J Plant Biotechnol 2021; 48(2): 71-76
Published online June 30, 2021
https://doi.org/10.5010/JPB.2021.48.2.71
© The Korean Society of Plant Biotechnology
이신우?이수진?한은희?신용욱?김윤희
경상국립대학교 생명과학대학 항노화신소재과학과
경상남도 농업기술원 약용자원연구소
경상국립대학교 사범대학 생물교육과 (농업생명과학연구원)
Correspondence to : e-mail: cefle@gnu.ac.kr
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Angelica is a perennial plant used widely for medicinal purposes. Information on the genetic diversity of Angelica populations is important for their conservation and germplasm utilization. Although Angelica is an important medicinal plant genus registered in South Korea, no molecular markers are currently available to distinguish individual species from other similar species in different countries, in particular, China and Japan. In this study, we developed single nucleotide polymorphism (SNP) markers derived from internal transcribed spacer regions of the nuclear ribosomal DNA to identify a distinct domestic species, Angelica gigas Nakai, via a high-resolution melting (HRM) curve analyses. We also performed HRM curve analysis of intentionally mixed genomic DNA samples from five Angelica species. Finally, we investigated A. gigas Nakai and A. sinensis using varying ratios of mixed genomic DNA templates. The SNP markers developed in this study are useful for rapidly identifying A. gigas species from different countries.
Keywords Angelica, High-resolution melting, Internal transcribed spacer regions of rDNA, Single nucleotide polymorphisms
산형과(
특히 이들 식물체의 형태학적 성상이 상호 구분이 어렵고, 일부 부분적인 가공에 의한 말린 절편 또는 분말가루로 유통되기 때문에 유통시장에서 더욱더 혼란을 가중시키고 있다. 뿐만 아니라 유럽의 구당귀(歐當歸.
최근, 약용작물을 포함한 다양한 식물종의 분자생물학적 구분에 관한 연구는 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing, NGS) 등의 염기서열분석 기술의 발달과 함께 급속도로 발전하고 있다. 특히 바코드(barcode) 기술을 이용한 종의 판별에 관한 기술은 기존의 형태학적 특성이나 성상으로는 구분이 어렵고 애매하여 혼·오용이 심각한 한약재에 대한 종의 기원 판별에 큰 발전을 가져오게 하였다. 특히 PCR 기법을 이용한 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 및 simple sequence repeat (SSR) 등은 소량의 DNA를 이용하여 식물의 생장과 관계없이 모든 조직에서 안정적으로 탐색할 수 있으며 비교적 적은 비용으로 빠른 시간 안에 분석할 수 있다는 장점을 가진다(Jo et al. 2013).
당귀 속 식물에서는 현재까지 RAPD 및 SSR 분자마커 등을 사용한 종 식별에 대한 연구 사례들이 보고된 바 있으며(Jeong et al. 2019; Lee et al. 2001; Liao et al. 2013; Mei et al. 2015), 최근 본 연구팀에서는 핵내 리보솜 RNA를 암호 하는 유전자 단편 내 Internal Transcribed Spacer (ITS) 영역의 염기서열을 비교하여 SNP를 확인하고 이를 이용한 Amplification Refractory Mutation System (ARMS)-PCR기술을 적용하여 국내 토종 당귀계통인 참당귀와 세발당귀를 외래 당귀 계통인 일당귀, 중국당귀, 구당귀와 판별한 바 있다(Lee et al. 2021). 최근에는 이러한 SNP를 포함하는 특정 barcode단편을 이용하여 High Resolution Melting (HRM) curve 패턴 분석기술로 특정 계통의 판별에 관한 연구보고가 많아지고 있다. HRM curve 패턴 분석기술은 SNP를 포함하는 약 200 bp의 DNA단편을 대상으로 서서히 온도를 상승시키면서 나타나는 melting curve 패턴을 비교하여 계통 간의 구분이 가능할 뿐만 아니라 이들 계통들이 서로 혼재되어 있는 경우 그 농도까지 예측이 가능한 기술이다(Han et al. 2015; Kim et al. 2018). 실지로 가짜 올리브오일을 판별하기 위하여 해바라기, 땅콩, 옥수수, 참깨, 쌀 등에서 추출한 오일과 올리브오일을 대상으로 HRM curve패턴을 비교한 결과 상호 구분이 가능하였으며 이들이 혼재되어 있는 경우에도 판별이 가능하였다고 하였다(Vietina et al. 2013). 또한 Jaakola et al. (2010)은 HRM 분석기술을 이용하여 야생형을 포함한 다양한 베리(berry)계통의 판별이 가능하였다고 보고하였다. 또한 크리스마스 장미(
