활성산소(Reactive oxygen species, ROS)는 산소의 연소과정에서 생성되는 부산물로서 주로 미토콘드리아의 에너지 생성 과정에서 생성된다. 적절한 양의 활성산소는 세균으로부터 신체를 보호할 수 있고, 세포의 성장, 세포사멸 및 신호 전달을 조절한다. 하지만 체내에 높은 농도로 존재할 경우 세포 내의 단백질, 지질을 산화시켜(Brieger et al. 2012) 세포의 노화 및 사멸을 촉진시킴으로써 당뇨병, 암, 뇌졸중 등의 질병을 유발할 수 있다(Kim and Kim 2020). 체내 활성산소는 catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) 같은 체내 항산화 효소나 외부 항산화제에 의해 억제될 수 있으며, 이를 통해 활성산소에 의해 유발될 수 있는 질병을 예방할 수 있다. 항산화제는 free radical과의 반응을 통해 비타민류와 필수 아미노산의 손실을 최소화하기 위해 사용되며(Lee et al. 2005), free radical을 억제할 수 있는 외부의 천연 항산화제로는 α-tocoperol (Vitamic E), ascorbic acid (Vitamin C) 등이 있다(Frankel 1996). α-tocopherol보다는 ascorbic acid가 항산화제로서 더 선호되는데 α-tocopherol은 높은 안정성을 가지나 경제적으로 좋지 못 하다는 단점이 있다(Lee et al. 2005). 합성항산화제에는 butylated hydroxy anisole (BHA), butylated hydroxy toluene (BHT) 등이 있고 경제적이고 효과가 우수하다는 장점이 있지만 생체 내 안정성에 대한 논란이 존재하고(Kim et al. 2018), 실험동물에 고농도로 투여했을 때 간비대증 유발 및 발암성을 나타내어(Lee et al. 2005), 천연물 유래 항산화제에 대한 연구가 지속적으로 진행되고 있다.

율피는 너도밤나무과 밤나무의 밤의 속 껍질로 tannic acid, catechin, gallic acid, coumarin 등 항산화 성분의 함유량이 많아(Gu et al. 2018; Lee and Surh 2021) 체내에서의 활성산소종을 저해할 수 있는 천연 항산화제로서 활용될 수 있다. 최근 연구 결과를 통해 율피가 주름개선, 미백(Jang et al. 2011), 보습(Gu et al. 2018), 항아토피 활성(Choi et al. 2013), 항염 등의 효과가 있으며, 멜라닌 색소의 과다 침착을 저해하여 피부 미용에도 사용되고 있다고 보고되고 있다(Gu et al. 2018). 또한 Kim 등(2022)은 율피가 알레르기 천식 모델에서도 유의한 효과를 보였다고 보고하였고, Noh 등(2011)의 연구결과에 따르면 율피는 간 보호 효과도 있는 것으로 보고되고 있다.

율피에 대한 다양한 연구가 진행되고 있지만 율피의 분획물에 대한 연구는 아직 부족한 상황이다. 이에 본 연구에서는 율피 추출물과 분획물의 기능성 소재로서의 가능성을 알아보고자 항산화 활성을 in vitro 시험을 통해 조사하였다.

추출물 및 분획물의 제조

율피를 분쇄기로 분말화한 후 율피 분말 100 g에 70% 에탄올을 10배수로 첨가하여 실온에서 72시간동안 추출하였다. 추출액은 Whatman No.3 filter paper (Whatman Ltd., Maidstone, Kent, UK)를 이용하여 여과한 후 55°C에서 감압농축하였다. 농축이 완료된 추출물은 동결건조해서 파우더화한 후 -70°C 초저온 냉동고에 보관하였다. 율피 추출물을 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol, water층으로 분획한 후 동일한 과정을 거쳐 동결건조하였다(Fig. 1).

