J Plant Biotechnol 2022; 49(1): 82-89
Published online March 31, 2022
https://doi.org/10.5010/JPB.2022.49.1.082
© The Korean Society of Plant Biotechnology
윤아영・김태동・김지아・이나념・정은주・김용욱
국립산림과학원 임목자원연구과
국립산림과학원 산림약용자원연구소
강원대학교 산림과학부
Correspondence to : e-mail: bravekim@korea.kr, ejcheong@kangwon.ac.kr
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
In vitro techniques were developed for propagating Vaccinium oldhamii using shoots with apical buds. Explants having an apical bud were cultured on Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with 1.0, 2.0, and 5.0 mg/L of each zeatin, thidiazuron, 6-benzylaminopurine (BA), and 6-(γ,γ-dimethylallylamino)purine (2-iP) in order to induce multiple shoots. Among the tested treatments, the 2.0 mg/L of 2-iP proved to be most suited for the multiplication and growth of shoots; the multiple shoot induction rate was 100.0%, the average number of shoots was 7.4 per explant, and the average shoot length was 51.7 mm. The in vitro elongated shoots were rooted on half-strength MS medium containing various concentrations of indole-3-butyric acid (IBA) and 1-naphthaleneacetic acid (NAA). However, overall callus overgrowth was observed in all treatments and resulted in necrosis and abnormal shoot growth in root formation. A low concentration (0.5 mg/L) of IBA was appropriate for normal root development and the in vitro rooting rate was 30%. Ex vitro treatments on root formation using various concentrations of IBA with Talc powder and two types of rooting substrates (Flexi-Plugs or Horticultural soil) were examined. The ex vitro rooting rate (80%) and length of roots (32.9 mm) were obtained when the cut ends of the shoots were treated with 1.0 mg/L IBA and cultivated in Horticultural soil for 2 months. These findings suggest that ex vitro rooting is the more effective method for improving root formation in Vaccinium oldhamii than in vitro rooting.
Keywords Vaccinium oldhamii, ex vitro rooting, multiple-shoot induction, plant growth regulator, plant regeneration
정금나무는 국내자생식물로 진달래과(Ericaceae) 산앵도나무속(
우리나라 블루베리 생산량은 2004년 이후 꾸준히 늘고 있는데 2019년에는 약 1만 4,400톤을 생산하였으나(Rural 2020) 현재 국내에 주로 보급된 블루베리 종은 주로 외국에서 도입된 수종이다. 그중 토종 블루베리인 정금나무는 영광군에서 2015년부터 숲가꾸기 사업으로 3000 m2 (400본)를 조성했지만 연간 과실생산량은 500 kg으로 매우 적어 그 수요 또한 미미한 실정이다(Yeong 2017).
정금나무에 대한 연구는 Kim (2012)이 10개 선발집단의 잎과 열매의 형태적 특성 변이에 따른 집단 간 차이를 보고한 바 있으며, 정금나무 열매의 기능성 성분 함량 및 항산화활성 분석에 대한 연구가 이루어져 있다(Kim et al. 2016).
정금나무 실생번식은 가을에 채취한 종자를 이끼에 파종 후 관수하는 방법과 하계에 녹지삽목을 하는 방법이 있다. 하지만 정금나무 종자발아율은 10.0% 이하로 낮고 녹지삽목 또한 삽수 채취시기가 하계에 한정되어 있어 그 효율이 매우 낮다(Kim 2012).
이러한 정금나무의 낮은 번식 효율로 인해 묘목 생산량은 저조한데 그 대안으로 생물공학기법 중 하나인 조직배양기술을 이용한 번식 방법을 개발할 필요가 있다.
따라서 본 연구에서는 기내에서 정금나무의 다신초 유도를 위한 식물생장조절물질의 적정 종류 및 농도, 기내·외 발근을 위한 적정 조건을 구명함으로써 효율적인 식물체 재분화 시스템을 확립하고자 하였다.
본 연구에 사용된 식물재료는 기내에서 종자 발아된 정금나무 소식물체의 정아를 포함한 줄기를 사용하였다. 기내식물체 증식은 염류를 반으로 줄인 1/2MS (Murashige and Skoog 1962)에 0.5 mg/L zeatin, 2% sucrose 및 0.35% gelrite를 첨가한 배지를 사용하였으며, 4주마다 동일 조성의 배지로 계대배양하였고, 계대배양 시에는 잎이 3~4개 포함된 신초를 조제하여 치상하였다. 모든 배양은 광량자속밀도 40 μm m-2 s-1, 광주기 16/8시간, 온도 25 ± 1°C로 유지되는 배양실에서 배양하였다.
기내 배양 중인 정금나무의 줄기에서 정아를 포함하는 줄기를 1 cm 정도 길이로 절단하여 1.0, 2.0 및 5.0 mg/L의 Zeatin, 6-Benzylaminopurine (BA), 6-(γ,γ-Dimethylallylamino)purine (2-iP) 또는 Thidiazuron (TDZ)를 농도별로 각각 첨가한 MS 고체배지(3% sucrose, 0.35% gelrite, pH 5.7)에 치상하였다. 절편은 각 처리구당 10개씩 3반복하여 치상하였고, 배양 8주 후에 다신초 유도율, 신초 유도 수 및 길이를 각각 조사하였다.
