쉽싸리(학명: Lycopus lucidus Turcz. ex Benth., 일반명: shiny bugleweed)는 꿀풀과(Lamiaceae family)에 속하는 다년생 초본으로 한국, 중국, 일본 등 아시아 지역의 습지에 주로 분포하고 있다. 예로부터 아시아 지역에서 전통 약제로 사용되어왔으며, 주로 줄기를 약용으로 사용하였다. 줄기는 택란(澤蘭)이라 부르며 여성생리장애, 염증, 심혈관 질환 등을 치료하는데 사용하였다. 현대에 들어서는 이러한 전통약재들의 성분을 보다 과학적으로 분석하여 그 효능을 밝히는 연구들이 진행되고 있으며, 쉽싸리 성분 또한 약리학적 연구들이 이루어지면서 천연물로의 가치가 밝혀지고 있다. 쉽싸리 줄기유래 추출물이 TNF-a 와 IL-6 등 알레르기를 일으키는 물질의 분비를 억제하는 항알레르기 효과가 있는 것이 보고되었고(Shin et al. 2005), 잎 추출 성분이 중증당뇨병에 의한 동맥경화 초기 원인인 혈관염증을 완화시키고(Lee et al. 2008), 전초 유래 오일추출 성분은 항암, 항미생물, 항산화에 효과적이라는 연구 결과가 보고되었다(Yu et al. 2011). 또한 Ca²⁺의 출입을 원활히 하여 심방의 근육수축력을 개선함으로써 심장의 혈액 공급이 원활하게 하고(Cui et al. 2013), 열수추출물 유래 성분은 streptozocin 이라는 당뇨병 유발 인자에 의해 유도된 신장염증을 개선한다고 보고하였다(Yuanzhang et al. 2013). 이전 연구에서는 쉽싸리의 전초 유래 성분에 대한 연구들이 대부분이었으나, 최근에는 뿌리줄기(괴경)유래 추출물의 유익한 성분들이 밝혀지면서 뿌리 유래 천연물에 관심이 높아지고 있다. 뿌리유래 성분에 대한 최근 연구보고로는 쉽싸리의 뿌리추출물에 최근 각광 받고 있는 장내 유익한 미생물(probiotics)의 생육을 촉진하는 식이섬유(prebiotics)중 하나인 α-Galacto-oligosaccharides라는 올리고당이 다량 함유되어 있고, 이 성분이 면역조절학적 활성을 가진다고 보고하였다(Yang et al. 2010). 또한 뿌리유래 성분 중 올리고당(oligosaccharide)성분이 항종양(antitumor), 저지혈증(hypolipidemic), 항노화(antiaging), 저혈당(hypoglycemic) 등을 개선하는데 효과가 있어 아시아의 새로운 기능성 식품으로 떠오르고 있다고 언급하고 있다(Lin et al. 2012; Xiong et al. 2011; Xiong et al. 2012; Lu et al. 2015).

쉽싸리 천연물의 우수한 성분과 효과가 규명됨에 따라 약리활성 및 신소재로의 상업적 활용가치가 증가하고 있으나 천연물의 식물화학적(phytochemical) 특성상 성분과 함량은 여러 외부환경 즉, 수확시기, 유전자형(genotype), 기후 등에 의해 영향을 받으므로 일정한 품질과 성분을 생산하는데 어려움이 있다. 따라서 일정량의 대사물질을 함유하고 있는 재료의 원활한 공급을 위해 생물공학적 방법을 이용한 생산 연구가 계속 이루어지고 있으며 조직배양연구는 이러한 문제를 해결하기 위한 효과적인 방법 중의 하나이다. 조직배양은 계절에 관계없이 실험실 내에서 재료의 안정적인 공급이 가능하며 생물학적 활성처리 등을 통해 생산물질의 조절이 가능하고, 바이오매스 생산증진과 세포 및 기관을 이용한 이차대사물질의 생합성과 생산에 관한 연구수행이 가능하다(Hussain et al. 2012). 쉽싸리의 조직배양연구는 BA와 NAA처리를 통한 기내 줄기증식 연구와 쉽싸리와 같은 꿀풀과(Lamiaceae family)에 속하는 골무꽃 속(Scutellaria genus) 수종의 이차대사물질 생산을 위한 기내식물체의 줄기증식조건 연구 외에는 보고된 것이 없다(Zhou et al. 2003; Grzegorczyk-Karolak et al. 2015).