Figure 1. Diagram of Castanea crenata inner shell fraction preparation

총 폴리페놀 함량 측정

시료용액 60 μL에 2배 희석한 Folin-Ciocaltea's phenol reagent (Sigma-Aldrich CO. St. Louis, MO, USA) 60 μL를 넣고 실온에서 3분간 반응시킨 후 10% Na₂CO₃ (Sigma Co.)를 60 μL 넣고 실온에서 40분간 반응시킨 다음 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 gallic acid (Sigma Co.)를 사용하였고, 표준곡선을 작성하여 총 폴리페놀의 함량을 측정하였다

총 플라보노이드 함량 측정

시료용액 100 μL에 10% aluminium nitrate (Sigma Co.)와 1 M potassium acetate (Sigma Co.)를 20 μL씩 넣고 80% 에탄올을 860 μL을 가한 다음 실온에서 40분간 반응시킨 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 quercetin (Sigma Co.)을 사용하였고, 표준곡선을 작성하여 총 플라보노이드의 함량을 산출하였다.

Electron spin resonance (ESR)을 이용한 DPPH 라디칼 소거능 측정

메탄올에 용해시킨 60 μM DPPH와 농도별 시료용액을 동량혼합하여 교반한 후 실온에서 2분간 방치하였다. 이후 capillary tube에 옮겨 ESR 분광광도계(Jeol Co. Ltd., Tokyo, Japan)에서 측정하였다. 측정조건은 center field: 3475 G, modulation frequency: 100 kHz, modulation amplitude: 2 G, microwave power: 5 mW, gain: 6.3 × 10⁵, temperature: 298 K이다. 시료는 음성 대조군의 활성을 절반으로 감소시키는 RC₅₀ 값을 산출하여 양성 대조군인 ascorbic acid과 비교 분석하였다.

통계처리

모든 실험의 데이터는 3회 분석의 평균값으로 산출하였다. 그룹 간 통계적 유의성 분석은 통계 프로그램 SPSS statistics (ver. 25, IBM Co., Armonk, NY, USA)을 이용하여 ANOVA 분석을 실시하였고, 평균값의 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test를 이용하여 분석하였다.

총 폴리페놀 함량 측정

율피에 존재하는 총 폴리페놀의 함량은 gallic acid를 기준물질로 측정하였고, 측정된 함량은 Figure 2에 나타내었다. 70% 에탄올 추출물에서 총 폴리페놀 함량은 39.76 mg GAE/g이었고, 추출물의 분획물의 총 폴리페놀 함량은 ethyl acetate, butanol, chloroform, hexane, water순으로 각각 323.92, 120.35, 63.80, 53.84, 38.18 mg GAE/g이었다. 이를 통해 ethyl acetate 층의 총 폴리페놀 함량이 가장 높음을 확인하였다(p < 0.05).

Figure 2. Total polyphenol contents in ethanol extracts and fractions from Castanea crenata inner shell. The total polyphenol content was analyzed as gallic acid equivalents (GAE) mg/g of extracts’ fractions. Data were expressed as mean ± standard deviation (n = 3). Different letters indicate significant differences at p < 0.05 using Duncan's multiple range test

총 플라보노이드 함량 측정

율피에 존재하는 총 플라보노이드의 함량은 quercetin을 기준물질로 하여 측정되었으며, 측정된 함량은 Figure 3에 나타내었다. 70% 에탄올 추출물에서 총 플라보노이드 함량은 4.54 mg QE/g이었고 추출물의 분획물의 총 플라보노이드 함량은 ethyl acetate, hexane, butanol, chloroform, water 순으로 각각 13.12, 8.31, 3.36, 2.50, 1.10 mg QE/g이었다. 이를 통해 ethyl acetate 층이 가장 많은 플라보노이드를 함유하고 있음을 확인하였고(p < 0.05), 총 폴리페놀 함량의 측정 결과와 일치하였다.