기내발근 유도를 위해 정아가 포함된 줄기를 2 cm 길이로 절단하여 1/2MS 배지에 1% sucrose를 첨가하고 0, 0.5, 1.0, 2.0 및 5.0 mg/L의 Indole-3-butyric acid (IBA) 또는 1-Naphthaleneacetic acid (NAA)를 단용처리한 배지에 치상하였다. 절편은 각 처리구당 10개씩 3반복하여 치상하였고, 배양 8주 후에 발근율, 뿌리의 수와 길이를 각각 조사하였다.
기외발근 유도를 위해 먼저 정아를 제거하고 대신 액아 4~6개가 포함된 줄기를 2.5~3 cm 길이로 절단하여 사용하였다. IBA농도는 0, 0.05, 0.1, 0.5, 1 g/L 및 Talc (삼전화학, 일본)를 섞어 사용하였는데 각각 IBA 농도 별 용액 2.0 mL에 Talc 2.0 g을 혼합 후 절단된 줄기 절단 말단부위에 묻혀 피트플러그 혹은 Horticultural substrate (원예범용상토, 팜한농)에 치상하였다. 절편은 각 처리구당 10개씩 3반복하여 치상하였고, 배양 8주 후에 발근율, 뿌리길이 및 줄기길이를 각각 조사하였다. 기외 발근용 삽목 컨테이너 내 공중습도는 90% 이상 유지하였고 광량자속밀도 40 μm m-2 s-1, 광주기 16시간 및 25 ± 1°C 조건에서 배양하였다.
기외발근으로 유도된 뿌리 절편체를 발근 초기부터 약 1주 간격으로 3주 동안 줄기 하단부를 채취하여 2.5% glutaraldehyde와 1.6% paraformaldehyde가 포함된 고정액(pH 6.8)에 넣어 4°C에서 24~48시간 동안 고정시켰다. 그후 ethanol 농도별(30, 50, 70, 80, 90, 95, 100%)로 차례로 탈수처리 후 glycol methaacrylate (Technovit 7100, Kluzer, Germany)에 포매하였으며(Yeung 1999), Autocut microtome (Leica RM 2165, Germany)을 이용하여 3 μm 두께로 박편을 만들어서 슬라이드 글라스에 고정시켰다. 그후 0.1% periodic acid-Schiffs (PAS)를 사용하여 carbohydrates 및 0.05% toluidine blue O (TBO)로 2차 염색 후 광학현미경(Leica, DMR, Germany)으로 관찰하였다.
본 실험 모두 총 3반복으로 수행하였고, 데이터분석은 SPSS를 이용하였으며 각 처리간 유의성 검정은 one-way 및 two-way ANOVA를 실시하였다. 유의성이 있는 경우 Duncan’s multiple range test로 사후분석을 하였고, 통계적 유의성은 P < 0.05로 설정하여 분석하였다.
Table 1은 zeatin, BA, 2-iP 및 TDZ 등 4종류 cytokinin의 농도가 다신초 유도에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 1.0, 2.0, 5.0 mg/L zeatin, 5.0 mg/L TDZ, 그리고 2.0 mg/L 2-iP 첨가구의 모든 절편체에서 신초가 발생한 것으로 나타났으며, 1.0, 2.0 및 5.0 mg/L BA 첨가구에서는 전혀 신초 유도가 이루어지지 않아 zeatin 등 다른 첨가구와는 대조적이었다. 본 실험의 경우 이전의 예비실험의 다신초 유도 시 control에서 전혀 신초 유도가 이루어지지 않았기에 제외시켰다(데이터 없음).
Table 1 Effect of different types and concentrations of cytokinins on multiple shoot induction from explants having an apical bud in
Cytokinin | Treatment (mg/L) | Shoot induction (%) | No. of shoots/explant (mean ± S.D.) | Shoot length (mm) (mean ± S.D.) |
---|---|---|---|---|
Zeatin | 1.0 | 100.0 | 5.8 ± 2.4de* | 34.1 ± 2.4c |
2.0 | 100.0 | 7.5 ± 2.8cde | 31.5 ± 2.9d | |
5.0 | 100.0 | 23.5 ± 10.4a | 4.4 ± 0.4f | |
TDZ | 1.0 | 84.0 | 12.2 ± 6.3b | 5.3 ± 1.4f |
2.0 | 88.0 | 10.2 ± 5.4bc | 5.3 ± 1.1f | |
5.0 | 100.0 | 8.0 ± 5.3cd | 5.0 ± 1.3f | |
BA | 1.0 | 0 | 0 | 0 |
2.0 | 0 | 0 | 0 | |
5.0 | 0 | 0 | 0 | |
2-iP | 1.0 | 88.0 | 5.2 ± 2.9de | 38.9 ± 2.7b |
2.0 | 100.0 | 7.4 ± 3.0cde | 51.7 ± 5.5a | |
5.0 | 92.0 | 4.3 ± 1.6e | 25.5 ± 3.2e |
*Means within the column followed by the same letter are not significantly different, Duncan’s multiple range test, p < 0.05.
TDZ, thidiazuron; BA, 6-benzylaminopurine; 2-iP, 6-(γ,γ-dimethylallylamino)purine.