기내식물체가 생육하고 발달하기 위해서는 인공적인 영양분 즉, 다량원소(macronutrient), 미량원소(micronutrient), 식물생장 조절제(plant growth regulator), 비타민, 아미노산, 질소원 그리고 탄소급원의 공급이 필요하며, 기내에서 완전한 식물체를 만들기 위해서는 이러한 배양배지의 구성성분이 매우 중요한 요인으로 작용한다. 이중 탄소공급원은 일반식물은 자연상태에서 광합성에 의해 대기에서 탄소를 고정하지만 종속영양(heteroprophic)을 하는 기내식물체는 인위적으로 당(sugar)과 같은 탄소원의 공급이 필요하다. 기내배양 배지에서 탄소원은 식물세포의 영양분과 에너지를 공급하고 삼투압에 영향을 주며(Yaseen et al. 2013), 생장과 관련된 유전자의 발현을 조절하고 이와 관련된 물질대사와 식물의 발달과정에 관여한다고 보고하고 있다(Koch 1996). 기내식물체의 형태 형성에 있어 탄소급원의 역할은 신초 증식, 뿌리유도, 캘러스 형성 및 재분화, 체세포배 등을 유도하는데 영향을 준다. 또한 기내에서 처리한 탄소원의 종류와 농도는 배양식물체의 순화에 있어 생육과 생존율에 영향을 주는 것으로 알려져 있다.

본 연구에서는 천연물 소재로 가치가 높은 쉽싸리의 기내생육과 순화에 영향을 미치는 탄소급원의 종류 및 농도 효과를 확인하고 천연물 생산을 위한 안정적인 기내증식체계의 확립 및 기반기술 확보를 위해 본 연구를 수행하였다.

식물재료

기내 배양에 사용된 쉽싸리 식물체는 충남 아산시 인근 야산에서 자생하는 것을 채집하여 국립산림과학원 온실에 식재하였다. 쉽싸리 식물체의 줄기는 정아와 액아 마디를 포함한 10 cm의 길이로 채취하여 70% 에탄올에 3분간 소독한 후 2% 차아염소산나트륨(NaClO)에 15분 침지 한 다음 멸균수로 4회 세척하였다. 정아와 마디를 포함한 약 2 cm의 줄기 절편을 1/2MS (Murashige and Skoog 1962)배지에 2% sucrose와 0.3% gelrite를 첨가한 배지에 배양하였다. 모든 배지의 pH는 5.7로 맞추고 유리배양병(100 × 200 mm)에 배지를 첨가한 후, 121°C에서 20분간 멸균하여 사용하였다. 1일 16시간 조명(60 µmol m^-2s^-1 cool white fluorescent lamp)과 온도는 25 ± 1°C로 조절되는 배양실에서 기내 식물체를 생육시켰다.

탄소급원 종류 및 농도별 처리

배양하여 유도된 식물체로부터 절편체 정단부의 유무 그리고 탄소급원 종류에 따른 줄기생장과 뿌리생육 효과를 조사하기 위해 정단부가 포함된 줄기절편, 정단부가 제거된 액아부위 절편을 2 cm의 길이로 조제하여 재료로 사용하였다. 배지는 1/2MS 배지에 0.3% gelrite를 첨가하고, 탄소급원으로 sucrose와 glucose를 각각 3%, 5%, 7%, 10% 첨가한 배지에 배양하였다. 각 처리는 5반복하였으며, 생육조사는 배양 12주 이후 정아와 액아에서 각각 유도된 식물체의 절편당 뿌리 수, 뿌리의 길이, 절편당 줄기수, 줄기길이 및 뿌리비대 유무를 측정하였다.

기내식물체 순화

탄소원 종류 및 농도에 따른 기내식물체의 순화효과를 관찰하기 위해 줄기와 뿌리 표면의 배지를 완전히 제거한 기내식물체는 인공토양(peatmoss : vermiculite : perlite=1:1:1 v/v/v)에 이식하여 순화하였다. 순화 60일 후 탄소원 종류 및 농도와 절편종류에 따른 순화율, 식물체 당 유도된 비대근수, 비대근 길이, 비대근 직경 및 줄기길이를 조사하였다.