Figure 3. Total flavonoid contents in ethanol extracts and fractions from Castanea crenata inner shell. Total flavonoid content analyzed as quercetin equivalents (QE) mg/g of extracts fractions. Data were expressed as mean ± standard deviation (n = 3). Different letters indicate significant differences at p < 0.05 using Duncan's multiple range test

DPPH 라디칼 소거능

ESR을 이용해 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과는 Figure 4에 나타내었다. 율피 추출물의 RC₅₀ 값은 35.60 μg/mL였고, 분획물의 RC₅₀ 값은 ethyl acetate, butanol, chloroform, hexane, water 순으로 각각 2.27, 14.44, 16.04, 27.69, 79.54 μg/mL였다. 각 시료의 DPPH 라디칼 소거능 측정 결과 ethyl acetate 층의 라디칼 소거 활성이 가장 좋았고, 양성 대조군인 ascorbic acid의 4.45 μg/mL보다 더 좋은 활성을 보였다(p < 0.05).

Figure 4. DPPH radical scavenging activity of ethanol extracts and fractions from Castanea crenata inner shell. The DPPH radical scavenging activity was measured using an ESR spectrophotometer. Graph and ESR spectra indicate the DPPH radical scavenging effect of (A) ascorbic acid, (B) 70% ethanol extracts, (C) hexane fractions, (D) chloroform fractions, (E) ethyl acetate fractions, (F) butanol fractions, and (G) water fractions. Meanwhile, (H) indicates the RC50 value of DPPH radical scavenging activity. Data were expressed as mean ± standard deviation (n = 3). Different letters indicate significant differences at p < 0.05 using Duncan's multiple range test

폴리페놀은 식물에 널리 분포하고 있는 생물활성 화합물로 폴리페놀의 활성은 in vitro 및 in vivo 실험을 통해 연구가 진행되고 있다. 연구를 통해 폴리페놀은 항산화 활성 외에 심혈관 질환, 염증 등에 대해 보호 효과가 있는 것으로 확인되었다(Garcia and Larrosa 2020).

폴리페놀은 플라보노이드 군과 비플라보노이드 군으로 나뉘어질 수 있다. 플라보노이드 군에는 flavone, catechin, ahthocyanin 등이 포함되며, 비플라보노이드군에는 coumarin, lignan 등이 포함되어 있다(Ganesan and Xu 2017). 폴리페놀에 속하는 플라보노이드는 가장 많이 존재하는 식물의 천연물 중 하나로 C6-C3-C6의 구조를 가지고 있으며, flavanones, flavones, flavonols, flavanols, isoflavones, isoflavanones으로 분류된다. 플라보노이드는 항산화, 항암, 항균 등의 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 전립선, 폐암, 난소암 등에 대해 암세포의 발달 방지 및 발암물질의 작용 전 억제를 통해 항암 활성을 나타낸다(Sajid et al. 2021).

Kwon 등(2001)이 밤 귀피의 분획물에서 ethyl acetate 및 diethyl ether 층에서 항산화 활성이 가장 높다고 보고한 결과와 비교했을 때 본 연구에서도 율피의 분획물 중 ethyl acetate 층의 항산화 활성이 가장 높음을 확인하였다. Lee 등(2012)의 연구결과에 따르면 플라보노이드 함량이 항산화 활성과 연관이 있으므로 율피의 ethyl acetate 분획물은 항산화제로서 이용될 수 있다고 생각된다.

DPPH는 짙은 자주색을 띠며 안정적인 자유 라디칼로서, DPPH를 이용한 라디칼 소거능 측정은 빠르고 간단하여 추출물의 항산화 활성을 평가하기 위해 널리 사용되는 방법이다. DPPH는 물질로부터 전자나 수소를 받게 되면 diphenylpicryl hydrazine으로 환원되며 보라색이 노란색으로 변화하는데 이를 이용하여 다양한 식물의 항산화능을 측정하는데 활용되고 있다(Le et al. 2019; Park et al. 2014). Electron spin resonance (ESR)은 홀전자를 가지는 자유 라디칼을 정량할 수 있는 직접적인 방법으로서 피크의 높이가 감소할수록 자유라디칼 소거 활성이 높아진다는 것을 의미한다(Cha et al. 2006; He et al. 2014).