절편체 당 다신초 유도 수 비교에서 가장 많은 신초가 유도된 첨가구는 5.0 mg/L zeatin으로 평균 23.5개였으며, 호르몬 종류 및 농도간의 유의확률은 0.05 이하이므로, 호르몬 종류 및 농도간에 유의한 상호작용이 있는 것으로 나타났다. 1.0 mg/L zeatin에서 5.8개 및 5.0 mg/L 2-iP에서 4.3개로 두 첨가구에서 가장 적은 신초가 발생하였는데(Table 1) 특히 1.0~5.0 mg/L 2-iP 첨가구의 경우 농도에 관계없이 4.3~7.4개로 나타나 타 사이토키닌 처리구보다 다신초 유도 효율이 낮은 것으로 알 수 있다. Zeatin 첨가구의 경우 1.0에서 5.0 mg/L로 농도가 높아짐에 따라 다신초 유도 수는 5.8에서 23.5개로 증가하는 현상을 보였으나, 반면 TDZ 첨가 시 저농도 1.0에서 5.0 mg/L로 높아짐에 따라 다신초 유도 수는 12.2에서 8.0개로 감소하는 현상을 보였다. 따라서 zeatin은 고농도 첨가가 적합하고 TDZ 경우 저농도가 효과적임을 알 수 있다(Table 1).
줄기배양 9일 후부터 정아에서 엽전개가 시작되었고, 3주 후부터는 zeatin, TDZ 및 2-iP 첨가구에서 대부분 다신초가 유도되었다. Zeatin, 2-iP 및 TDZ 첨가구 경우에는 줄기 하단부에 녹색의 캘러스가 형성되었으나 BA 첨가구에서는 관찰되지 않았다(Fig. 1). 활엽수종 기내배양에서 줄기 하단부에 형성되는 캘러스는 양분 및 식물생장호르몬의 저장 기능의 역할을 하는 것으로 보고되고 있는데(Vieitez et al. 1989), 본 실험의 경우에서도 BA 첨가구를 제외한 다른 모든 첨가구의 줄기 하단부에서 캘러스가 형성되어 다신초 유도 시 캘러스가 함께 형성되는 특징을 가지고 있는 것으로 판단된다.
IBA 및 NAA의 농도에 따른 줄기의 기내발근에 미치는 영향은 Table 2와 같다. 최대 발근율은 2.0 mg/L NAA 첨가구에서 86.7%로 가장 높게 나타났으나, 무첨가구에서는 3.3%로 가장 저조한 발근율을 보였으며, 호르몬종류 및 농도의 유의확률은 0.05 이하이므로 유의한 상호작용이 있는 것으로 나타났다. IBA 첨가구 경우, 0.5에서 5.0 mg/L로 농도가 높아짐에 따라 그 발근율은 30.0에서 60.0%로 증가함을 보였고 NAA 첨가구 경우, 0.5에서 2.0 mg/L까지 86.7%로 점차 증가하였지만, 5.0 mg/L 첨가 시 10.0%로 발근율이 현저히 낮아짐을 보였다(Table 2).
Table 2 Effect of auxins on in vitro rooting of shoots having an apical bud in
Treatment (mg/L) | Root formation (% ± S.D.) | No. of roots/shoot (mean ± S.D.) | Root length (mm) (mean ± S.D.) | |
---|---|---|---|---|
Control | 0 | 3.3 ± 1.3e* | 1.0 ± 0.3d | 23.2 ± 4.3a |
IBA | 0.5 | 30.0 ± 10.0cd | 2.4 ± 2.2cd | 17.6 ± 7.5bc |
1.0 | 30.0 ± 10.0cd | 3.7 ± 3.5bcd | 20.0 ± 6.3b | |
2.0 | 43.3 ± 30.6cd | 8.4 ± 7.7ab | 19.3 ± 5.0b | |
5.0 | 60.0 ± 10.0abc | 10.1 ± 7.1a | 14.3 ± 2.8c | |
NAA | 0.5 | 60.0 ± 26.5abc | 5.2 ± 3.6bc | 12.8 ± 2.6cd |
1.0 | 66.7 ± 20.8ab | 8.2 ± 4.2ab | 10.7 ± 1.8d | |
2.0 | 86.7 ± 15.3a | 7.1 ± 4.0abc | 3.7 ± 1.2e | |
5.0 | 10.0 ± 10.0d | 3.3 ± 2.1cd | 1.7 ± 0.5e |
*Means within the column followed by the same letter are not significantly different, Duncan’s multiple range test, p < 0.05.
TDZ, thidiazuron; BA, 6-benzylaminopurine; 2-iP, 6-(γ,γ-dimethylallylamino)purine.
최대 뿌리수는 5.0 mg/L IBA에서 10.1개로 가장 높았으나 무첨가구에서는 1.0개로 가장 저조한 뿌리수를 보였으며(Table 2), 호르몬종류 및 농도의 유의확률은 0.05 이하이므로 유의한 상호작용이 있는 것으로 나타났다. IBA 첨가구의 경우 농도가 높아짐에 따라 뿌리수가 2.4개(0.5 mg/L)에서 10.1개(5.0 mg/L)로 현저히 증가한 반면 NAA 경우, 1.0 mg/L에서 최대 8.2를 보였으며, 5.0 mg/L 고농도에는 3.3개로 현저히 감소되어 저농도가 발근에 유리함을 알 수 있다.
뿌리길이 비교에서는 무첨가구에서 특이하게도 1개의 뿌리가 발생되었는데 그 길이는 23.2 mm로 가장 길었으나 3.3%의 아주 낮은 발근율을 보였다. 5.0 mg/L NAA에서는 1.7 mm로 뿌리 길이가 짧았으며(Table 2), 대체적으로 IBA 첨가구가 NAA 처리구에 비해 긴 뿌리발생 경향을 보였고, 오옥신 종류 및 농도에 따른 발근은 p < 0.05 수준에서 유의성 있는 차이를 보이는 것으로 나타났다.
