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J Plant Biotechnol 2019; 46(2): 127-135

Published online June 30, 2019

https://doi.org/10.5010/JPB.2019.46.2.127

© The Korean Society of Plant Biotechnology

하월시아 옥선(Haworthia truncata)의 기내 대량 증식 및 순화 조건 구명

김윤희 · 이지영 · 김혜형 · 이재홍 · 정재홍 · 이상덕

경기도농업기술원 선인장다육식물연구소,
경기도농업기술원 원예연구과

Received: 13 April 2019; Revised: 10 May 2019; Accepted: 16 May 2019

In vitro mass propagation and acclimatization of Haworthia truncata

Youn Hee Kim · Gee Young Lee · Hye Hyeong Kim · Jae Hong Lee · Jae Hong Jung · Sang Deok Lee

Author Info. +

Cactus and Succulents Research Institute, Gyeonggi-do Agricultural Research and Extension Services, Goyang, 10224, Korea,
Horticultural Research Division, Gyeonggi-Do Agricultural Research and Extension Services, Hwaseong, 18388, Korea

Correspondence to : e-mail : sky3884@gg.go.kr

Received: 13 April 2019; Revised: 10 May 2019; Accepted: 16 May 2019

This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

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The purpose of this study was to investigate suitable parts for callus induction and optimal concentrations of growth regulators, contained in the medium affecting shoot and rooting for in vitro mass production of Haworthia truncata. Leaves and flower bud showed 100% callus formation rate at NAA 1~2 mgL-1 treatment, and NAA 1 mgL-1 + TDZ 2 mgL-1 treatment. The flower stalk showed 75% callus formation rate, at NAA 2 mgL-1 + TDZ 2 mgL-1 treatment in H. truncata. While the rate of callus formation was high in leaves and flower bud, leaves were the most efficient in obtaining most culture parts. Shoot induction rate from callus was highest, at NAA 0.1 mgL-1 treatment in H. truncata. Additionally, the number of shoots formation was 66.3 shoots high, in NAA 1 mg L-1 + BA 0.1 mgL-1 treatment in H. truncata. In the case of acclimatization of regenerated plant, growth characteristics did not show significant difference (95%) shading with respect to the different ratio of substrate mixture, and it was determined that would be appropriate, considering plant height and appearance preference of H. truncata. It was established that optimization of culture condition, was responsible for mass propagation in vitro cultures of H. truncata.

Keywords Haworthia, Growth regulators, Propagation, Regenerated shoot, Acclimatization

서 론

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하월시아(Haworthia)의 원산지는 남아프리카로 카루(Karroo)고원 등지에 많은 종이 분포되어 있으며, 대부분 내음성이 강하여 실내에 적합한 다육식물이다. 최근 국내 소비가 증가하고 있으며 잎이 단단하고 다양한 색상을 지니고 있어 관상가치가 높다.

하월시아 중 생장속도가 느린종으로 만상(H. maughanii), 옥선(H. truncata), 픽타(H. picta), 스플렌스(H. splendense) 등이 있으며, 이들은 종자에서 성체까지 7~8년정도 소요된다. 이 중 옥선(Haworthiatruncata)은 증식율이 낮고, 영양번식이 어려운 것으로 알려져 있으며, 엽은 창의 형태를 가진 긴 직사각형, 모서리가 굴곡진 종 등으로 아주 독특한 구조로 이루어졌다(Lee 2015). Guadalupe 등(1999)은 자연상태에서 번식이 어려운 식물들의 대량증식 방법으로 조직배양을 제시하였으며, 배양 기술에 따라 종묘의 대량생산 가능성을 시사하였다.

지금까지 하월시아를 이용한 기내배양연구는 부정아 발생 유도(Majumdar & Sabharwal 1968), 자방벽을 이용한 재분화 연구(Majurndar 1970), 캘러스 형성 및 재분화 조건 확립(Yasunari 1979; Hayashi 1987), 체세포 배발생 연구(Mycock et al. 1997) 등이 알려져 있으며 국내에서는 하월시아에 대한 기내번식에 대한 연구가 미미한 실정이다.

또한, 기내 식물체는 작고 밀폐된 공간에서 생장하기 때문에 일반 식물체에 비해 큐티클 왁스층의 감소, 기공 개폐기능의 부족 등 표피조직과 엽육조직의 발달이 미약한 상태여서 토양 이식 후 순화과정이 필요한 실정이다(Li et al. 2005).

따라서 본 연구에서는 하월시아 옥선(H. truncata)의 캘러스 배양 조건, 재분화 배양 조건 등 기내 대량 증식 조건을 확립하고, 이를 통해 얻어진 재분화 식물체의 순화 조건 구명을 통해 균일하고 안정적인 대량번식시스템을 확립하고자 수행하였다.

재료 및 방법

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식물재료 및 배양조건

본 연구의 시험재료인 하월시아 옥선(H. truncata)은 경기도 고양시 지역의 농가 수집하였으며 경기도농업기술원 선인장다육식물연구소에서 관리하여 사용하였다. 실험에 사용한 식물재료인 잎, 화뢰 및 화경은 흐르는 수돗물에 2~3회 세척하였으며 70% 에탄올에 30초간 소독, 증류수 수세를 3회 반복하여 Tween-20을 첨가한 0.3% NaOCl 용액에 표면살균하고 교반 처리하였다. 배양환경으로 명 배양 1일 16시간 조명, 광도 60 ± 0.2 µmol/m2/s, 온도 25 ± 2°C로 유지되는 조건에서 배양하였으며 4주 간격으로 계대 배양하였다.

배지 조제

기본배지로 MS (Murashige and Skoog, 1962)에 3% sucrose와 0.7% agar를 첨가한 후 pH는 5.7 ± 0.1로 조정하였다. 실험에 사용한 배지는 121°C, 1.5기압으로 15분간 고압 멸균하였고 페트리디쉬(100 × 40 mm)에 분주하여 사용하였다.

캘러스 유도

캘러스 유도에 적합한 배양부위를 선발하고자 잎 0.5~1.0 cm, 화경 0.5~1.0 cm, 화뢰 2 cm로 절단하여 이용하였고, 옥신류인 NAA (Naphthaleneacetic acid)와 사이토키닌류인 TDZ (Thidiazuron)를 각각 0, 1, 2 mgL-1의 농도로 처리하였다. 잎 절편, 화경, 화뢰는 각 처리 당 4개씩 15반복하여 치상하였으며 배양 16주 후 캘러스 형성율을 조사하였다.

Shoot 재분화

신초 유도에 적합한 생장조정제의 농도를 구명하기 위해 0.5 × 0.5 cm의 캘러스를 절단하여 NAA 0, 0.01, 0.1, 0.2 mgL-1와 BA 0, 0.5, 1, 1.5, 3 mgL-1를 각각의 농도별로 조합 처리한 배지에서 shoot 재분화를 유도하였다. 각 처리별 4개씩 15반복으로 치상하였으며 배양 23주 후 신초 발생율을 조사하였다.

Multiple shoot 및 뿌리 유도

신초의 증식과 발근에 적합한 생장조정제의 농도를 구명하기 위해 뿌리를 절단한 약 2 cm의 길이로 자른 신초를 NAA 0, 0.1, 1 mgL-1와 BA 0, 0.1, 1, 2, 4 mgL-1를 각각의 농도별로 치상하여 신초 증식(Multiple shoot)과 뿌리를 유도하였다. 각각 페트리디쉬(100 × 40 mm)에 4주씩 15반복 치상 하였고, 4주 간격으로 계대배양을 하여 배양 16주 후 완전한 식물체로 판단되는 신초의 증식 개체수와 발근율을 조사하였다.

토양 이식 및 순화

기내배양 식물체의 순화 조건을 구명하기 위하여 피트모스 등 혼합 용토 4종류와 흑색 차광막 4수준(35%, 55%, 75%, 95%)으로 처리를 하였다. 식물체를 정식하기 전에 차광 55%에서 1일간 배양병의 뚜껑을 열어 경화시킨 후 배지를 흐르는 물에 깨끗이 씻은 뒤 피트모스 등 혼합 용토에 정식하였다.

혼합용토는 질석:펄라이트=1:1, 질석:펄라이트 :피트모스=1:1:1, 마사:펄라이트=1:1, 마사:펄라이트:피트모스=1:1:1, 차광막은 흑색 차광막 35, 55, 75, 95%를 4수준으로 처리하였다. 순화된 5 cm 정도의 재분화 식물체는 20주씩 5반복하여 습도 64 ± 2%, 온도 23 ± 2°C 환경조건에서 정식 3주 후에 조사하였다.

결과 및 고찰

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캘러스 유도

캘러스 유도에 적합한 배양부위 선발 및 생장조정제의 적정 농도를 구명하기 위하여 옥선(H. truncata)의 잎, 화뢰, 화경을 재료로 NAA와 TDZ를 혼용처리하여 배양한 결과는 Table 1과 같다.

Table 1 Effect of growth regulators on callus formation, from in vitro different plant part (leaf flower bud, flower stalk) of Haworthia truncata

Growth regulators (mg•L-1)Callus formation of plant partsa
NAATDZLeaf segmentFlower budFlower stalk
PercentagePercentagePercentage
0020.3eb55.6c19.4c
0120.3e61.1bc2.8c
0220.3e47.2c4.2c
10100a93.1ab41.7bc
1172.5d100a4.2c
1280.2c100a40.3bc
20100a100a15.3c
21100a100a52.5b
2290.5b100a75.0a

aCultured on MS medium, containing various plant growth regulators for 16 weeks.

bMean separation within columns, by Duncan’s multi range test (P=0.05).