탄소원 및 절편 종류에 따른 줄기생육효과

기내배양 쉽싸리의 줄기생육은 탄소급원의 종류 및 농도 그리고 절편의 종류에 따라 생육의 차이를 보였다. 정아 및 액아절편에서 재분화된 식물체의 절편당 줄기 유도수는 sucorse와 glucose 10% 처리 배지에서 각각 절편당 가장 높은 줄기 유도수를 보였다. 절편의 종류에 따른 줄기 유도수는 정아 절편보다 액아 절편의 줄기유도 효율이 더 높았다. 액아 절편을 재료로 3%, 5% 그리고 7% sucrose를 처리한 배지에서는 각각 7.3~7.9개의 줄기가 유도되어 처리 농도간 줄기유도수의 차이를 보이지 않았으며, 10% sucrose 처리 배지에서는 절편당 10.4개의 줄기가 유도되어 10% 미만 처리와 비교하여 1.4배 많은 줄기가 형성되었다. 정아 절편을 재료로 절편당 줄기 유도수는 3%~10% sucrose 처리 배지에서 4.6~6.4개로 액아 절편 재료와 비교하여 줄기 유도가 저조하였다(Fig. 1 and 3A). 액아절편을 재료로 3%, 5% 그리고 7% glucose처리배지에서는 절편당 평균 4.1~4.9개의 줄기가 유도되어 처리 농도간 줄기 유도수는 차이를 보이지 않았고, 10% glucose처리 배지에서는 8.1개의 줄기가 유도되어 10% 미만 glucose처리와 비교하여 2배 이상 높은 줄기가 형성되었다. 정아 절편에서는 3~10% glucose 농도에서 평균 3.9~4.4개의 줄기가 유도되어 처리 농도 간 차이를 보이지 않았다(Fig. 2 and 3A).

Figure 1.

Effects of sucrose concentration and position of buds on the shoot and root growth of plantlets after 12 weeks of culture

Figure 2.

Effects of glucose concentration and position of buds on the shoot and root growth of plantlets after 12 weeks of culture

Figure 3.

Effects of different kinds and concentrations of carbohydrates and position of explant (apical and axically bud)) on the growth of shoots after 12 weeks of cultures. (A) number of shoots per explant, (B) length of shoots per explant

Figure 4.

Effects of different kinds and concentrations of carbohydrates and position of explant (apical and axillary bud) on the growth of roots after 12 weeks of cultures. (A) number of shoots per explant, (B) length of shoots per explant

탄소원 종류 및 농도에 따른 줄기길이는 3% sucrose를 첨가한 배지에서 가장 좋았으며 sucrose처리농도가 증가할수록 줄기의 길이생육은 감소하였다. 정아가 포함된 절편과 정아를 제거한 액아절편에서 유도된 줄기의 생육은 정아절편 유래 줄기의 길이 신장이 더 우수하였다. 3% sucrose첨가배지에서 유도된 정아절편 유래 줄기 길이는 8.9 cm로 액아절편 유래 줄기길이(8.8 cm)와 비교하여 유의적인 차이를 보이진 않았다. 5% sucrose처리에서는 정아와 액아절편에서 유도된 줄기길이 8 cm와 7.4 cm, 7% sucrose처리에서는 7.5 cm와 7 cm로 절편의 종류에 따라 유의적 차이를 보였다(Fig. 3B). 10% sucrose 첨가 배지에서는 정아와 액아 절편 각각 1.6 cm와 1.2 cm로 줄기길의 생육이 급격히 저하되었으며 3% sucrose처리와 비교하여 80% 이상 줄기의 길이생육이 저조하였다(Fig. 1 and 3B). 이것은 고농도 sucrose처리 시 절편당 줄기유도수가 증가하는 것과 상반된 결과를 보여주었다. Glucose처리에서는 배지에 첨가된 농도가 증가 할수록 줄기길이가 증가하였다(Fig. 3). 3%와 5% glucose 처리배지에서는 정아와 액아절편에서 유도된 줄기길이의 길이 생장은 유의적 차이를 보이지 않았으며, 7% glucose처리에서도 정아절편 유래 줄기의 길이 6.2 cm, 액아절편 유래 줄기길이 6 cm로 절편의 종류에 따른 줄기생육의 유의적 차이는 보이지 않았다. 10% glucose첨가 배지에서 정아와 액아절편 유래 줄기길이는 각각 7.7 cm과 7 cm로 3% glucose와 비교하여 1.4배 이상 줄기생육이 증가한 것이 관찰되었다(Fig. 2 and 3B).