정금나무 기내발근의 경우 배양 3주 후 정상적인 뿌리 형성을 보인 0.5 mg/L IBA 첨가구가 가장 적합한 것으로 나타났는데 2.0 및 5.0 mg/L IBA 처리구에서의 발근율 및 뿌리수에서는 저농도의 0.5 mg/L IBA보다 높았으나 뿌리가 정상적으로 줄기 하단부에서 직접 형성되지 않고 캘러스 및 신초 기저부의 배지와 접촉된 면으로부터 형성되어 향후 정상적인 식물체 육성에는 적합하지 않은 것으로 판단되었다(Fig. 2). 발근율은 수종에 따라 다소 차이를 보였는데
정아가 제거된 줄기의 기외발근에 미치는 적정 IBA 농도 및 삽목기질(FLEXI-PLUG 및 Horticultural substrate)에 따른 효과는 Table 3과 같다. 최대 발근율은 1.0 g/L IBA 용액처리 후 Horticultural substrate 발근 시 80.0%가 나타났으며, 최저는 IBA 무처리 후 Horticultural substrate 기외발근 시 0%로 뿌리가 전혀 형성되지 않았다(Table 3, Fig. 3).
Table 3 Effect of
Treatment | IBA (g/L) | Root formation (% ± S.D.) | Root length (mm) (mean ± S.D.) | Shoot length (mm) (mean ± S.D.) |
---|---|---|---|---|
IBA + Flexi-Plugs | 0 | 20.0 ± 10.0ef* | 23.5 ± 2.1cd | 34.6 ± 3.0cd |
0.05 | 40.0 ± 10.0cde | 24.3 ± 3.7c | 31.7 ± 4.7d | |
0.1 | 26.7 ± 15.3de | 24.8 ± 3.5c | 34.7 ± 3.9cd | |
0.5 | 50.0 ± 10.0ab | 27.9 ± 4.3b | 34.1 ± 7.4cd | |
1.0 | 36.7 ± 11.6cde | 32.7 ± 5.2ab | 35.3 ± 6.4cd | |
IBA + Horticultural soil | 0 | 0 | 0 | 0 |
0.05 | 33.3 ± 5.8cde | 18.1 ± 4.3d | 40.3 ± 8.2ab | |
0.1 | 46.7 ± 15.3bcd | 27.0 ± 4.7bc | 37.3 ± 8.5bc | |
0.5 | 63.3 ± 15.3ab | 33.8 ± 5.4a | 42.1 ± 10.2a | |
1.0 | 80.0 ± 17.3a | 32.9 ± 5.1ab | 41.7 ± 5.6a |
*Means within the column followed by the same letter are not significantly different, Duncan’s multiple range test, p < 0.05.
IBA, indole-3-butyric acid.
정금나무(
J Plant Biotechnol 2022; 49(1): 82-89
Published online March 31, 2022 https://doi.org/10.5010/JPB.2022.49.1.082
Copyright © The Korean Society of Plant Biotechnology.
윤아영・김태동・김지아・이나념・정은주・김용욱
국립산림과학원 임목자원연구과
국립산림과학원 산림약용자원연구소
강원대학교 산림과학부
Ayoung Yun ・Tae Dong Kim・Ji Ah Kim・Na Nyum Lee ・Eun Ju Cheong ・Yong Wook Kim
(Division of Forest Tree Improvement & Biotechnology, National Institute of Forest Science, Suwon 16631, Korea)
(Forest Medicinal Resources Research Center, National Institute of Forest Science, Yeongju 36040, Korea)
(Division of Forest Science, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea)
Correspondence to:e-mail: bravekim@korea.kr, ejcheong@kangwon.ac.kr
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
In vitro techniques were developed for propagating Vaccinium oldhamii using shoots with apical buds. Explants having an apical bud were cultured on Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with 1.0, 2.0, and 5.0 mg/L of each zeatin, thidiazuron, 6-benzylaminopurine (BA), and 6-(γ,γ-dimethylallylamino)purine (2-iP) in order to induce multiple shoots. Among the tested treatments, the 2.0 mg/L of 2-iP proved to be most suited for the multiplication and growth of shoots; the multiple shoot induction rate was 100.0%, the average number of shoots was 7.4 per explant, and the average shoot length was 51.7 mm. The in vitro elongated shoots were rooted on half-strength MS medium containing various concentrations of indole-3-butyric acid (IBA) and 1-naphthaleneacetic acid (NAA). However, overall callus overgrowth was observed in all treatments and resulted in necrosis and abnormal shoot growth in root formation. A low concentration (0.5 mg/L) of IBA was appropriate for normal root development and the in vitro rooting rate was 30%. Ex vitro treatments on root formation using various concentrations of IBA with Talc powder and two types of rooting substrates (Flexi-Plugs or Horticultural soil) were examined. The ex vitro rooting rate (80%) and length of roots (32.9 mm) were obtained when the cut ends of the shoots were treated with 1.0 mg/L IBA and cultivated in Horticultural soil for 2 months. These findings suggest that ex vitro rooting is the more effective method for improving root formation in Vaccinium oldhamii than in vitro rooting.