잎 절편을 배양하였을 때 NAA 1~2 mgL-1 단용배지에서 캘러스 형성율이 100%로 가장 높았으며, 배양일이 경과될수록 캘러스의 증식이 왕성하고 녹색의 단단한 캘러스로 변하였다(Fig. 1A). 반면, 무처리와 TDZ 단용배지에서는 잎의 기부에서만 캘러스가 형성되는 경향을 보였는데, 이는 절편 기부에 형성되는 캘러스는 절편의 양분 및 생장조정제의 저장기능을 담당한다는 연구결과(Vieitez et al. 1989)와 유사하였다. 반면, NAA와 TDZ 혼용배지에서는 캘러스와 shoot가 함께 형성되었으나, 신초가 부풀어 오르며 비정상적인 신초가 발생되는 경향을 보였다(사진 미제시). 하월시아 만상(H. maughanii)의 경우 잎 절편을 배양하였을 때 NAA 1 mgL-1 + TDZ 1~2 mgL-1 혼용배지에서 캘러스가 100% 형성된 연구가 보고(Kim et al. 2018)된 바 있으며 본 연구에서 옥선(H. truncata)의 잎 절편에서는 NAA 1~2 mgL-1 단용배지가 캘러스 형성율이 가장 높은 결과로 나타났다.

Fig. 1.

Effect of plant growth regulators on callus induction from leaves, flower bud, and flower stalk of Haworthia truncata. (A) Explants were cultured on MS medium, supplemented without growth regulators with 1 mgL-1 NAA; (B) With 1 mgL-1 NAA and 2 mgL-1 TDZ; (C) With 2 mgL-1 NAA and 2 mgL-1 TDZ



화뢰를 배양 하였을 때 전반적으로 초기에 캘러스 형성율은 높았으나, 시간이 지나면서 캘러스의 증식은 매우 저조하였다(사진 미제시). 이 중에서 NAA 1 mgL-1 + TDZ 2 mgL-1 혼용배지에서 캘러스와 shoot 생육이 양호한 경향을 보였다(Fig. 1B). 화경을 배양 하였을 경우에는 TDZ 단용배지에서는 캘러스가 일부 형성되었지만 배양일이 경과할수록 화경의 엽록소가 없어지는 백화현상(白化現象)을 보였으며, 전반적으로 캘러스의 증식은 저조하였다. 이 중 NAA 2 mgL-1 + TDZ 2 mgL-1의 혼용 배지에서 75%의 녹색의 캘러스가 형성되었다(Fig. 1C). 이러한 결과는 식물 배양 부위와 식물생장조정제의 농도에 따라 캘러스 형성이 크게 다른 것으로 생각된다.

배지에 첨가하는 생장조정제의 종류와 농도에 따라 캘러스 형성 양상이 크게 다르게 나타나는데(Ryu et al. 1992) 캘러스 유도와 생장에는 세포의 생장과 분열을 촉진하는 옥신이 필수적이며, 사이토키닌은 세포 분화를 촉진하는 작용을 한다고 보고되고 있다(Delvlin 1975; Skoog et al. 1965).

돌나물과 sedum속 식물인 둥근잎꿩의비름(Sedum rotundifolium)의 잎 절편체가 화뢰에 비해 캘러스 유도율이 높았으며 NAA 1~2 mgL-1 + BA 1 mgL-1 혼용배지에서 100% 캘러스가 형성된 연구보고(Kwon and Yoon 2010), 참시호(Bupleurum spp)의 경우 유엽은 65%, 화뢰는 44% 캘러스 형성을 보인 연구보고(Park et al. 1994), 섬시호(Bupleurum latissimum)의 기내번식 캘러스 유도에서 잎, 엽병보다 화뢰에서 2,4-D 2.0 mgL-1 단용배지에서 71.6%의 캘러스 형성을 보인 연구보고 (Kim 2007), 금낭화(Dicentra spectabillis) 캘러스 유도 및 식물체 재분화 연구에서는 액아가 잎과 줄기에 비해 캘러스 형성율이 높았으며 2,4-D 0.1 mgL-1 + TDZ 2 mgL-1 혼용배지에서 94~100%의 캘러스가 형성된 연구보고(Hyun et al. 2001), 무스카리(Muscari armeniacum)의 잎, 화경, 인편, 뿌리를 조직배양 하였을 때 캘러스 형성율이 잎이 가장 적합한 연구결과가 보고(Suzuki and M. Nakano 2001), Chung and Cho (2002)의 연구에서는 도라지를 잎, 줄기 및 뿌리의 조직 절편 부위별 캘러스 유도 결과 줄기나 뿌리의 절편체 보다도 잎 절편체를 치상시 캘러스 유도가 잘 되었다고 연구보고, 희수나무(Camptotheca acuminata Decaisne)의 자엽, 배축, 뿌리의 조직절편부위별 캘러스 유도 결과 배축이 가장 많은 캘러스가 형성되었다는 연구보고(Bae 2009)한 바 있다. 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 잎 절편으로부터 캘러스 형성에 있어서는 NAA 100 mgL-1 단용배지에서 가장 많은 캘러스 형성이 가장 우수한 연구보고(Kim and Han 2003), 하월시아 만상(H. maughanii)은 잎은 NAA 1 mgL-1 + TDZ 1 mgL-1, 화뢰는 NAA 1 mgL-1 + TDZ 2 mgL-1, 화경은 NAA 1 mgL-1 이상의 단용처리에서 캘러스 형성율이 가장 높은 것으로 연구결과가 보고(Kim et al. 2018)되었다. 반면 옥선(H. truncata)의 잎은 NAA 1~2 mgL-1 단용처리, 화뢰 배양시 NAA 1 mgL-1 + TDZ 2 mgL-1, 화경은 NAA 2 mgL-1 + TDZ 2 mgL-1 혼용배지에서 캘러스 형성율이 높은 결과를 보였으며, 옥선(H. truncata)의 잎, 화뢰, 화경을 배양한 경우, 모든 부위에서 캘러스 형성은 되었으나 가장 많은 배양절편 확보가 가능한 잎 절편이 가장 효율적으로 판단되었다.

Fig. 2.

Effect of plant growth regulators, on shoot formation from callus of Haworthia truncata. (A) Explants were cultured on MS medium, supplemented without growth regulators; (B) With 0.5 mgL-1 BA; (C) 1 mgL-1 BA; (D) 1.5 mgL-1 BA (E) 3 mgL-1 BA; (F) 0.01 mgL-1 NAA; (G) 0.01 mgL-1 NAA and 0.5 mgL-1 BA; (H) 0.01 mgL-1 NAA and 1 mgL-1 BA; (I) 0.01 mgL-1 NAA and 1.5 mgL-1 BA; (J) 0.01 mgL-1 NAA and 3 mgL-1 BA; (K) 0.1 mgL-1 NAA; (L) 0.1 mgL-1 NAA and 0.5 mgL-1 BA; (M) 0.1 mgL-1 NAA and 1 mgL-1 BA; (N) 0.1 mgL-1 NAA and 1.5 mgL-1 BA; (O) 0.1 mgL-1 NAA and 3 mgL-1 BA; (P) 0.2 mgL-1 NAA; (Q) 0.2 mgL-1 NAA and 0.5 mgL-1 BA; (R) 0.2 mgL-1 NAA and 1 mgL-1 BA; (S) 0.2 mgL-1 NAA and 1.5 mgL-1 BA; (T) 0.2 mgL-1 NAA and 3 mgL-1 BA; respectively, in vitro culture for 23 weeks



Shoot 재분화

캘러스로부터 shoot 재분화에 적합한 생장조정제의 농도를 선발하고자 NAA와 BA 를 조합 처리한 결과는 Table 2와 같다. 배양 10주 후 캘러스로부터 shoot 발생이 관찰되었으며, 캘러스로부터 shoot가 형성된 처리구는 NAA 0.1 mgL-1 단용배지, NAA 0.2 mgL-1 단용배지에서 각각 24.2개, 17.1개의 shoot가 발생하였다. 반면 나머지 처리에서는 모두 캘러스만 증식 될 뿐 shoot는 발생하지 않았다. 특히 NAA 0.1 mgL-1 단용배지에서 shoot 발생이 가장 많고 발생된 shoot도 정상적인 생장을 보여 shoot유도에 적합한 배지로 판단되었으며(Table 2 and Fig. 4). 이러한 결과는 캘러스로부터 직접 식물재생이 가능하다는 연구 보고와는 일치하는 것이다(Collins et al. 1978;Furmanowa et al. 1997).

Table 2 Effect of plant growth regulators, on shoot formation from callus of Haworthia truncata

Growth regulators (mgL-1)a
NAABANumber of shoots/callusShoot length (cm)
000cb0b
00.50c0b
010c0b
01.50c0b
030c0b
0.0100c0b
0.010.50c0b
0.0110c0b
0.011.50c0b
0.0130c0b
0.1024.2a0.5a
0.10.50c0
0.110c0b
0.11.50c0b
0.130c0b
0.2017.1b0.4a
0.20.50c0b
0.210c0b
0.21.50c0b
0.230c0b

aCultured on MS medium, containing various plant growth regulators for 23 weeks.

bMean separation within columns, by Duncan’s multi range test (P=0.05).
Fig. 3.

