였다. ARF, ABI3, NAC, HSF, WRKY 같은 환경 스트레스에 반응하는 유전자들이 식물에서 보고되었다. 이 유전자들은 환경스트레스에 반응하는 전사인자로, 식물의 스트레스반응 경로에 연관되어 있다.
이 논문은 농촌진흥청 차세대 바이오그린21사업(PJ011860)과 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업임(NRF2011-0014959, 2016R1A6A1A03012862).
Cloning of
Alignment of the cloned
Phylogenetic analysis of ZjWRKY in context with other related WRKY proteins. The bootstrapped tree was constructed using ClustalX and MEGA 6 software. Red box indicates the ZjWRKY3 and ZjWRKY7
Expression profiles of
Expression profiles of
Analysis of the W-box binding activity of ZjWRKY using a yeast one-hybrid system. (A) Schematic diagrams. (B) Positive control. (C) ZjWRKY3 bind to W-box (P1, P2). (D) ZjWRKY7 bind to W-box(P1, P2). (E) P1, promoter region 1. P2, promoter region 2
Table 1 . A set of primers for
Set | PCR types | Genes | Oligo sequences(5` → 3`) |
---|---|---|---|
1 | Degenerate PCR | Forward AAT GGM GGA AGT AYG GKC AGA | |
Reverse GWG ACG AGY GCC GCC TTG AA | |||
2 | Forward AAT GGM GGA AGT AYG GKC AGA | ||
Reverse GWG ACG AGY GCC GCC TTG AA | |||
3 | cDNA synthesis for3`-RACE | CTG TGA ATG CTG CGA CTA CGA TXX XXX(T)18 | |
4 | 3`-RACE | Forward AAG AAT CGG CAA GTG GCA AC | |
Reverse CTG TGA ATG CTG CGA CTA CGA TXXXX(T) | |||
5 | Forward GTA CGA GGG CGA GCA TAA C | ||
Reverse CTG TGA ATG CTG CGA CTA CGA TXXXX(T) | |||
6 | cDNA synthesis for 5`RACE | ⓟ*GAG GAC AAC ACC A | |
7 | ⓟ*GAG TGG CTA CTG TCA | ||
8 | 5`-RACE | Forward TGC AAC ACA AGC CTC TTA CC | |
Reverse GAG AAG GCT GTG CCA TCT TA | |||
9 | Forward AAG AAT CGG CAA GTG GCA AC | ||
Reverse GAG TAG GTA TCT CTG CAC TC | |||
10 | Forward CTT AGC CTC GTG GTG AAA GAC | ||
Reverse GGT TTG TAC TCC TCC CGG ATA | |||
11 | Forward GAA GTA CGG GCA GAA GGT GA | ||
Reverse GAC GTG CAC TCC ATC TGG T | |||
12 | Full-lengh | Forward CCC GGG TTA CAT CTG AGG ACC A | |
Reverse TCT AGA ATG GCC GGC ACA AG | |||
13 | Forward GCC ATG GAT CCG TGG ATC GGC C | ||
Reverse CTA CTG TTG CGT CGG CGA GAT AA | |||
14 | Real time PCR | Forward GGA TCC TGC ATG GCC GGC ACA | |
Reverse GAG CTC TTA CAT CTG AGG ACC | |||
15 | Forward GGA TCC ATG GAT CCG TGG ATC | ||
Reverse CGA CGC AAC AGT AGC CCG GG |
*phosphorylation
Table 2 . A List of PCR conditions for zoysiagrass
Conditions | Reaction mixture | Genes | Initial denaturation | Denaturation | Annealing | Extension | Final extension | Cycle | |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
1 | Degenerate PCR | cDNA 30 ng, 10 × Ex Taq buffer 2 ul, dNTP mixture of each 2.5 mM 2 ul, 1 unit Ex taq DNA polymerase (Takara), 50 pmol each primer set 0.4 ul | 94°C 5 min | 94°C 30 sec | 55°C 30 sec | 72°C 30 sec | 72°C 10 min | 30 | |
2 | 3`-RACE | cDNA 50 ng, 10 × Ex Taq buffer 2 ul, dNTP mixture of each 2.5 mM 2 ul, 0.5 unit Ex taq DNA polymerase (Takara), 10 pmol each primer set 0.5 ul | 94°C 5 min | 94°C 30 sec | 60°C 30 sec | 72°C 30 sec | 72°C 10 min | 30 | |
3 | 5`-RACE | cDNA 30 ng, 10 × Ex Taq buffer 5 ul, dNTP mixture of each 2.5 mM 8 ul, 5 unit Ex taq DNA polymerase (Takara), 20 pmol each primer set 0.5 ul | 94°C 3 min | 94°C 30 sec | 58°C 30 sec | 72°C 30 sec | 72°C 10 min | 30 | |
4 | Nested PCR | PCR product 30 ng, 10 × Ex Taq buffer 5 ul, dNTP mixture of each 2.5 mM 8 ul, 5 unit Ex taq DNA polymerase (Takara), 20 pmol each primer set 0.5 ul | 94°C 3 min | 94°C 30 sec | 58°C 30 sec | 72°C 30 sec | 72°C 10 min | 30 | |
5 | Full-length PCR | cDNA 30 ng, 10 × Ex Taq buffer 3 ul, dNTP mixture of each 2.5 mM 3 ul, 1 unit Ex taq DNA polymerase (Takara), 10 pmol each primer set 0.4 ul | 94°C 3 min | 94°C 30 sec | 65°C 30 sec | 72°C 30 sec | 72°C 10 min | 30 | |
6 | Real time PCR | cDNA 30 ng, Sybergreen supermix 10ul, 10 pmol each primer set 0.5 ul, | 95°C 30 sec | 95°C 5sec | 60°C 30 sec | 40 | |||
Yueyue Yuan・Ji-Hi Son・Mi-Young Park・Hyeon-Jin Sun・Hyo-Yeon Lee・Hong-Gyu Kang
J Plant Biotechnol 2024; 51(1): 1-10Lee Li Fern, Aisamuddin Ardi Zainal Abidin, and Zetty Norhana Balia Yusof
J Plant Biotechnol 2017; 44(4): 462-471Se Hee Kim, Seo Jun Park, Kang Hee Cho, Han Chan Lee, Jung Woo Lee, and In Myung Choi
J Plant Biotechnol 2017; 44(4): 372-378
Journal of
Plant BiotechnologyCloning of
Alignment of the cloned
Phylogenetic analysis of ZjWRKY in context with other related WRKY proteins. The bootstrapped tree was constructed using ClustalX and MEGA 6 software. Red box indicates the ZjWRKY3 and ZjWRKY7
|@|~(^,^)~|@|Expression profiles of
Expression profiles of
Analysis of the W-box binding activity of ZjWRKY using a yeast one-hybrid system. (A) Schematic diagrams. (B) Positive control. (C) ZjWRKY3 bind to W-box (P1, P2). (D) ZjWRKY7 bind to W-box(P1, P2). (E) P1, promoter region 1. P2, promoter region 2