Keywords: Vaccinium oldhamii, ex vitro rooting, multiple-shoot induction, plant growth regulator, plant regeneration
정금나무는 국내자생식물로 진달래과(Ericaceae) 산앵도나무속(
우리나라 블루베리 생산량은 2004년 이후 꾸준히 늘고 있는데 2019년에는 약 1만 4,400톤을 생산하였으나(Rural 2020) 현재 국내에 주로 보급된 블루베리 종은 주로 외국에서 도입된 수종이다. 그중 토종 블루베리인 정금나무는 영광군에서 2015년부터 숲가꾸기 사업으로 3000 m2 (400본)를 조성했지만 연간 과실생산량은 500 kg으로 매우 적어 그 수요 또한 미미한 실정이다(Yeong 2017).
정금나무에 대한 연구는 Kim (2012)이 10개 선발집단의 잎과 열매의 형태적 특성 변이에 따른 집단 간 차이를 보고한 바 있으며, 정금나무 열매의 기능성 성분 함량 및 항산화활성 분석에 대한 연구가 이루어져 있다(Kim et al. 2016).
정금나무 실생번식은 가을에 채취한 종자를 이끼에 파종 후 관수하는 방법과 하계에 녹지삽목을 하는 방법이 있다. 하지만 정금나무 종자발아율은 10.0% 이하로 낮고 녹지삽목 또한 삽수 채취시기가 하계에 한정되어 있어 그 효율이 매우 낮다(Kim 2012).
이러한 정금나무의 낮은 번식 효율로 인해 묘목 생산량은 저조한데 그 대안으로 생물공학기법 중 하나인 조직배양기술을 이용한 번식 방법을 개발할 필요가 있다.
따라서 본 연구에서는 기내에서 정금나무의 다신초 유도를 위한 식물생장조절물질의 적정 종류 및 농도, 기내·외 발근을 위한 적정 조건을 구명함으로써 효율적인 식물체 재분화 시스템을 확립하고자 하였다.
본 연구에 사용된 식물재료는 기내에서 종자 발아된 정금나무 소식물체의 정아를 포함한 줄기를 사용하였다. 기내식물체 증식은 염류를 반으로 줄인 1/2MS (Murashige and Skoog 1962)에 0.5 mg/L zeatin, 2% sucrose 및 0.35% gelrite를 첨가한 배지를 사용하였으며, 4주마다 동일 조성의 배지로 계대배양하였고, 계대배양 시에는 잎이 3~4개 포함된 신초를 조제하여 치상하였다. 모든 배양은 광량자속밀도 40 μm m-2 s-1, 광주기 16/8시간, 온도 25 ± 1°C로 유지되는 배양실에서 배양하였다.
기내 배양 중인 정금나무의 줄기에서 정아를 포함하는 줄기를 1 cm 정도 길이로 절단하여 1.0, 2.0 및 5.0 mg/L의 Zeatin, 6-Benzylaminopurine (BA), 6-(γ,γ-Dimethylallylamino)purine (2-iP) 또는 Thidiazuron (TDZ)를 농도별로 각각 첨가한 MS 고체배지(3% sucrose, 0.35% gelrite, pH 5.7)에 치상하였다. 절편은 각 처리구당 10개씩 3반복하여 치상하였고, 배양 8주 후에 다신초 유도율, 신초 유도 수 및 길이를 각각 조사하였다.
기내발근 유도를 위해 정아가 포함된 줄기를 2 cm 길이로 절단하여 1/2MS 배지에 1% sucrose를 첨가하고 0, 0.5, 1.0, 2.0 및 5.0 mg/L의 Indole-3-butyric acid (IBA) 또는 1-Naphthaleneacetic acid (NAA)를 단용처리한 배지에 치상하였다. 절편은 각 처리구당 10개씩 3반복하여 치상하였고, 배양 8주 후에 발근율, 뿌리의 수와 길이를 각각 조사하였다.
기외발근 유도를 위해 먼저 정아를 제거하고 대신 액아 4~6개가 포함된 줄기를 2.5~3 cm 길이로 절단하여 사용하였다. IBA농도는 0, 0.05, 0.1, 0.5, 1 g/L 및 Talc (삼전화학, 일본)를 섞어 사용하였는데 각각 IBA 농도 별 용액 2.0 mL에 Talc 2.0 g을 혼합 후 절단된 줄기 절단 말단부위에 묻혀 피트플러그 혹은 Horticultural substrate (원예범용상토, 팜한농)에 치상하였다. 절편은 각 처리구당 10개씩 3반복하여 치상하였고, 배양 8주 후에 발근율, 뿌리길이 및 줄기길이를 각각 조사하였다. 기외 발근용 삽목 컨테이너 내 공중습도는 90% 이상 유지하였고 광량자속밀도 40 μm m-2 s-1, 광주기 16시간 및 25 ± 1°C 조건에서 배양하였다.
기외발근으로 유도된 뿌리 절편체를 발근 초기부터 약 1주 간격으로 3주 동안 줄기 하단부를 채취하여 2.5% glutaraldehyde와 1.6% paraformaldehyde가 포함된 고정액(pH 6.8)에 넣어 4°C에서 24~48시간 동안 고정시켰다. 그후 ethanol 농도별(30, 50, 70, 80, 90, 95, 100%)로 차례로 탈수처리 후 glycol methaacrylate (Technovit 7100, Kluzer, Germany)에 포매하였으며(Yeung 1999), Autocut microtome (Leica RM 2165, Germany)을 이용하여 3 μm 두께로 박편을 만들어서 슬라이드 글라스에 고정시켰다. 그후 0.1% periodic acid-Schiffs (PAS)를 사용하여 carbohydrates 및 0.05% toluidine blue O (TBO)로 2차 염색 후 광학현미경(Leica, DMR, Germany)으로 관찰하였다.