Effect of plant growth regulators, on multiple shoot induction from shoot of Haworthia truncata. (A) Explants were cultured on MS medium, supplemented without growth regulators; (B) With 0.1 mgL-1 BA; (C) 1 mgL-1 BA; (D) 2 mgL-1 BA (E) 4 mgL-1 BA; (F) 0.1 mgL-1 NAA; (G) 0.1 mgL-1 NAA and 0.1 mgL-1 BA; (H) 0.1 mgL-1 NAA and 1 mgL-1 BA; (I) 0.1 mgL-1 NAA and 2 mgL-1 BA; (J) 0.1 mgL-1 NAA and 4 mgL-1 BA; (K) 1 mgL-1 NAA; (L) 1 mgL-1 NAA and 0.1 mgL-1 BA; (M) 1 mgL-1 NAA and 1 mgL-1 BA; (N) 1 mgL-1 NAA and 2 mgL-1 BA; (O) 1 mgL-1 NAA and 4 mgL-1 BA; respectively, in vitro culture for 16 weeks


Fig. 4.

Acclimatization of regenerated H. truncata in the soils. (A) Vermiculite:perlite=1:1 (v:v); (B) Vermiculite: perlite: peatmoss= 1:1:1 (v:v:v); (C) Sandy soil: perlite=1:1 (v:v); (D) Sandy soil: perlite: peatmoss=1:1:1 (v:v:v)



일반적으로 조직배양을 통한 식물체의 분화 및 탈분화는 식물의 종과 같은 종이라도 품종 및 계통에 따라서 분화능력에 변화를 보이는 등 모식물의 유전자형이나 배양에 이용되는 조직부위에 중요한 영향을 끼치며, 배지의 조성과 방법에 따라 분화의 능력은 차이를 보인다(Datta et al. 1990; Koetje et al. 1989).

자운영(Astragalus sinicus)의 캘러스로부터 shoot 형성에는 BA가 효과적이었으며 2,4-D 1.0 mgL-1 + BA 0.5 mgL-1 혼용배지에서 15.0개의 shoot를 형성한 연구보고(Park and Choi 2015), 맥문동(Liriope platyphylla)의 캘러스로부터 식물체 재분화를 위해서 NAA 0.5 mgL-1 + BA 2 mgL-1 혼용배지에서 34.2%로 가장 높은 재분화율을 보인 연구결과가(Kim et al. 1996) 보고 되었다.

반면, 본 연구결과에서는 옥선(H. truncata) 캘러스 배양에서는 NAA 0.1 mgL-1 단용배지에서 24.2개의 shoot가 발생하였으며, 하월시아 만상(H. maughanii)의 기내 대량증식 연구(Kim et al. 2018)에서 NAA 0.1 mgL-1 단용배지에서 22.0개의 shoot 유도가 보인 연구 보고와 에케베리아 엘레강스(Echeveria elegans)의 shoot 재분화 연구에서 NAA 0.3 mgL-1 단용배지에서 7.3%의 shoot 형성율을 보인 연구결과(Kim et al. 2019)와 같은 경향으로, 옥선(H. truncata)의 경우에도 만상(H. maughanii)의 경우와 마찬가지로 캘러스에서 shoot 재분화 효율을 높이는 데 사이토키닌이 shoot 분화에 영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다.

Multiple shoot 및 뿌리 유도

캘러스로부터 유도된 shoot를 이용하여 shoot의 증식과 발근 유도를 위해 NAA와 BA를 MS배지에 단용과 혼용 처리하여 배양한 결과는 Table 3과 같다. 배양 3주 후부터, 새로운 shoot 발생이 관찰되었고 일부 처리에서는 치상된 shoot로부터 발근이 시작되었다. 옥선(H. truncata)의 multiple shoot은 BA 0.1~1 mgL-1 단용배지, NAA 0.1~1 mgL-1 단용배지, NAA 0.1 mgL-1 + BA 0.1 mgL-1 혼용배지 NAA 0.1 mgL-1 + BA 1 mgL-1 혼용배지, NAA 1 mgL-1 + BA 0.1 mgL-1 혼용배지에서 각각 22.3, 37.6, 40.0, 32.1, 51.5, 35.6, 66.3개의 multiple shoot가 발생되었고 shoot 길이는 0.8~1.3 cm의 범위였다. 생장조정제가 처리되지 않는 무처리에서는 multiple shoot가 전혀 발생되지 않았으며, shoot가 녹색에서 갈변하여 고사되는 경향을 보였다. 또한 BA 2 mgL-1 이상의 단용 및 처리구에서는 shoot가 부풀어 기형으로 변화되어 정상적인 개체로 증식되지 못하였다(Fig. 3).

Table 3 Effects of plant growth regulators, on multiple shoot formation and rooting formation from explant of Haworthia truncata

Growth regulators(mgL-1)a
NAABANumber of multiple shoots (per explant)Multiple shoot length (cm)Root formation rate (%)
000fb0c0e
00.122.3e0.8b50c
0137.6cd0.9b35d
020f0c0e
040f0c0e
0.1040.0c1.2a100a
0.10.151.5b1.3a100a
0.1135.6cd0.9b80b
0.120f0c0e
0.140f0c0e
1032.1d1.1a100a
10.166.3a1.1a100a
110f0c0e
120f0c0e
140f0c0e

aCultured on MS medium, containing various plant growth regulators for 16 weeks.

bMean separation within columns, by Duncan’s multi range test (P=0.05).

Park 등 (1998)의 지황(Rehmannia glutinosa)의 재분화 식물체로부터 MS배지에 NAA 0.2 mgL-1 + BA 0.5 mgL-1 혼용배지에서 3.4개의 multiple shoot를 얻은 연구보고, 하월시아 만상(H. maughanii)의 NAA 0.1 mgL-1 + BA 1 mgL-1 혼용배지가 16.3개의 shoot 증식을 보인 연구보고(Kim et al. 2018), 에케베리아 엘레강스(Echeveria elegans)의 대량 증식 연구에서 NAA 1 mgL-1 + BA 0.1 mgL-1 혼용 배지에서 12.0개의 shoot 증식을 보인 연구결과(Kim et al. 2019)와 마찬가지로 본 연구에서도 NAA 1 mgL-1 + BA 0.1 mgL-1 혼용 처리구에서 66.3개의 shoot 증식을 보여 NAA와 BA 혼용 처리구에서 shoot 증식에 가장 효율적인 것으로 판단되었다.

옥신류의 식물호르몬은 발근 유도에 직접 영향을 끼치는 것으로 널리 알려져 있으며(Scott 1972), 시클라멘(Cyclamen percicum Mill.)의 shoot로부터 발근을 유도하기 위해서는 IBA 단용배지가 NAA 단용배지보다 효과적인 것으로 연구보고(Han 2000), 백하수오(Cynanchum wilfordii)와 장백도라지(Platycodon grandiflorum)의 발근 유도에는 NAA가 IBA보다 효과적인 것으로 연구보고(Lee et al. 2011; Han et al. 2014)되었으나, 옥선(H. truncata)의 발근 유도에는 NAA 0.1~1 mgL-1 단용배지와 NAA 0.1 mgL-1 + BA 0.1 mgL-1, NAA 1 mgL-1 + BA 0.1 mgL-1 혼용배지에서 100% 발근을 보였으며, BA 2 mgL-1 이상인 배지에서는 발근이 이루어지지 않아 고농도 BA 첨가배지에서는 뿌리 형성이 적합하지 않은 것으로 판단되었다. 또한 생장조정제가 처리되지 않은 배지에서는 발근이 직근의 실뿌리가 되었으며, NAA 단용배지에서는 배양 4주부터 흰색의 굵은 뿌리가 형성됨을 관찰할 수 있었다(사진 미제시).

일반적으로 기내 식물체의 발근은 저농도의 옥신 처리가 요구되지만(Boggetti et al. 1999) 내생 옥신(endogenous auxin)함량이 많은 식물체의 경우 옥신류 무첨가배지에서도 발근이 잘 이루어지는 것으로 알려져 있다(Park et al. 2018). 옥선(H. truncata)의 발근은 생장조정제가 처리되지 않은 배지에서 100% 발근을 보여 옥선(H. truncata)의 경우도 내생 옥신이 많은 것으로 판단되며 종에 따라 옥신 농도가 기내 발근에 미치는 결과가 매우 다양하게 나타남을 알 수 있었다.

따라서 NAA 1 mgL-1 + BA 0.1 mgL-1 혼용처리가 100% 발근과 66.3개의 multiple shoot를 형성 하였고, 형성된 shoot가 정상적인 생육을 유지하여 multiple shoot 형성 및 발근 유도에 적합한 처리로 판단하였다.

식물체 순화

재분화 식물체의 기외 순화조건을 구명하기 위해 피트모스 등 혼합 용토와 차광막 35, 55, 75, 95%의 4수준으로 처리한 결과는 Table 4와 같다. 옥선(H. truncata)의 재분화된 식물체를 흑색 차광 55%에서 1일간 배양병을 열어 경화시킨 후 흰색의 굵은 뿌리를 깨끗이 세척하였으며 정식 3일 후부터, 차광 정도가 낮은 처리에서는 녹색의 shoot가 갈변되는 현상이 관찰되었다(사진 미제시).