기내식물체의 증식을 위한 마디배양(정아 및 액아배양)은 유전적으로 안정적인 식물체를 생산할 수 있고, 기술이 단순하여 가장 많이 이용되는 기내증식 방법중의 하나로 주로 사이토키닌이 첨가된 배지를 사용한다. 마디배양에 있어 정아와 액아의 생육에 관한 정아우세 이론은 오래 전부터 알려진 이론으로 정아에서 생성된 옥신이 정아와 길이신장은 촉진하나 아래로 내려와 측아의 생육은 억제시킨다고 알려져 왔다. 그러나 최근에는 이러한 현상이 설탕(sugar)에 의해 조절된다는 것이 밝혀졌다. 최근 연구보고에 의하면 식물체의 정아 부위를 제거 하면 옥신(auxin) 등과 같은 호르몬 보다 가장 먼저 당(sugar)이 액아 부위에 축적되며 이것은 초기 액아 형성을 위한 촉매제 역할을 한다고 보고하였다(Mason et al. 2014). 또한 세포사이클과 분열조직의 활성을 저해하여 액아 생성을 억제하는 BRANCHED1 (BRC1)이라는 액아 조절 전사인자(transcription factor)가 고농도의 sucrose 처리 시 발현이 억제되면서 액아 생장점의 분열 및 형성을 촉진한다고 보고하였으며(Michael et al. 2014), 이러한 이유로 고농도의 탄소원 처리 시 절편당 유도된 줄기의 수는 저농도 처리와 비교하여 정아보다 액아의 줄기유도율이 높았던 것으로 사료된다. 또한 줄기 혹은 뿌리와 같은 기관화된 식물조직의 배양을 위해서는 glucose보다 sucrose처리가 우수하며 이러한 이유는 정단분열조직으로의 sucrose 이동이 더 효과적이며(Butcher and Street 1964), 동일한 무게의 sucrose와 glucose가 첨가된 용액은 glucose의 분자량이 sucrose의 두 배 정도로 glucose처리에서 더 낮은 삼투효과를 가져올 수 있기 때문인 것이라 언급하고 있다(Thorpe et al. 2007). 본 연구결과에서는 sucrose처리 농도가 높아 질 수록 절편당 줄기 유도수는 증가하였으나 줄기의 길이 신장은 감소하였다. 이러한 이유는 위에서 언급한 것과 같이 고농도의 sucrose처리는 액아의 형성을 촉진하고, 흡수와 이동이 glucose 보다 더 활발하여 생육이 더 빠르기 때문으로 사료된다. 또한 고농도 sucrose처리 시 줄기길이 신장이 저조한 것은 일반적으로 당(sugar)은 화학적 신호로 세포에 전해져 고농도의 당 처리는 스트레스물질로 인지되며(Silva 2004; Ahmad et al. 2007), 고농도 sucrose처리는 배양배지에서 페놀화합물질을 증가시키고 조직을 괴사시켜 생육에 영향을 주기 때문일 것이라고 언급하고 있다(Yildiz et al. 2007). 따라서 고농도의 sucrose는 줄기 신장에 스트레스 요인으로 작용하며 조직을 괴사 시켜 생육이 저조하게 된 결과로 생각된다. 또한 같은 고농도 glucose처리에서 줄기의 생육이 sucrose보다 좋은 것은 위에서 언급한 것과 같이 glucose의 낮은 삼투효과로 인해 영양분의 이동이 더디고 이로 인해 같은 배양기간 동안 생육한 것 일지라도 고농도로 인한 저해 효과가 sucrose보다 더디게 오거나, 스트레스의 피해가 덜 하기 때문인 것으로 사료된다.