본 실험 모두 총 3반복으로 수행하였고, 데이터분석은 SPSS를 이용하였으며 각 처리간 유의성 검정은 one-way 및 two-way ANOVA를 실시하였다. 유의성이 있는 경우 Duncan’s multiple range test로 사후분석을 하였고, 통계적 유의성은 P < 0.05로 설정하여 분석하였다.
Table 1은 zeatin, BA, 2-iP 및 TDZ 등 4종류 cytokinin의 농도가 다신초 유도에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 1.0, 2.0, 5.0 mg/L zeatin, 5.0 mg/L TDZ, 그리고 2.0 mg/L 2-iP 첨가구의 모든 절편체에서 신초가 발생한 것으로 나타났으며, 1.0, 2.0 및 5.0 mg/L BA 첨가구에서는 전혀 신초 유도가 이루어지지 않아 zeatin 등 다른 첨가구와는 대조적이었다. 본 실험의 경우 이전의 예비실험의 다신초 유도 시 control에서 전혀 신초 유도가 이루어지지 않았기에 제외시켰다(데이터 없음).
Table 1 . Effect of different types and concentrations of cytokinins on multiple shoot induction from explants having an apical bud in
Cytokinin | Treatment (mg/L) | Shoot induction (%) | No. of shoots/explant (mean ± S.D.) | Shoot length (mm) (mean ± S.D.) |
---|---|---|---|---|
Zeatin | 1.0 | 100.0 | 5.8 ± 2.4de* | 34.1 ± 2.4c |
2.0 | 100.0 | 7.5 ± 2.8cde | 31.5 ± 2.9d | |
5.0 | 100.0 | 23.5 ± 10.4a | 4.4 ± 0.4f | |
TDZ | 1.0 | 84.0 | 12.2 ± 6.3b | 5.3 ± 1.4f |
2.0 | 88.0 | 10.2 ± 5.4bc | 5.3 ± 1.1f | |
5.0 | 100.0 | 8.0 ± 5.3cd | 5.0 ± 1.3f | |
BA | 1.0 | 0 | 0 | 0 |
2.0 | 0 | 0 | 0 | |
5.0 | 0 | 0 | 0 | |
2-iP | 1.0 | 88.0 | 5.2 ± 2.9de | 38.9 ± 2.7b |
2.0 | 100.0 | 7.4 ± 3.0cde | 51.7 ± 5.5a | |
5.0 | 92.0 | 4.3 ± 1.6e | 25.5 ± 3.2e |
*Means within the column followed by the same letter are not significantly different, Duncan’s multiple range test, p < 0.05..
TDZ, thidiazuron; BA, 6-benzylaminopurine; 2-iP, 6-(γ,γ-dimethylallylamino)purine..
절편체 당 다신초 유도 수 비교에서 가장 많은 신초가 유도된 첨가구는 5.0 mg/L zeatin으로 평균 23.5개였으며, 호르몬 종류 및 농도간의 유의확률은 0.05 이하이므로, 호르몬 종류 및 농도간에 유의한 상호작용이 있는 것으로 나타났다. 1.0 mg/L zeatin에서 5.8개 및 5.0 mg/L 2-iP에서 4.3개로 두 첨가구에서 가장 적은 신초가 발생하였는데(Table 1) 특히 1.0~5.0 mg/L 2-iP 첨가구의 경우 농도에 관계없이 4.3~7.4개로 나타나 타 사이토키닌 처리구보다 다신초 유도 효율이 낮은 것으로 알 수 있다. Zeatin 첨가구의 경우 1.0에서 5.0 mg/L로 농도가 높아짐에 따라 다신초 유도 수는 5.8에서 23.5개로 증가하는 현상을 보였으나, 반면 TDZ 첨가 시 저농도 1.0에서 5.0 mg/L로 높아짐에 따라 다신초 유도 수는 12.2에서 8.0개로 감소하는 현상을 보였다. 따라서 zeatin은 고농도 첨가가 적합하고 TDZ 경우 저농도가 효과적임을 알 수 있다(Table 1).
줄기배양 9일 후부터 정아에서 엽전개가 시작되었고, 3주 후부터는 zeatin, TDZ 및 2-iP 첨가구에서 대부분 다신초가 유도되었다. Zeatin, 2-iP 및 TDZ 첨가구 경우에는 줄기 하단부에 녹색의 캘러스가 형성되었으나 BA 첨가구에서는 관찰되지 않았다(Fig. 1). 활엽수종 기내배양에서 줄기 하단부에 형성되는 캘러스는 양분 및 식물생장호르몬의 저장 기능의 역할을 하는 것으로 보고되고 있는데(Vieitez et al. 1989), 본 실험의 경우에서도 BA 첨가구를 제외한 다른 모든 첨가구의 줄기 하단부에서 캘러스가 형성되어 다신초 유도 시 캘러스가 함께 형성되는 특징을 가지고 있는 것으로 판단된다.
IBA 및 NAA의 농도에 따른 줄기의 기내발근에 미치는 영향은 Table 2와 같다. 최대 발근율은 2.0 mg/L NAA 첨가구에서 86.7%로 가장 높게 나타났으나, 무첨가구에서는 3.3%로 가장 저조한 발근율을 보였으며, 호르몬종류 및 농도의 유의확률은 0.05 이하이므로 유의한 상호작용이 있는 것으로 나타났다. IBA 첨가구 경우, 0.5에서 5.0 mg/L로 농도가 높아짐에 따라 그 발근율은 30.0에서 60.0%로 증가함을 보였고 NAA 첨가구 경우, 0.5에서 2.0 mg/L까지 86.7%로 점차 증가하였지만, 5.0 mg/L 첨가 시 10.0%로 발근율이 현저히 낮아짐을 보였다(Table 2).