Table 4 Effect of Haworthia truncata growth, on different mixed soils media

Shading level (%) TreatmentaPlant height (cm)Plant width (cm)Plant thickness (mm)Survival rate (%)
35Vermiculite: perlite=1:12.12.13.200
Vermiculite: perlite: peatmoss=1:1:12.22.32.100
Sandy soil: perlite=1:12.02.03.000
Sandy soil: perlite: peatmoss=1:1:12.42.62.800
55Vermiculite: perlite=1:12.32.33.100
Vermiculite: perlite: peatmoss=1:1:12.12.23.300
Sandy soil: perlite=1:12.62.63.100
Sandy soil: perlite: peatmoss=1:1:12.42.43.600
75Vermiculite: perlite=1:12.12.23.530
Vermiculite: perlite: peatmoss=1:1:12.32.33.730
Sandy soil: perlite=1:12.32.33.630
Sandy soil: perlite: peatmoss=1:1:12.32.22.930
95Vermiculite: perlite=1:12.42.54.4100
Vermiculite: perlite: peatmoss=1:1:12.72.64.3100
Sandy soil: perlite=1:12.52.64.5100
Sandy soil: perlite: peatmoss=1:1:12.52.74.1100
Shading********
Soilnsnsnsns
Shading*Soilnsnsnsns

aCultured on containing different soil for three weeks.

b Mean separation within columns, by Duncan’s multi range test (P=0.05).

c Non-significant or significant at P=0.05, respectively.

조직배양에 있어 기내에서 성공적인 증식이 가능하다 할지라도 기외에서 환경에 적응하여 정상적으로 생장하는 것이 중요하다. Grout and Aston(1977)는 기내에서 배양된 식물체의 잎은 표면에 Wax층이 덜 발달되어 있다고 하였으며, 기내 배양된 식물체의 엽육 세포에 공기층이 많아 기외에 이식한 후에 과다한 증산에 의해 마르고 결국은 죽게 된다고 하였다(Brainerd et al 1981;Fuchigami et al. 1981).

옥선(H. truncata)의 재분화 식물체를 순화 용토에 이식하여 이식 후 3주 후에는 용토 간에는 초장, 초폭, 엽두께의 생육에 큰 차이를 보이지 않았으며, 차광막에 따른 재분화체 식물체 생육의 초장, 초폭, 엽두께가 유의하게 감소되었다. 차광막 95% 처리에서 고유의 엽색이 유지되고 100%의 생존율을 보였으며(Table 4, Fig. 4), 차광막 35~75% 처리에서는 녹색의 잎이 갈변 되었고, 0~30%의 생존율을 보였다. 일반적으로 하월시아 재배시 한여름 차광을 50% 차광을 유지하는데 반해, 기내 순화묘의 경우 재분화 식물체의 정상적인 생육 및 고유의 엽색유지를 위해서는 차광막 95%에서 순화하는 것이 적합할 것으로 판단되었다.

이러한 결과는 Bae 등(2012)은 돌나물과 sedum속 식물인 홍경천(Rhodiola sachalinesis)의 순화시험에서 피트모스와 펄라이트 혼합배양토와 펄라이트 단용 배양토 간의 이식 후 유묘의 생장이 차이가 없었다는 연구 결과와 유사한 반면, 내건성 식물인 비수리(Lespedeza cuneata)의 순화시험에서 상토에서 길이, 뿌리 생장이 가장 좋았으며 펄라이트에서 70%의 낮은 생존율을 보인 연구보고(Park et al. 2017), 장백도라지(Platycodon grandiflorum)의 순화 조건 연구에서는 상토(토실)에서 가장 좋은 결과를 나타냈으며, 연구에 이용된 모든 상토에서 100% 순화율을 보인 연구결과(Han et al. 2014), 홍경천(Rhodiola sachalinensis)의 재분화된 식물체는 피트모스와 모래가 1:1로 혼합된 상토에서 약 95%이상 정상적으로 순화된 연구결과(Bae et al. 2005)는 식물과 용토에 따라 순화조건이 다를 수 있다는 걸 보여주는 것이다.

적 요

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하월시아 옥선(Haworthia truncata)의 기내 대량생산을 위하여 캘러스 유도에 적합한 부위와 기내 재분화 조건을 확립하고, 형성된 식물체의 기외 순화조건을 구명하고자 본 연구를 수행하였다. 캘러스를 유도에 적합한 식물 부위를 구명하기 위해 잎, 화뢰, 화경을 이용하여 NAA와 TDZ의 농도를 달리하여 MS배지에 배양한 결과, 잎은 NAA 1~2 mgL-1 단용배지, 화뢰 NAA 1 mgL-1 + TDZ 2 mgL-1 혼용처리에서 100% 캘러스 형성율을 보였으며, 화경 NAA 2 mgL-1 + TDZ 2 mgL-1 혼용처리에서 75% 캘러스 형성율을 나타냈으며 이 중 가장 많은 배양 절편체 확보가 가능한 잎이 옥선(H. truncata)의 대량증식에 가장 효율적일 것으로 판단되었다. Shoot 유도 배지로는 NAA 0.1mgL-1의 단용 처리구에서 다른 처리에 비해서 shoot가 24.2개로 shoot 발생이 가장 많았으며, shoot 증식(multiple shoot)은 NAA 1 mgL-1 + BA 0.1 mgL-1 혼용 처리구에서 multiple shoot가 66.3개로 가장 많이 형성되었다. 재분화 식물체의 기외 순화조건은 용토에 따라 생육에 큰 차이를 보이지 않았으나 식물체의 고유 엽색 유지, 엽장, 생존율을 고려하여 차광막 95%에서 순화 처리하는 것이 적합할 것으로 판단되었다. 이러한 결과는 최적의 기내 배양 조건 및 재분화 식물체 순화 조건 구명을 통해 번식이 어려운 옥선(H. truncata)의 균일하고 안정적인 대량생산이 가능할 것으로 기대된다.

사 사

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본 연구는 농촌진흥청 국제공동연구사업(과제번호: PJ0124 2901)의 지원으로 수행되었으며 이에 감사드립니다.

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Article

Research Article

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Published online June 30, 2019 https://doi.org/10.5010/JPB.2019.46.2.127

Copyright © The Korean Society of Plant Biotechnology.

하월시아 옥선(Haworthia truncata)의 기내 대량 증식 및 순화 조건 구명

김윤희 · 이지영 · 김혜형 · 이재홍 · 정재홍 · 이상덕

경기도농업기술원 선인장다육식물연구소,
경기도농업기술원 원예연구과

Received: 13 April 2019; Revised: 10 May 2019; Accepted: 16 May 2019

In vitro mass propagation and acclimatization of Haworthia truncata

Youn Hee Kim · Gee Young Lee · Hye Hyeong Kim · Jae Hong Lee · Jae Hong Jung · Sang Deok Lee

Cactus and Succulents Research Institute, Gyeonggi-do Agricultural Research and Extension Services, Goyang, 10224, Korea,
Horticultural Research Division, Gyeonggi-Do Agricultural Research and Extension Services, Hwaseong, 18388, Korea

Correspondence to:e-mail : sky3884@gg.go.kr

Received: 13 April 2019; Revised: 10 May 2019; Accepted: 16 May 2019

This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

The purpose of this study was to investigate suitable parts for callus induction and optimal concentrations of growth regulators, contained in the medium affecting shoot and rooting for in vitro mass production of Haworthia truncata. Leaves and flower bud showed 100% callus formation rate at NAA 1~2 mgL-1 treatment, and NAA 1 mgL-1 + TDZ 2 mgL-1 treatment. The flower stalk showed 75% callus formation rate, at NAA 2 mgL-1 + TDZ 2 mgL-1 treatment in H. truncata. While the rate of callus formation was high in leaves and flower bud, leaves were the most efficient in obtaining most culture parts. Shoot induction rate from callus was highest, at NAA 0.1 mgL-1 treatment in H. truncata. Additionally, the number of shoots formation was 66.3 shoots high, in NAA 1 mg L-1 + BA 0.1 mgL-1 treatment in H. truncata. In the case of acclimatization of regenerated plant, growth characteristics did not show significant difference (95%) shading with respect to the different ratio of substrate mixture, and it was determined that would be appropriate, considering plant height and appearance preference of H. truncata. It was established that optimization of culture condition, was responsible for mass propagation in vitro cultures of H. truncata.

Keywords: Haworthia, Growth regulators, Propagation, Regenerated shoot, Acclimatization

서 론

하월시아(Haworthia)의 원산지는 남아프리카로 카루(Karroo)고원 등지에 많은 종이 분포되어 있으며, 대부분 내음성이 강하여 실내에 적합한 다육식물이다. 최근 국내 소비가 증가하고 있으며 잎이 단단하고 다양한 색상을 지니고 있어 관상가치가 높다.

하월시아 중 생장속도가 느린종으로 만상(H. maughanii), 옥선(H. truncata), 픽타(H. picta), 스플렌스(H. splendense) 등이 있으며, 이들은 종자에서 성체까지 7~8년정도 소요된다. 이 중 옥선(Haworthiatruncata)은 증식율이 낮고, 영양번식이 어려운 것으로 알려져 있으며, 엽은 창의 형태를 가진 긴 직사각형, 모서리가 굴곡진 종 등으로 아주 독특한 구조로 이루어졌다(Lee 2015). Guadalupe 등(1999)은 자연상태에서 번식이 어려운 식물들의 대량증식 방법으로 조직배양을 제시하였으며, 배양 기술에 따라 종묘의 대량생산 가능성을 시사하였다.