Choi 등(2013)은 율피의 열수 추출물 및 발효물 1 mg/mL에서 DPPH 라디칼 소거능이 각각 73.74%, 67.17%라고 보고하였다. 본 연구에서의 율피 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 200 μg/mL 이하의 농도에서 80% 이상의 라디칼 소거능을 보이므로 본 연구에 쓰인 율피 추출물 및 분획물이 우수한 라디칼 소거능을 가지고 있다고 할 수 있다. Kim 등(2014)은 추출 조건을 달리 한 율피 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 측정 결과 RC₅₀ 값이 10~407 μg/mL라고 보고하였고, 이와 비교했을 때 본 연구에서의 율피 추출물 및 분획물의 RC₅₀ 값이 2.27~79.54 μg/mL이므로 율피 추출물 및 분획물이 우수한 라디칼 소거능을 가진다는 것을 확인하였다.

용매를 이용한 분획물의 제조는 용매의 극성이 다르다는 점을 이용하여 분리하는 과정으로 ethyl acetate는 저극성의 용매로서 저분자이면서 저극성의 물질인 플라보노이드와 알칼로이드가 분리되게 된다(Kim et al. 2019). Nawaz 등(2020)의 연구에 따르면 용매의 극성도에 따른 DPPH 라디칼 소거능 측정 결과 4~6 정도의 수준의 극성을 가지는 용매 추출물에서의 라디칼 소거능이 높게 측정되었고, ethyl acetate는 4~5 정도의 극성도를 가지므로 본 연구의 ethyl acetate 층의 항산화 활성이 높게 나온 결과와 일치하였다. Galanakis 등(2013)은 페놀 화합물들의 극성에 대해 조사하였고, hydroxycinnamic acid, hydroxybenzoic acid 등이 극성의 정도를 나타내는 log P가 1~2 수준으로 저극성을 나타낸다고 보고하였다. hydroxycinnamic acid와 hydroxybenzoic acid는 항산화 활성을 나타낼 수 있는 페놀 화합물로서(Cizmarova et al. 2021) 분획 과정에서 시료의 포함되어 있던 화합물이 ethyl acetate 층에 용해되면서 ethyl acetate 분획물이 높은 항산화 활성을 가지는 것으로 사료된다.

본 연구에서는 율피 추출물 및 분획물의 항산화 활성을 in vitro 실험을 통하여 조사하였다. 총 폴리페놀 함량은 율피의 70% 에탄올 추출물에서 39.76 μg/mL였고 분획물 중에서는 ethyl acetate 층의 함량이 323.92 μg/mL으로 가장 높았다(p < 0.05). 총 플라보노이드 함량 측정 결과 폴리페놀 측정 결과와 유사하게 ethyl acetate 분획물의 함량이 13.12 μg/mL으로 가장 높았다(p < 0.05). DPPH 라디칼 소거능 측정 결과 ethyl acetate 분획물의 RC₅₀ 값이 2.27 μg/mL으로 양성 대조군인 ascorbic acid보다 낮은 RC₅₀ 값을 나타내었다(p < 0.05). 모든 결과를 종합해보았을 때, 율피의 70% 에탄올 추출물과 분획물 중 ethyl acetate 분획물의 항산화 활성이 가장 높게 나타났음을 확인하였다.

이에 본 연구의 결과는 율피를 기능성 소재로서 활용하는 데 기초 자료로 쓰일 것으로 기대되며, ethyl acetate 분획물에 대한 추가적인 연구가 이루어져야 할 것으로 판단된다.

이 성과는 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임(No.2021R1F1A1063617).