Table 2 . Effect of auxins on in vitro rooting of shoots having an apical bud in
Treatment (mg/L) | Root formation (% ± S.D.) | No. of roots/shoot (mean ± S.D.) | Root length (mm) (mean ± S.D.) | |
---|---|---|---|---|
Control | 0 | 3.3 ± 1.3e* | 1.0 ± 0.3d | 23.2 ± 4.3a |
IBA | 0.5 | 30.0 ± 10.0cd | 2.4 ± 2.2cd | 17.6 ± 7.5bc |
1.0 | 30.0 ± 10.0cd | 3.7 ± 3.5bcd | 20.0 ± 6.3b | |
2.0 | 43.3 ± 30.6cd | 8.4 ± 7.7ab | 19.3 ± 5.0b | |
5.0 | 60.0 ± 10.0abc | 10.1 ± 7.1a | 14.3 ± 2.8c | |
NAA | 0.5 | 60.0 ± 26.5abc | 5.2 ± 3.6bc | 12.8 ± 2.6cd |
1.0 | 66.7 ± 20.8ab | 8.2 ± 4.2ab | 10.7 ± 1.8d | |
2.0 | 86.7 ± 15.3a | 7.1 ± 4.0abc | 3.7 ± 1.2e | |
5.0 | 10.0 ± 10.0d | 3.3 ± 2.1cd | 1.7 ± 0.5e |
*Means within the column followed by the same letter are not significantly different, Duncan’s multiple range test, p < 0.05..
TDZ, thidiazuron; BA, 6-benzylaminopurine; 2-iP, 6-(γ,γ-dimethylallylamino)purine..
최대 뿌리수는 5.0 mg/L IBA에서 10.1개로 가장 높았으나 무첨가구에서는 1.0개로 가장 저조한 뿌리수를 보였으며(Table 2), 호르몬종류 및 농도의 유의확률은 0.05 이하이므로 유의한 상호작용이 있는 것으로 나타났다. IBA 첨가구의 경우 농도가 높아짐에 따라 뿌리수가 2.4개(0.5 mg/L)에서 10.1개(5.0 mg/L)로 현저히 증가한 반면 NAA 경우, 1.0 mg/L에서 최대 8.2를 보였으며, 5.0 mg/L 고농도에는 3.3개로 현저히 감소되어 저농도가 발근에 유리함을 알 수 있다.
뿌리길이 비교에서는 무첨가구에서 특이하게도 1개의 뿌리가 발생되었는데 그 길이는 23.2 mm로 가장 길었으나 3.3%의 아주 낮은 발근율을 보였다. 5.0 mg/L NAA에서는 1.7 mm로 뿌리 길이가 짧았으며(Table 2), 대체적으로 IBA 첨가구가 NAA 처리구에 비해 긴 뿌리발생 경향을 보였고, 오옥신 종류 및 농도에 따른 발근은 p < 0.05 수준에서 유의성 있는 차이를 보이는 것으로 나타났다.
정금나무 기내발근의 경우 배양 3주 후 정상적인 뿌리 형성을 보인 0.5 mg/L IBA 첨가구가 가장 적합한 것으로 나타났는데 2.0 및 5.0 mg/L IBA 처리구에서의 발근율 및 뿌리수에서는 저농도의 0.5 mg/L IBA보다 높았으나 뿌리가 정상적으로 줄기 하단부에서 직접 형성되지 않고 캘러스 및 신초 기저부의 배지와 접촉된 면으로부터 형성되어 향후 정상적인 식물체 육성에는 적합하지 않은 것으로 판단되었다(Fig. 2). 발근율은 수종에 따라 다소 차이를 보였는데
정아가 제거된 줄기의 기외발근에 미치는 적정 IBA 농도 및 삽목기질(FLEXI-PLUG 및 Horticultural substrate)에 따른 효과는 Table 3과 같다. 최대 발근율은 1.0 g/L IBA 용액처리 후 Horticultural substrate 발근 시 80.0%가 나타났으며, 최저는 IBA 무처리 후 Horticultural substrate 기외발근 시 0%로 뿌리가 전혀 형성되지 않았다(Table 3, Fig. 3).
Table 3 . Effect of
Treatment | IBA (g/L) | Root formation (% ± S.D.) | Root length (mm) (mean ± S.D.) | Shoot length (mm) (mean ± S.D.) |
---|---|---|---|---|
IBA + Flexi-Plugs | 0 | 20.0 ± 10.0ef* | 23.5 ± 2.1cd | 34.6 ± 3.0cd |
0.05 | 40.0 ± 10.0cde | 24.3 ± 3.7c | 31.7 ± 4.7d | |
0.1 | 26.7 ± 15.3de | 24.8 ± 3.5c | 34.7 ± 3.9cd | |
0.5 | 50.0 ± 10.0ab | 27.9 ± 4.3b | 34.1 ± 7.4cd | |
1.0 | 36.7 ± 11.6cde | 32.7 ± 5.2ab | 35.3 ± 6.4cd | |
IBA + Horticultural soil | 0 | 0 | 0 | 0 |
0.05 | 33.3 ± 5.8cde | 18.1 ± 4.3d | 40.3 ± 8.2ab | |
0.1 | 46.7 ± 15.3bcd | 27.0 ± 4.7bc | 37.3 ± 8.5bc | |
0.5 | 63.3 ± 15.3ab | 33.8 ± 5.4a | 42.1 ± 10.2a | |
1.0 | 80.0 ± 17.3a | 32.9 ± 5.1ab | 41.7 ± 5.6a |
*Means within the column followed by the same letter are not significantly different, Duncan’s multiple range test, p < 0.05..