지금까지 하월시아를 이용한 기내배양연구는 부정아 발생 유도(Majumdar & Sabharwal 1968), 자방벽을 이용한 재분화 연구(Majurndar 1970), 캘러스 형성 및 재분화 조건 확립(Yasunari 1979; Hayashi 1987), 체세포 배발생 연구(Mycock et al. 1997) 등이 알려져 있으며 국내에서는 하월시아에 대한 기내번식에 대한 연구가 미미한 실정이다.

또한, 기내 식물체는 작고 밀폐된 공간에서 생장하기 때문에 일반 식물체에 비해 큐티클 왁스층의 감소, 기공 개폐기능의 부족 등 표피조직과 엽육조직의 발달이 미약한 상태여서 토양 이식 후 순화과정이 필요한 실정이다(Li et al. 2005).

따라서 본 연구에서는 하월시아 옥선(H. truncata)의 캘러스 배양 조건, 재분화 배양 조건 등 기내 대량 증식 조건을 확립하고, 이를 통해 얻어진 재분화 식물체의 순화 조건 구명을 통해 균일하고 안정적인 대량번식시스템을 확립하고자 수행하였다.

재료 및 방법

식물재료 및 배양조건

본 연구의 시험재료인 하월시아 옥선(H. truncata)은 경기도 고양시 지역의 농가 수집하였으며 경기도농업기술원 선인장다육식물연구소에서 관리하여 사용하였다. 실험에 사용한 식물재료인 잎, 화뢰 및 화경은 흐르는 수돗물에 2~3회 세척하였으며 70% 에탄올에 30초간 소독, 증류수 수세를 3회 반복하여 Tween-20을 첨가한 0.3% NaOCl 용액에 표면살균하고 교반 처리하였다. 배양환경으로 명 배양 1일 16시간 조명, 광도 60 ± 0.2 µmol/m2/s, 온도 25 ± 2°C로 유지되는 조건에서 배양하였으며 4주 간격으로 계대 배양하였다.

배지 조제

기본배지로 MS (Murashige and Skoog, 1962)에 3% sucrose와 0.7% agar를 첨가한 후 pH는 5.7 ± 0.1로 조정하였다. 실험에 사용한 배지는 121°C, 1.5기압으로 15분간 고압 멸균하였고 페트리디쉬(100 × 40 mm)에 분주하여 사용하였다.

캘러스 유도

캘러스 유도에 적합한 배양부위를 선발하고자 잎 0.5~1.0 cm, 화경 0.5~1.0 cm, 화뢰 2 cm로 절단하여 이용하였고, 옥신류인 NAA (Naphthaleneacetic acid)와 사이토키닌류인 TDZ (Thidiazuron)를 각각 0, 1, 2 mgL-1의 농도로 처리하였다. 잎 절편, 화경, 화뢰는 각 처리 당 4개씩 15반복하여 치상하였으며 배양 16주 후 캘러스 형성율을 조사하였다.

Shoot 재분화

신초 유도에 적합한 생장조정제의 농도를 구명하기 위해 0.5 × 0.5 cm의 캘러스를 절단하여 NAA 0, 0.01, 0.1, 0.2 mgL-1와 BA 0, 0.5, 1, 1.5, 3 mgL-1를 각각의 농도별로 조합 처리한 배지에서 shoot 재분화를 유도하였다. 각 처리별 4개씩 15반복으로 치상하였으며 배양 23주 후 신초 발생율을 조사하였다.

Multiple shoot 및 뿌리 유도

신초의 증식과 발근에 적합한 생장조정제의 농도를 구명하기 위해 뿌리를 절단한 약 2 cm의 길이로 자른 신초를 NAA 0, 0.1, 1 mgL-1와 BA 0, 0.1, 1, 2, 4 mgL-1를 각각의 농도별로 치상하여 신초 증식(Multiple shoot)과 뿌리를 유도하였다. 각각 페트리디쉬(100 × 40 mm)에 4주씩 15반복 치상 하였고, 4주 간격으로 계대배양을 하여 배양 16주 후 완전한 식물체로 판단되는 신초의 증식 개체수와 발근율을 조사하였다.

토양 이식 및 순화

기내배양 식물체의 순화 조건을 구명하기 위하여 피트모스 등 혼합 용토 4종류와 흑색 차광막 4수준(35%, 55%, 75%, 95%)으로 처리를 하였다. 식물체를 정식하기 전에 차광 55%에서 1일간 배양병의 뚜껑을 열어 경화시킨 후 배지를 흐르는 물에 깨끗이 씻은 뒤 피트모스 등 혼합 용토에 정식하였다.

혼합용토는 질석:펄라이트=1:1, 질석:펄라이트 :피트모스=1:1:1, 마사:펄라이트=1:1, 마사:펄라이트:피트모스=1:1:1, 차광막은 흑색 차광막 35, 55, 75, 95%를 4수준으로 처리하였다. 순화된 5 cm 정도의 재분화 식물체는 20주씩 5반복하여 습도 64 ± 2%, 온도 23 ± 2°C 환경조건에서 정식 3주 후에 조사하였다.

결과 및 고찰

캘러스 유도

캘러스 유도에 적합한 배양부위 선발 및 생장조정제의 적정 농도를 구명하기 위하여 옥선(H. truncata)의 잎, 화뢰, 화경을 재료로 NAA와 TDZ를 혼용처리하여 배양한 결과는 Table 1과 같다.

Table 1 . Effect of growth regulators on callus formation, from in vitro different plant part (leaf flower bud, flower stalk) of Haworthia truncata.

Growth regulators (mg•L-1)Callus formation of plant partsa
NAATDZLeaf segmentFlower budFlower stalk
PercentagePercentagePercentage
0020.3eb55.6c19.4c
0120.3e61.1bc2.8c
0220.3e47.2c4.2c
10100a93.1ab41.7bc
1172.5d100a4.2c
1280.2c100a40.3bc
20100a100a15.3c
21100a100a52.5b
2290.5b100a75.0a

aCultured on MS medium, containing various plant growth regulators for 16 weeks.

bMean separation within columns, by Duncan’s multi range test (P=0.05).

잎 절편을 배양하였을 때 NAA 1~2 mgL-1 단용배지에서 캘러스 형성율이 100%로 가장 높았으며, 배양일이 경과될수록 캘러스의 증식이 왕성하고 녹색의 단단한 캘러스로 변하였다(Fig. 1A). 반면, 무처리와 TDZ 단용배지에서는 잎의 기부에서만 캘러스가 형성되는 경향을 보였는데, 이는 절편 기부에 형성되는 캘러스는 절편의 양분 및 생장조정제의 저장기능을 담당한다는 연구결과(Vieitez et al. 1989)와 유사하였다. 반면, NAA와 TDZ 혼용배지에서는 캘러스와 shoot가 함께 형성되었으나, 신초가 부풀어 오르며 비정상적인 신초가 발생되는 경향을 보였다(사진 미제시). 하월시아 만상(H. maughanii)의 경우 잎 절편을 배양하였을 때 NAA 1 mgL-1 + TDZ 1~2 mgL-1 혼용배지에서 캘러스가 100% 형성된 연구가 보고(Kim et al. 2018)된 바 있으며 본 연구에서 옥선(H. truncata)의 잎 절편에서는 NAA 1~2 mgL-1 단용배지가 캘러스 형성율이 가장 높은 결과로 나타났다.

Figure 1.

Effect of plant growth regulators on callus induction from leaves, flower bud, and flower stalk of Haworthia truncata. (A) Explants were cultured on MS medium, supplemented without growth regulators with 1 mgL-1 NAA; (B) With 1 mgL-1 NAA and 2 mgL-1 TDZ; (C) With 2 mgL-1 NAA and 2 mgL-1 TDZ



화뢰를 배양 하였을 때 전반적으로 초기에 캘러스 형성율은 높았으나, 시간이 지나면서 캘러스의 증식은 매우 저조하였다(사진 미제시). 이 중에서 NAA 1 mgL-1 + TDZ 2 mgL-1 혼용배지에서 캘러스와 shoot 생육이 양호한 경향을 보였다(Fig. 1B). 화경을 배양 하였을 경우에는 TDZ 단용배지에서는 캘러스가 일부 형성되었지만 배양일이 경과할수록 화경의 엽록소가 없어지는 백화현상(白化現象)을 보였으며, 전반적으로 캘러스의 증식은 저조하였다. 이 중 NAA 2 mgL-1 + TDZ 2 mgL-1의 혼용 배지에서 75%의 녹색의 캘러스가 형성되었다(Fig. 1C). 이러한 결과는 식물 배양 부위와 식물생장조정제의 농도에 따라 캘러스 형성이 크게 다른 것으로 생각된다.

배지에 첨가하는 생장조정제의 종류와 농도에 따라 캘러스 형성 양상이 크게 다르게 나타나는데(Ryu et al. 1992) 캘러스 유도와 생장에는 세포의 생장과 분열을 촉진하는 옥신이 필수적이며, 사이토키닌은 세포 분화를 촉진하는 작용을 한다고 보고되고 있다(Delvlin 1975; Skoog et al. 1965).