탄소원 및 절편 종류에 따른 기내뿌리 생육효과

쉽싸리의 기내발근 및 유도된 부정근의 탄소급원에 따른 생육 및 비대효과를 연구하기 위해 본 연구를 수행하였다. Sucrose와 glucose가 첨가된 배지에서 생육한 뿌리 모두 처리농도가 높아 질수록 절편당 유도되는 뿌리수는 증가하였으며, sucrose첨가 배지에서 높은 뿌리 유도율을 보였다(Fig. 4A). 정아 절편 유래 줄기를 10% sucrose첨가 배지에 배양하여 유도된 절편당 뿌리수는 평균 46.9개, 10% glucose처리 배지에서 평균 23개로 sucrose첨가 배지에서 2배 이상의 부정근이 유도되었다(Fig. 4A). 유도된 뿌리의 길이는 3% sucrose첨가 배지에서 평균 9 cm, 5%, 7% 그리고 10% sucrsoe처리에서는 각각 5.2 cm, 3.6 cm 3.4 cm로 농도가 증가할수록 뿌리의 길이는 신장은 감소하였다. Glucose처리에서는 농도가 증가 할수록 뿌리의 길이신장이 이루어졌다. 정아 절편을 재료로 3% glucose처리에서는 평균 뿌리길이 4.1 cm, 10%처리에서는 평균 6.5 cm로 고농도 glucose처리에서 1.5배 이상 뿌리의 길이신장이 이루어졌다(Fig. 4B). 쉽싸리의 기내뿌리유도를 위해서는 절편당 유도된 뿌리수와 뿌리길이는 sucrose가 첨가된 배지에서 현저히 높았다. 따라서 sucrose를 첨가한 배지에서 생육시키는 것이 발근효율을 높이기 위해 더 적합한 것으로 생각된다.

식물뿌리가 형성되는데 있어 당(sugar)은 중요한 요인으로 작용한다. 또한 탄소원의 종류와 농도는 식물체의 발근에 영향을 주며, 토양이식 및 순화를 위한 기내식물체의 품질 또한 탄소원 종류 및 농도를 바꿈으로써 개선할 수 있다. 본 연구에서는 sucrose처리에서 뿌리의 형성과 생육이 더 우수하였고, 농도가 증가함에 따라 식물체당 뿌리 유도수는 증가하였으나 뿌리의 길이는 감소하였다. 저농도 탄소원에 의한 낮은 삼투스트레스는 뿌리가 그 신호를 인지하여 삼투성 감소의 원인이 되는 abscisic acid-dependent signal(건조 혹은 염 스트레스 관련신호)을 지상부 조직으로 보내 배지로부터 sucrose의 흡수를 감소시켜 측근형성을 억제하며(MacGrego et al. 2008), 고농도의 탄소원 처리는 광합성관련 유전자의 발현을 억제하고 질소동화, 생육, 전분의 저장 및 이동과 관련된 유전자의 발현을 증가시킨다고 보고하였다(Thomas et al. 1994; Baier et al. 2004). 또한 광합성 광량자속 밀도(PPFD)가 감소하면 일차근의 길이 신장에 영향을 미치며, PPFD의 감소 직후 뿌리는 길이 신장을 멈추고 이차뿌리의 비율을 증가시킨다고 보고하고 있다(Muller et al. 1998). 따라서 고농도 탄소원처리에서 절편당 뿌리의 수가 증가한 이유는 스트레스로 인한 지상부의 광합성율이 저조해 지면서 뿌리의 길이 신장 보다 이차근의 생산비율이 증가하였기 때문으로 생각된다.