IBA, indole-3-butyric acid..
정금나무(
Table 1 . Effect of different types and concentrations of cytokinins on multiple shoot induction from explants having an apical bud in
Cytokinin | Treatment (mg/L) | Shoot induction (%) | No. of shoots/explant (mean ± S.D.) | Shoot length (mm) (mean ± S.D.) |
---|---|---|---|---|
Zeatin | 1.0 | 100.0 | 5.8 ± 2.4de* | 34.1 ± 2.4c |
2.0 | 100.0 | 7.5 ± 2.8cde | 31.5 ± 2.9d | |
5.0 | 100.0 | 23.5 ± 10.4a | 4.4 ± 0.4f | |
TDZ | 1.0 | 84.0 | 12.2 ± 6.3b | 5.3 ± 1.4f |
2.0 | 88.0 | 10.2 ± 5.4bc | 5.3 ± 1.1f | |
5.0 | 100.0 | 8.0 ± 5.3cd | 5.0 ± 1.3f | |
BA | 1.0 | 0 | 0 | 0 |
2.0 | 0 | 0 | 0 | |
5.0 | 0 | 0 | 0 | |
2-iP | 1.0 | 88.0 | 5.2 ± 2.9de | 38.9 ± 2.7b |
2.0 | 100.0 | 7.4 ± 3.0cde | 51.7 ± 5.5a | |
5.0 | 92.0 | 4.3 ± 1.6e | 25.5 ± 3.2e |
*Means within the column followed by the same letter are not significantly different, Duncan’s multiple range test, p < 0.05..
TDZ, thidiazuron; BA, 6-benzylaminopurine; 2-iP, 6-(γ,γ-dimethylallylamino)purine..
Table 2 . Effect of auxins on in vitro rooting of shoots having an apical bud in
Treatment (mg/L) | Root formation (% ± S.D.) | No. of roots/shoot (mean ± S.D.) | Root length (mm) (mean ± S.D.) | |
---|---|---|---|---|
Control | 0 | 3.3 ± 1.3e* | 1.0 ± 0.3d | 23.2 ± 4.3a |
IBA | 0.5 | 30.0 ± 10.0cd | 2.4 ± 2.2cd | 17.6 ± 7.5bc |
1.0 | 30.0 ± 10.0cd | 3.7 ± 3.5bcd | 20.0 ± 6.3b | |
2.0 | 43.3 ± 30.6cd | 8.4 ± 7.7ab | 19.3 ± 5.0b | |
5.0 | 60.0 ± 10.0abc | 10.1 ± 7.1a | 14.3 ± 2.8c | |
NAA | 0.5 | 60.0 ± 26.5abc | 5.2 ± 3.6bc | 12.8 ± 2.6cd |
1.0 | 66.7 ± 20.8ab | 8.2 ± 4.2ab | 10.7 ± 1.8d | |
2.0 | 86.7 ± 15.3a | 7.1 ± 4.0abc | 3.7 ± 1.2e | |
5.0 | 10.0 ± 10.0d | 3.3 ± 2.1cd | 1.7 ± 0.5e |
*Means within the column followed by the same letter are not significantly different, Duncan’s multiple range test, p < 0.05..
TDZ, thidiazuron; BA, 6-benzylaminopurine; 2-iP, 6-(γ,γ-dimethylallylamino)purine..
Table 3 . Effect of
Treatment | IBA (g/L) | Root formation (% ± S.D.) | Root length (mm) (mean ± S.D.) | Shoot length (mm) (mean ± S.D.) |
---|---|---|---|---|
IBA + Flexi-Plugs | 0 | 20.0 ± 10.0ef* | 23.5 ± 2.1cd | 34.6 ± 3.0cd |
0.05 | 40.0 ± 10.0cde | 24.3 ± 3.7c | 31.7 ± 4.7d | |
0.1 | 26.7 ± 15.3de | 24.8 ± 3.5c | 34.7 ± 3.9cd | |
0.5 | 50.0 ± 10.0ab | 27.9 ± 4.3b | 34.1 ± 7.4cd | |
1.0 | 36.7 ± 11.6cde | 32.7 ± 5.2ab | 35.3 ± 6.4cd | |
IBA + Horticultural soil | 0 | 0 | 0 | 0 |
0.05 | 33.3 ± 5.8cde | 18.1 ± 4.3d | 40.3 ± 8.2ab | |
0.1 | 46.7 ± 15.3bcd | 27.0 ± 4.7bc | 37.3 ± 8.5bc | |
0.5 | 63.3 ± 15.3ab | 33.8 ± 5.4a | 42.1 ± 10.2a | |
1.0 | 80.0 ± 17.3a | 32.9 ± 5.1ab | 41.7 ± 5.6a |
*Means within the column followed by the same letter are not significantly different, Duncan’s multiple range test, p < 0.05..
IBA, indole-3-butyric acid..
You Kyoung Kim ・Sug Youn Mo ・Su Bin Choi ・Han Yong Park
J Plant Biotechnol 2023; 50(1): 155-162
Journal of
Plant Biotechnology