돌나물과 sedum속 식물인 둥근잎꿩의비름(Sedum rotundifolium)의 잎 절편체가 화뢰에 비해 캘러스 유도율이 높았으며 NAA 1~2 mgL-1 + BA 1 mgL-1 혼용배지에서 100% 캘러스가 형성된 연구보고(Kwon and Yoon 2010), 참시호(Bupleurum spp)의 경우 유엽은 65%, 화뢰는 44% 캘러스 형성을 보인 연구보고(Park et al. 1994), 섬시호(Bupleurum latissimum)의 기내번식 캘러스 유도에서 잎, 엽병보다 화뢰에서 2,4-D 2.0 mgL-1 단용배지에서 71.6%의 캘러스 형성을 보인 연구보고 (Kim 2007), 금낭화(Dicentra spectabillis) 캘러스 유도 및 식물체 재분화 연구에서는 액아가 잎과 줄기에 비해 캘러스 형성율이 높았으며 2,4-D 0.1 mgL-1 + TDZ 2 mgL-1 혼용배지에서 94~100%의 캘러스가 형성된 연구보고(Hyun et al. 2001), 무스카리(Muscari armeniacum)의 잎, 화경, 인편, 뿌리를 조직배양 하였을 때 캘러스 형성율이 잎이 가장 적합한 연구결과가 보고(Suzuki and M. Nakano 2001), Chung and Cho (2002)의 연구에서는 도라지를 잎, 줄기 및 뿌리의 조직 절편 부위별 캘러스 유도 결과 줄기나 뿌리의 절편체 보다도 잎 절편체를 치상시 캘러스 유도가 잘 되었다고 연구보고, 희수나무(Camptotheca acuminata Decaisne)의 자엽, 배축, 뿌리의 조직절편부위별 캘러스 유도 결과 배축이 가장 많은 캘러스가 형성되었다는 연구보고(Bae 2009)한 바 있다. 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 잎 절편으로부터 캘러스 형성에 있어서는 NAA 100 mgL-1 단용배지에서 가장 많은 캘러스 형성이 가장 우수한 연구보고(Kim and Han 2003), 하월시아 만상(H. maughanii)은 잎은 NAA 1 mgL-1 + TDZ 1 mgL-1, 화뢰는 NAA 1 mgL-1 + TDZ 2 mgL-1, 화경은 NAA 1 mgL-1 이상의 단용처리에서 캘러스 형성율이 가장 높은 것으로 연구결과가 보고(Kim et al. 2018)되었다. 반면 옥선(H. truncata)의 잎은 NAA 1~2 mgL-1 단용처리, 화뢰 배양시 NAA 1 mgL-1 + TDZ 2 mgL-1, 화경은 NAA 2 mgL-1 + TDZ 2 mgL-1 혼용배지에서 캘러스 형성율이 높은 결과를 보였으며, 옥선(H. truncata)의 잎, 화뢰, 화경을 배양한 경우, 모든 부위에서 캘러스 형성은 되었으나 가장 많은 배양절편 확보가 가능한 잎 절편이 가장 효율적으로 판단되었다.

Figure 2.

Effect of plant growth regulators, on shoot formation from callus of Haworthia truncata. (A) Explants were cultured on MS medium, supplemented without growth regulators; (B) With 0.5 mgL-1 BA; (C) 1 mgL-1 BA; (D) 1.5 mgL-1 BA (E) 3 mgL-1 BA; (F) 0.01 mgL-1 NAA; (G) 0.01 mgL-1 NAA and 0.5 mgL-1 BA; (H) 0.01 mgL-1 NAA and 1 mgL-1 BA; (I) 0.01 mgL-1 NAA and 1.5 mgL-1 BA; (J) 0.01 mgL-1 NAA and 3 mgL-1 BA; (K) 0.1 mgL-1 NAA; (L) 0.1 mgL-1 NAA and 0.5 mgL-1 BA; (M) 0.1 mgL-1 NAA and 1 mgL-1 BA; (N) 0.1 mgL-1 NAA and 1.5 mgL-1 BA; (O) 0.1 mgL-1 NAA and 3 mgL-1 BA; (P) 0.2 mgL-1 NAA; (Q) 0.2 mgL-1 NAA and 0.5 mgL-1 BA; (R) 0.2 mgL-1 NAA and 1 mgL-1 BA; (S) 0.2 mgL-1 NAA and 1.5 mgL-1 BA; (T) 0.2 mgL-1 NAA and 3 mgL-1 BA; respectively, in vitro culture for 23 weeks



Shoot 재분화

캘러스로부터 shoot 재분화에 적합한 생장조정제의 농도를 선발하고자 NAA와 BA 를 조합 처리한 결과는 Table 2와 같다. 배양 10주 후 캘러스로부터 shoot 발생이 관찰되었으며, 캘러스로부터 shoot가 형성된 처리구는 NAA 0.1 mgL-1 단용배지, NAA 0.2 mgL-1 단용배지에서 각각 24.2개, 17.1개의 shoot가 발생하였다. 반면 나머지 처리에서는 모두 캘러스만 증식 될 뿐 shoot는 발생하지 않았다. 특히 NAA 0.1 mgL-1 단용배지에서 shoot 발생이 가장 많고 발생된 shoot도 정상적인 생장을 보여 shoot유도에 적합한 배지로 판단되었으며(Table 2 and Fig. 4). 이러한 결과는 캘러스로부터 직접 식물재생이 가능하다는 연구 보고와는 일치하는 것이다(Collins et al. 1978;Furmanowa et al. 1997).

Table 2 . Effect of plant growth regulators, on shoot formation from callus of Haworthia truncata.

Growth regulators (mgL-1)a
NAABANumber of shoots/callusShoot length (cm)
000cb0b
00.50c0b
010c0b
01.50c0b
030c0b
0.0100c0b
0.010.50c0b
0.0110c0b
0.011.50c0b
0.0130c0b
0.1024.2a0.5a
0.10.50c0
0.110c0b
0.11.50c0b
0.130c0b
0.2017.1b0.4a
0.20.50c0b
0.210c0b
0.21.50c0b
0.230c0b

aCultured on MS medium, containing various plant growth regulators for 23 weeks.

bMean separation within columns, by Duncan’s multi range test (P=0.05).
Figure 3.

Effect of plant growth regulators, on multiple shoot induction from shoot of Haworthia truncata. (A) Explants were cultured on MS medium, supplemented without growth regulators; (B) With 0.1 mgL-1 BA; (C) 1 mgL-1 BA; (D) 2 mgL-1 BA (E) 4 mgL-1 BA; (F) 0.1 mgL-1 NAA; (G) 0.1 mgL-1 NAA and 0.1 mgL-1 BA; (H) 0.1 mgL-1 NAA and 1 mgL-1 BA; (I) 0.1 mgL-1 NAA and 2 mgL-1 BA; (J) 0.1 mgL-1 NAA and 4 mgL-1 BA; (K) 1 mgL-1 NAA; (L) 1 mgL-1 NAA and 0.1 mgL-1 BA; (M) 1 mgL-1 NAA and 1 mgL-1 BA; (N) 1 mgL-1 NAA and 2 mgL-1 BA; (O) 1 mgL-1 NAA and 4 mgL-1 BA; respectively, in vitro culture for 16 weeks


Figure 4.

Acclimatization of regenerated H. truncata in the soils. (A) Vermiculite:perlite=1:1 (v:v); (B) Vermiculite: perlite: peatmoss= 1:1:1 (v:v:v); (C) Sandy soil: perlite=1:1 (v:v); (D) Sandy soil: perlite: peatmoss=1:1:1 (v:v:v)



일반적으로 조직배양을 통한 식물체의 분화 및 탈분화는 식물의 종과 같은 종이라도 품종 및 계통에 따라서 분화능력에 변화를 보이는 등 모식물의 유전자형이나 배양에 이용되는 조직부위에 중요한 영향을 끼치며, 배지의 조성과 방법에 따라 분화의 능력은 차이를 보인다(Datta et al. 1990; Koetje et al. 1989).

자운영(Astragalus sinicus)의 캘러스로부터 shoot 형성에는 BA가 효과적이었으며 2,4-D 1.0 mgL-1 + BA 0.5 mgL-1 혼용배지에서 15.0개의 shoot를 형성한 연구보고(Park and Choi 2015), 맥문동(Liriope platyphylla)의 캘러스로부터 식물체 재분화를 위해서 NAA 0.5 mgL-1 + BA 2 mgL-1 혼용배지에서 34.2%로 가장 높은 재분화율을 보인 연구결과가(Kim et al. 1996) 보고 되었다.

반면, 본 연구결과에서는 옥선(H. truncata) 캘러스 배양에서는 NAA 0.1 mgL-1 단용배지에서 24.2개의 shoot가 발생하였으며, 하월시아 만상(H. maughanii)의 기내 대량증식 연구(Kim et al. 2018)에서 NAA 0.1 mgL-1 단용배지에서 22.0개의 shoot 유도가 보인 연구 보고와 에케베리아 엘레강스(Echeveria elegans)의 shoot 재분화 연구에서 NAA 0.3 mgL-1 단용배지에서 7.3%의 shoot 형성율을 보인 연구결과(Kim et al. 2019)와 같은 경향으로, 옥선(H. truncata)의 경우에도 만상(H. maughanii)의 경우와 마찬가지로 캘러스에서 shoot 재분화 효율을 높이는 데 사이토키닌이 shoot 분화에 영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다.