탄소급원이 순화에 미치는 영향

탄소급원의 종류 및 농도 그리고 절편 종류에 따른 쉽싸리의 순화에 미치는 영향을 확인하기 위해 인공상토에 기내식물체를 이식하여 60일 후 뿌리유도 및 식물체 생육을 조사하였다(Table 1). 절편당 유도된 비대근수는 정아절편과 액아절편 유래 식물체에서 모두 5% sucrose와 glucose처리에서 높은 유도수를 보였다. 5% sucrose처리 정아절편 유래 식물체의 비대근은 평균 2.8개, 액아절편 유래 식물체의 비대근은 평균 4개로 액아 절편유래 식물체에서 많은 비대근이 유도되었으며, 7% 이상 처리에서는 절편당 비대근수가 감소하였고, 10%처리에서는 비대근이 형성되지 못하고 뿌리가 괴사하였다(Table 1). 5% glucose 처리의 정아와 액아절편 유래 식물체에서는 각각 평균 5.3개로 가장 높은 수의 비대근이 유도되었다(Table 1). 한편 유도된 비대근의 길이는 sucrose와 glucose(액아절편 유래 식물체 제외) 5% 처리에서 생육한 식물체 비대근의 길이신장이 가장 좋았으나 5% 이상 농도에서 생육한 식물체에서는 비대근의 길이 신장이 억제되었다(Table 1). 순화 후 유도된 비대근의 직경은 뿌리가 형성되지 않은 10% sucrose 처리 유래 식물체를 제외하고 탄소급원 종류 및 처리농도 간 유의적인 차이를 보이지 않았다(Table 1). 순화 후 식물체의 줄기 길이는 5% sucrose와 glucose 처리에서 정아와 액아 절편 유래 식물체 모두 17~20 cm로 건전한 줄기의 길이 생육이 이루어졌고, 정아절편 유래 순화묘의 줄기의 길이 생육이 더 좋았다(Table 1). 탄소급원 처리에 따른 순화 후 생존율은 3% sucrose 첨가 배지 생육 식물체는 100% 생존하였으나 5% sucrose 처리 식물체는 1/3이상 생존율이 감소하였고 10%의 고농도 sucrose처리 기내식물체는 순화 후 모두 고사하였다(Fig. 5 and Table 2). Glucose 첨가 배지에서 자란 기내 식물체는 모든 처리농도에서 순화 후 100% 생존하였다(Table 2). 고농도의 탄소원 처리는 배양환경에 있어 기내식물체의 광합성에 제약을 주는 요인 중 하나이다(Hazarika 2003). 지속적인 탄소원의 인위적 공급은 기내식물체 광합성기구의 발달을 불필요하게 만든다. 따라서 기내배양식물체는 엽록소함량이 낮거나 ribulose biphoshate carboxylase (RubPcase)와 같은 광합성 관련 효소 반응이 없거나 낮으며 이러한 낮은 RubPcase활성의 이유는 잎의 발달과정 중에 sucrose를 첨가했기 때문일 것이라 보고하고 있다(Donnelly and Vidaver 1984). 따라서 기내식물체의 순화 시 고농도의 탄소원 처리는 외부생존을 위한 광합성기구의 형성을 방해하여 순화 시 생장율과 생존율의 저하를 가져오며 본 연구결과에서도 이러한 이유로 인해 고농도 탄소원처리에서 생육한 기내식물체의 순화율이 저조해 진 것으로 사료된다.

Table 1 . Effects of carbohydrates and explant position on the growth of plantlets and root thickening after 60 days of acclimatization.

Carbon source (%)		Explant position	No. of thickening roots/explant	Length of thickening root (cm)	Diameter of thickening root (mm)	Shoot length (cm)
Sucrose	3	Apical bud	1.7 ± 0.3 abz	1.96 ± 0.9 ab	1.23 ± 0.2 a	17.7 ± 1.0 ab
	5		2.8 ± 1.0 ab	2.10 ± 0.7 ab	1.11 ± 0.2 a	20.3 ± 3.9 a
	7		2.0 ± 0.8 ab	0.5 ± 0.1 de	1.25 ± 0.3 a	11.3 ± 2.1 cd
	10		N b	N e	N b	7.5 ± 1.4 d
	3	Axillary bud	2.3 ±0.8 ab	1.70 ± 0.9 bc	1.08 ± 0.3 a	14.6 ± 2.9 bc
	5		4.0 ± 1.0 a	2.50 ± 1.1 a	1.11 ± 0.4 a	18.7 ± 0.6 ab
	7		1.0 ± 0.4 ab	1.80 ± 0.8 bc	0.77 ± 0.2 ab	8.3 ± 1.8 d
	10		N b	N e	N b	6.5 ± 0.5 d
Glucose	3	Apical bud	3.2 ±1.3 ab	1.03 ± 0.5 cde	0.85 ± 0.3 a	13.1 ± 0.8 bc
	5		5.3 ±1.5 a	2.21 ± 1.0 ab	1.15 ± 0.2 a	21.0 ± 1.3 a
	7		2.0 ± 1.0 ab	1.55 ± 0.7 bcd	1.15 ± 0.2 a	15.7 ± 0.8 bcd
	10		3.0 ± 0.8 ab	1.21 ± 0.4 bcd	1.13 ± 0.3 a	18.9 ± 2.5 a
	3	Axillary bud	2.4 ± 0.9 ab	1.8 ± 0.8 bc	1.02 ± 0.3 a	16.0 ± 2.9 bc
	5		5.3 ± 1.5 a	1.3 ± 0.6 bcd	0.87 ± 0.3 a	17.0 ± 4.4 ab
	7		5.3 ± 2.3 a	0.9 ± 0.3 cde	1.04 ± 0.2 a	14.2 ± 2.3 bc
	10		4.5 ± 1.1 a	0.92 ± 0.4 cde	0.96 ± 0.2 a	17.4 ± 2.0 ab