Multiple shoot 및 뿌리 유도

캘러스로부터 유도된 shoot를 이용하여 shoot의 증식과 발근 유도를 위해 NAA와 BA를 MS배지에 단용과 혼용 처리하여 배양한 결과는 Table 3과 같다. 배양 3주 후부터, 새로운 shoot 발생이 관찰되었고 일부 처리에서는 치상된 shoot로부터 발근이 시작되었다. 옥선(H. truncata)의 multiple shoot은 BA 0.1~1 mgL-1 단용배지, NAA 0.1~1 mgL-1 단용배지, NAA 0.1 mgL-1 + BA 0.1 mgL-1 혼용배지 NAA 0.1 mgL-1 + BA 1 mgL-1 혼용배지, NAA 1 mgL-1 + BA 0.1 mgL-1 혼용배지에서 각각 22.3, 37.6, 40.0, 32.1, 51.5, 35.6, 66.3개의 multiple shoot가 발생되었고 shoot 길이는 0.8~1.3 cm의 범위였다. 생장조정제가 처리되지 않는 무처리에서는 multiple shoot가 전혀 발생되지 않았으며, shoot가 녹색에서 갈변하여 고사되는 경향을 보였다. 또한 BA 2 mgL-1 이상의 단용 및 처리구에서는 shoot가 부풀어 기형으로 변화되어 정상적인 개체로 증식되지 못하였다(Fig. 3).

Table 3 . Effects of plant growth regulators, on multiple shoot formation and rooting formation from explant of Haworthia truncata.

Growth regulators(mgL-1)a
NAABANumber of multiple shoots (per explant)Multiple shoot length (cm)Root formation rate (%)
000fb0c0e
00.122.3e0.8b50c
0137.6cd0.9b35d
020f0c0e
040f0c0e
0.1040.0c1.2a100a
0.10.151.5b1.3a100a
0.1135.6cd0.9b80b
0.120f0c0e
0.140f0c0e
1032.1d1.1a100a
10.166.3a1.1a100a
110f0c0e
120f0c0e
140f0c0e

aCultured on MS medium, containing various plant growth regulators for 16 weeks.

bMean separation within columns, by Duncan’s multi range test (P=0.05).

Park 등 (1998)의 지황(Rehmannia glutinosa)의 재분화 식물체로부터 MS배지에 NAA 0.2 mgL-1 + BA 0.5 mgL-1 혼용배지에서 3.4개의 multiple shoot를 얻은 연구보고, 하월시아 만상(H. maughanii)의 NAA 0.1 mgL-1 + BA 1 mgL-1 혼용배지가 16.3개의 shoot 증식을 보인 연구보고(Kim et al. 2018), 에케베리아 엘레강스(Echeveria elegans)의 대량 증식 연구에서 NAA 1 mgL-1 + BA 0.1 mgL-1 혼용 배지에서 12.0개의 shoot 증식을 보인 연구결과(Kim et al. 2019)와 마찬가지로 본 연구에서도 NAA 1 mgL-1 + BA 0.1 mgL-1 혼용 처리구에서 66.3개의 shoot 증식을 보여 NAA와 BA 혼용 처리구에서 shoot 증식에 가장 효율적인 것으로 판단되었다.

옥신류의 식물호르몬은 발근 유도에 직접 영향을 끼치는 것으로 널리 알려져 있으며(Scott 1972), 시클라멘(Cyclamen percicum Mill.)의 shoot로부터 발근을 유도하기 위해서는 IBA 단용배지가 NAA 단용배지보다 효과적인 것으로 연구보고(Han 2000), 백하수오(Cynanchum wilfordii)와 장백도라지(Platycodon grandiflorum)의 발근 유도에는 NAA가 IBA보다 효과적인 것으로 연구보고(Lee et al. 2011; Han et al. 2014)되었으나, 옥선(H. truncata)의 발근 유도에는 NAA 0.1~1 mgL-1 단용배지와 NAA 0.1 mgL-1 + BA 0.1 mgL-1, NAA 1 mgL-1 + BA 0.1 mgL-1 혼용배지에서 100% 발근을 보였으며, BA 2 mgL-1 이상인 배지에서는 발근이 이루어지지 않아 고농도 BA 첨가배지에서는 뿌리 형성이 적합하지 않은 것으로 판단되었다. 또한 생장조정제가 처리되지 않은 배지에서는 발근이 직근의 실뿌리가 되었으며, NAA 단용배지에서는 배양 4주부터 흰색의 굵은 뿌리가 형성됨을 관찰할 수 있었다(사진 미제시).

일반적으로 기내 식물체의 발근은 저농도의 옥신 처리가 요구되지만(Boggetti et al. 1999) 내생 옥신(endogenous auxin)함량이 많은 식물체의 경우 옥신류 무첨가배지에서도 발근이 잘 이루어지는 것으로 알려져 있다(Park et al. 2018). 옥선(H. truncata)의 발근은 생장조정제가 처리되지 않은 배지에서 100% 발근을 보여 옥선(H. truncata)의 경우도 내생 옥신이 많은 것으로 판단되며 종에 따라 옥신 농도가 기내 발근에 미치는 결과가 매우 다양하게 나타남을 알 수 있었다.

따라서 NAA 1 mgL-1 + BA 0.1 mgL-1 혼용처리가 100% 발근과 66.3개의 multiple shoot를 형성 하였고, 형성된 shoot가 정상적인 생육을 유지하여 multiple shoot 형성 및 발근 유도에 적합한 처리로 판단하였다.

식물체 순화

재분화 식물체의 기외 순화조건을 구명하기 위해 피트모스 등 혼합 용토와 차광막 35, 55, 75, 95%의 4수준으로 처리한 결과는 Table 4와 같다. 옥선(H. truncata)의 재분화된 식물체를 흑색 차광 55%에서 1일간 배양병을 열어 경화시킨 후 흰색의 굵은 뿌리를 깨끗이 세척하였으며 정식 3일 후부터, 차광 정도가 낮은 처리에서는 녹색의 shoot가 갈변되는 현상이 관찰되었다(사진 미제시).

Table 4 . Effect of Haworthia truncata growth, on different mixed soils media.

Shading level (%) TreatmentaPlant height (cm)Plant width (cm)Plant thickness (mm)Survival rate (%)
35Vermiculite: perlite=1:12.12.13.200
Vermiculite: perlite: peatmoss=1:1:12.22.32.100
Sandy soil: perlite=1:12.02.03.000
Sandy soil: perlite: peatmoss=1:1:12.42.62.800
55Vermiculite: perlite=1:12.32.33.100
Vermiculite: perlite: peatmoss=1:1:12.12.23.300
Sandy soil: perlite=1:12.62.63.100
Sandy soil: perlite: peatmoss=1:1:12.42.43.600
75Vermiculite: perlite=1:12.12.23.530
Vermiculite: perlite: peatmoss=1:1:12.32.33.730
Sandy soil: perlite=1:12.32.33.630
Sandy soil: perlite: peatmoss=1:1:12.32.22.930
95Vermiculite: perlite=1:12.42.54.4100
Vermiculite: perlite: peatmoss=1:1:12.72.64.3100
Sandy soil: perlite=1:12.52.64.5100
Sandy soil: perlite: peatmoss=1:1:12.52.74.1100
Shading********
Soilnsnsnsns
Shading*Soilnsnsnsns

aCultured on containing different soil for three weeks.

b Mean separation within columns, by Duncan’s multi range test (P=0.05)..

c Non-significant or significant at P=0.05, respectively..

조직배양에 있어 기내에서 성공적인 증식이 가능하다 할지라도 기외에서 환경에 적응하여 정상적으로 생장하는 것이 중요하다. Grout and Aston(1977)는 기내에서 배양된 식물체의 잎은 표면에 Wax층이 덜 발달되어 있다고 하였으며, 기내 배양된 식물체의 엽육 세포에 공기층이 많아 기외에 이식한 후에 과다한 증산에 의해 마르고 결국은 죽게 된다고 하였다(Brainerd et al 1981;Fuchigami et al. 1981).

옥선(H. truncata)의 재분화 식물체를 순화 용토에 이식하여 이식 후 3주 후에는 용토 간에는 초장, 초폭, 엽두께의 생육에 큰 차이를 보이지 않았으며, 차광막에 따른 재분화체 식물체 생육의 초장, 초폭, 엽두께가 유의하게 감소되었다. 차광막 95% 처리에서 고유의 엽색이 유지되고 100%의 생존율을 보였으며(Table 4, Fig. 4), 차광막 35~75% 처리에서는 녹색의 잎이 갈변 되었고, 0~30%의 생존율을 보였다. 일반적으로 하월시아 재배시 한여름 차광을 50% 차광을 유지하는데 반해, 기내 순화묘의 경우 재분화 식물체의 정상적인 생육 및 고유의 엽색유지를 위해서는 차광막 95%에서 순화하는 것이 적합할 것으로 판단되었다.

이러한 결과는 Bae 등(2012)은 돌나물과 sedum속 식물인 홍경천(Rhodiola sachalinesis)의 순화시험에서 피트모스와 펄라이트 혼합배양토와 펄라이트 단용 배양토 간의 이식 후 유묘의 생장이 차이가 없었다는 연구 결과와 유사한 반면, 내건성 식물인 비수리(Lespedeza cuneata)의 순화시험에서 상토에서 길이, 뿌리 생장이 가장 좋았으며 펄라이트에서 70%의 낮은 생존율을 보인 연구보고(Park et al. 2017), 장백도라지(Platycodon grandiflorum)의 순화 조건 연구에서는 상토(토실)에서 가장 좋은 결과를 나타냈으며, 연구에 이용된 모든 상토에서 100% 순화율을 보인 연구결과(Han et al. 2014), 홍경천(Rhodiola sachalinensis)의 재분화된 식물체는 피트모스와 모래가 1:1로 혼합된 상토에서 약 95%이상 정상적으로 순화된 연구결과(Bae et al. 2005)는 식물과 용토에 따라 순화조건이 다를 수 있다는 걸 보여주는 것이다.