^zMean separation within columns by Duncan’s multi range test (P≤0.05)

Table 2 . Survival rate of Lycopus lucidus according to the different kinds and concentration of carbohydrates and position of explant after 60 days in acclimatization.

Carbon source	Conc. (%)	Survival rates (%)
		Explant of apical buds	Explant of axillary buds
Sucrose	3	100	100
	5	100	75
	7	33	33
	10	0	0
Glucose	3	100	100
	5	100	100
	7	100	100
	10	100	100

Figure 5.

Effect of carbon source (sucrose and glucose) concentration (3%, 5%, 7% and 10%) and position of bud (from apical and axillary bud) on the growth of plantlets of acclimatization after 60 days

순화 8주 후 유도된 쉽싸리의 뿌리는 완전한 형태의 비대근이 형성되지 않았으나(Fig. 6A), 이후 지상부가 시들고 월동을 거친 식물체에서만 완전한 형태의 비대근이 형성되었다(Fig. 6B). 따라서 쉽싸리의 비대근 형성은 탄소급원의 영향보다 저온 처리 등에 의해 비대근 형성이 영향을 받을 것으로 생각되며, 순화를 위한 기내식물체의 탄소원 처리농도는 sucrose 3~5%가 적정한 것으로 사료된다.

Figure 6.

Development of thickening roots after acclimatization. (A): thickening roots developed from lateral roots after 60 days, (B): formation of microtubers after wintering

본 연구는 기내 쉽싸리 식물체의 종류 및 농도별 탄소급원 처리를 통해 줄기, 뿌리 생육 및 비대근 형성과 순화에 미치는 효과를 연구하였다. 본 연구결과에서는 쉽싸리 식물체는 3~5% sucrose처리가 기내생육을 통한 증식과 순화 후 생장 및 생존을 위해 적정한 것으로 나타났다. 이전 연구에서는 더덕, 감자 및 고구마 등 비대근 및 비대경을 갖는 식물들은 기내배양 시 고농도 탄소원처리 배지에서 부정근이 비대해지며 기내비대근(microtuber)이 형성되었으나(Kim et al. 2013), 기내 쉽싸리 식물체는 고농도 탄소원 처리에서도 기내 비대근이 형성되지 않고 기외순화 후 휴면(저온처리)이 이루어 진 후 완전한 형태의 비대근이 형성되어 저온처리를 통한 비대근형성에 관한 연구가 더 이루어져야 할 것으로 사료된다. 이 연구결과는 향후 새로운 천연물 원료로 가치가 있는 쉽싸리의 기내증식을 통한 천연물 생산의 재료 공급 및 이와 관련된 연구를 위한 기반 기술로 활용될 수 있을 것이다.

본 연구에서는 쉽싸리의 재분화와 순화에 영향을 주는 탄소급원의 효과에 관한 연구를 수행하였다. 식물체 재분화는 1/2MS 배지에 3~10%의 sucrose와 glucose를 각각 다른 농도로 처리하여 재분화를 유도하였다. 그 결과 3%와 5% sucrose처리에서 줄기증식과 발근이 증가되었으며, 고농도 처리에서는 줄기와 뿌리 길이 등의 생육이 억제되었다. 기외 순화 중 3% 혹은 5% sucrose 처리 배지에서 생육한 식물체의 뿌리비대, 뿌리길이, 줄기 길이 및 생존율은 glucose 및 다른 농도처리와 비교하여 가장 높게 나타났다. 따라서 3% 및 5% sucrose 처리는 쉽싸리의 기내 생육과 순화를 위해 가장 적정한 농도로 확인되었다.