적 요

하월시아 옥선(Haworthia truncata)의 기내 대량생산을 위하여 캘러스 유도에 적합한 부위와 기내 재분화 조건을 확립하고, 형성된 식물체의 기외 순화조건을 구명하고자 본 연구를 수행하였다. 캘러스를 유도에 적합한 식물 부위를 구명하기 위해 잎, 화뢰, 화경을 이용하여 NAA와 TDZ의 농도를 달리하여 MS배지에 배양한 결과, 잎은 NAA 1~2 mgL-1 단용배지, 화뢰 NAA 1 mgL-1 + TDZ 2 mgL-1 혼용처리에서 100% 캘러스 형성율을 보였으며, 화경 NAA 2 mgL-1 + TDZ 2 mgL-1 혼용처리에서 75% 캘러스 형성율을 나타냈으며 이 중 가장 많은 배양 절편체 확보가 가능한 잎이 옥선(H. truncata)의 대량증식에 가장 효율적일 것으로 판단되었다. Shoot 유도 배지로는 NAA 0.1mgL-1의 단용 처리구에서 다른 처리에 비해서 shoot가 24.2개로 shoot 발생이 가장 많았으며, shoot 증식(multiple shoot)은 NAA 1 mgL-1 + BA 0.1 mgL-1 혼용 처리구에서 multiple shoot가 66.3개로 가장 많이 형성되었다. 재분화 식물체의 기외 순화조건은 용토에 따라 생육에 큰 차이를 보이지 않았으나 식물체의 고유 엽색 유지, 엽장, 생존율을 고려하여 차광막 95%에서 순화 처리하는 것이 적합할 것으로 판단되었다. 이러한 결과는 최적의 기내 배양 조건 및 재분화 식물체 순화 조건 구명을 통해 번식이 어려운 옥선(H. truncata)의 균일하고 안정적인 대량생산이 가능할 것으로 기대된다.

사 사

본 연구는 농촌진흥청 국제공동연구사업(과제번호: PJ0124 2901)의 지원으로 수행되었으며 이에 감사드립니다.

Fig 1.

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Figure 1.

Effect of plant growth regulators on callus induction from leaves, flower bud, and flower stalk of Haworthia truncata. (A) Explants were cultured on MS medium, supplemented without growth regulators with 1 mgL-1 NAA; (B) With 1 mgL-1 NAA and 2 mgL-1 TDZ; (C) With 2 mgL-1 NAA and 2 mgL-1 TDZ

Journal of Plant Biotechnology 2019; 46: 127-135https://doi.org/10.5010/JPB.2019.46.2.127

Fig 2.

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Figure 2.

Effect of plant growth regulators, on shoot formation from callus of Haworthia truncata. (A) Explants were cultured on MS medium, supplemented without growth regulators; (B) With 0.5 mgL-1 BA; (C) 1 mgL-1 BA; (D) 1.5 mgL-1 BA (E) 3 mgL-1 BA; (F) 0.01 mgL-1 NAA; (G) 0.01 mgL-1 NAA and 0.5 mgL-1 BA; (H) 0.01 mgL-1 NAA and 1 mgL-1 BA; (I) 0.01 mgL-1 NAA and 1.5 mgL-1 BA; (J) 0.01 mgL-1 NAA and 3 mgL-1 BA; (K) 0.1 mgL-1 NAA; (L) 0.1 mgL-1 NAA and 0.5 mgL-1 BA; (M) 0.1 mgL-1 NAA and 1 mgL-1 BA; (N) 0.1 mgL-1 NAA and 1.5 mgL-1 BA; (O) 0.1 mgL-1 NAA and 3 mgL-1 BA; (P) 0.2 mgL-1 NAA; (Q) 0.2 mgL-1 NAA and 0.5 mgL-1 BA; (R) 0.2 mgL-1 NAA and 1 mgL-1 BA; (S) 0.2 mgL-1 NAA and 1.5 mgL-1 BA; (T) 0.2 mgL-1 NAA and 3 mgL-1 BA; respectively, in vitro culture for 23 weeks

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Fig 3.

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Figure 3.

Effect of plant growth regulators, on multiple shoot induction from shoot of Haworthia truncata. (A) Explants were cultured on MS medium, supplemented without growth regulators; (B) With 0.1 mgL-1 BA; (C) 1 mgL-1 BA; (D) 2 mgL-1 BA (E) 4 mgL-1 BA; (F) 0.1 mgL-1 NAA; (G) 0.1 mgL-1 NAA and 0.1 mgL-1 BA; (H) 0.1 mgL-1 NAA and 1 mgL-1 BA; (I) 0.1 mgL-1 NAA and 2 mgL-1 BA; (J) 0.1 mgL-1 NAA and 4 mgL-1 BA; (K) 1 mgL-1 NAA; (L) 1 mgL-1 NAA and 0.1 mgL-1 BA; (M) 1 mgL-1 NAA and 1 mgL-1 BA; (N) 1 mgL-1 NAA and 2 mgL-1 BA; (O) 1 mgL-1 NAA and 4 mgL-1 BA; respectively, in vitro culture for 16 weeks

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Fig 4.

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Figure 4.

Acclimatization of regenerated H. truncata in the soils. (A) Vermiculite:perlite=1:1 (v:v); (B) Vermiculite: perlite: peatmoss= 1:1:1 (v:v:v); (C) Sandy soil: perlite=1:1 (v:v); (D) Sandy soil: perlite: peatmoss=1:1:1 (v:v:v)

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Table 1 . Effect of growth regulators on callus formation, from in vitro different plant part (leaf flower bud, flower stalk) of Haworthia truncata.

Growth regulators (mg•L-1)Callus formation of plant partsa
NAATDZLeaf segmentFlower budFlower stalk
PercentagePercentagePercentage
0020.3eb55.6c19.4c
0120.3e61.1bc2.8c
0220.3e47.2c4.2c
10100a93.1ab41.7bc
1172.5d100a4.2c
1280.2c100a40.3bc
20100a100a15.3c
21100a100a52.5b
2290.5b100a75.0a

aCultured on MS medium, containing various plant growth regulators for 16 weeks.

bMean separation within columns, by Duncan’s multi range test (P=0.05).

Table 2 . Effect of plant growth regulators, on shoot formation from callus of Haworthia truncata.

Growth regulators (mgL-1)a
NAABANumber of shoots/callusShoot length (cm)
000cb0b
00.50c0b
010c0b
01.50c0b
030c0b
0.0100c0b
0.010.50c0b
0.0110c0b
0.011.50c0b
0.0130c0b
0.1024.2a0.5a
0.10.50c0
0.110c0b
0.11.50c0b
0.130c0b
0.2017.1b0.4a
0.20.50c0b
0.210c0b
0.21.50c0b
0.230c0b

aCultured on MS medium, containing various plant growth regulators for 23 weeks.

bMean separation within columns, by Duncan’s multi range test (P=0.05).

Table 3 . Effects of plant growth regulators, on multiple shoot formation and rooting formation from explant of Haworthia truncata.

Growth regulators(mgL-1)a
NAABANumber of multiple shoots (per explant)Multiple shoot length (cm)Root formation rate (%)
000fb0c0e
00.122.3e0.8b50c
0137.6cd0.9b35d
020f0c0e
040f0c0e
0.1040.0c1.2a100a
0.10.151.5b1.3a100a
0.1135.6cd0.9b80b
0.120f0c0e
0.140f0c0e
1032.1d1.1a100a
10.166.3a1.1a100a
110f0c0e
120f0c0e
140f0c0e

aCultured on MS medium, containing various plant growth regulators for 16 weeks.

bMean separation within columns, by Duncan’s multi range test (P=0.05).

Table 4 . Effect of Haworthia truncata growth, on different mixed soils media.

Shading level (%) TreatmentaPlant height (cm)Plant width (cm)Plant thickness (mm)Survival rate (%)
35Vermiculite: perlite=1:12.12.13.200
Vermiculite: perlite: peatmoss=1:1:12.22.32.100
Sandy soil: perlite=1:12.02.03.000
Sandy soil: perlite: peatmoss=1:1:12.42.62.800
55Vermiculite: perlite=1:12.32.33.100
Vermiculite: perlite: peatmoss=1:1:12.12.23.300
Sandy soil: perlite=1:12.62.63.100
Sandy soil: perlite: peatmoss=1:1:12.42.43.600
75Vermiculite: perlite=1:12.12.23.530
Vermiculite: perlite: peatmoss=1:1:12.32.33.730
Sandy soil: perlite=1:12.32.33.630
Sandy soil: perlite: peatmoss=1:1:12.32.22.930
95Vermiculite: perlite=1:12.42.54.4100
Vermiculite: perlite: peatmoss=1:1:12.72.64.3100
Sandy soil: perlite=1:12.52.64.5100
Sandy soil: perlite: peatmoss=1:1:12.52.74.1100
Shading********
Soilnsnsnsns
Shading*Soilnsnsnsns

aCultured on containing different soil for three weeks.

b Mean separation within columns, by Duncan’s multi range test (P=0.05)..

c Non-significant or significant at P=0.05, respectively..

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