실험에서 사용한 당귀 계통은 선행연구에서 사용된 국내 자생하는 참당귀(
수집된 계통별로 일정량의 식물체, 종자 및 한약재 재료 등을 액체질소에 급속 냉동시킨 후 곱게 갈아서 얻은 분말을 이용하여 GeneAll사의 ExgeneTM Plant SV 키트를 이용하여 회사에서 제공한 실험방법에 따라 염색체 DNA를 분리하였다. 정제된 DNA는 1% agarose gel에서 전기영동을 실시하여 DNA의 분리 과정에서의 분해 정도를 확인한 후 Micro-spectrometer (BioPrince, SD-2000, Gangwon, South Korea)를 이용하여 234 nm, 260 nm, 280 nm에서 각각 흡광도를 측정하여
ITS 유전자 내의 SNP를 확인하고자 유전자 단편의 증폭을 위하여 유전자의 염기서열정보를 사용하여 선행연구에서 제작된 프라이머를 이용하였다(Lee et al. 2021). 유전자의 증폭은 iNtRON 회사(Gyeonggi Province, South Korea)에서 제공하는 PCR 반응용 완충 용액 및 i-pfu DNA polymerase를 사용하여 중합반응과정에서 야기될 수 있는 돌연변이를 최소화하였다. 제조사에서 제공하는 실험방법에 따라 순수 분리한 DNA 50 ng과 프라이머를 각각 10 pmole을 혼합한 후 94℃에서 5분간 DNA를 변성 시킨 후 94℃에서 30초, 60℃에서 10초, 72℃에서 30초를 1 cycle로 하여 35 cycle 반복 후 72℃에서 5분간 연장반응을 시킨 후 4℃에서 반응을 종료하고 증폭된 DNA밴드는 2.0% agarose gel을 이용하여 전기영동 하여 그 결과를 확인하였다. 증폭되어진 각 유전자 단편의 클로닝 과정에서 돌연변이가 일어날 수도 있으므로 클로닝을 하지 않고 증폭된 DNA단편을 ExpinTM PCR SV (GeneAll, Seoul, South Korea) Kit를 사용하여 순수 정제한 후 직접 염기서열분석을 의뢰하였다. 또한 최종적으로 확인된 SNP는 최소 5반복 이상 수행하여 검정하였다.
Table 1에서 제시된 프라이머를 이용하여 HRM (High Resolution Melting) curve 패턴을 분석하기 이전에 이들 프라이머가 목표 유전자 단편을 정확하게 증폭 하는지의 여부를 조사하기 위하여 각각의 프라이머 조합을 이용하여 각 당귀 시료들에서 분리한 DNA를 주형으로 PCR로 증폭시켜 전기영동을 통해 확인하였다. 또한 확인된 밴드들을 순수 정제하여 염기서열분석을 한 결과 각각의 종에서 확인된 ITS 유전자와 100% 일치하는 것을 확인한 후 HRM curve 패턴 분석을 실시하였다. 각 당귀 시료에서 분리한 DNA를 각각 10 ng씩 넣고, 프라이머를 각각 5 pmol 넣고 10 μl의 SsoFast™ EvaGreen Supermix BIO-RAD, 172-5200 premixture를 넣고 전체 반응액을 20 μl로 맞춘 후 Mx3005P QPCR Systems (Agilent Technologies, Santa Clara, USA)을 사용하여 HRM curve 분석을 수행하였다.
Table 1 Primer sequences for high-resolution melting analysis of the internal transcribed spacer (
Gene | Primers | Sequences (5'–3') | Tm (°C) | Size (bp) |
---|---|---|---|---|
Forward | CGAGTCTTTGAACGCAAGTT | 54.6 | 244 | |
Reverse | CTAAGATGACGAGGATTCGC | 54.4 |
선행연구에서 국내 토종 당귀[참당귀(
HRM 분석을 위해 사용될 참당귀 시료의 적정량을 조사하기 위해, 참당귀에서 순수 분리한 DNA를 희석하여 50, 25, 6, 3, 1%를 포함하도록 만든 일정 용액을 대상으로 HRM 패턴을 분석하였다(Fig. 2A). DNA의 농도에 따라 비교분석을 수행한 결과, 점차적으로 농도에 비례하여 melting curve의 peak가 상대적으로 낮아지는 것을 확인할 수 있었으며, 이 결과를 이용하여 표준 농도곡선으로 한다면 어느 정도의 농도를 추산할 수 있을 것으로 사료되었다. 또한, 참당귀를 기준으로 다른 당귀 계통의 DNA를 동일 비율로 혼합한 시료에 대한 HRM 패턴을 비교한 결과, 많은 종류의 시료가 혼합될수록 melting curve의 peak가 비례하여 낮아지는 결과를 확인 할 수 있었다(Fig. 2B). 이는 Fig. 2A의 참당귀의 농도가 낮아지는 경우와 유사한 패턴을 보임으로서, 실제로 표준 곡선을 활용하여 혼재된 시료 내의 참당귀의 순도를 확인할 수 있을 것으로 생각된다.
실제로 시중에서 참당귀가 중국당귀와 혼재되어 있는 경우를 가정하여 참당귀와 중국당귀의 순수 분리한 DNA를 일정비율로 혼합하여 HRM 패턴을 분석하였다(Fig. 3). 참당귀를 기준으로 하여 중국당귀의 농도별( 50, 25, 6, 3, 1%) 비율로 혼합한 경우. 혼합한 중국당귀의 농도가 낮아짐에 따라 peak가 낮아지는 경향을 보이는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 3A). 반대로, 중국당귀를 기준으로 참당귀를 동일한 비율로 혼합한 경우에도 유사한 패턴을 보였다(Fig. 3B). 즉 순수한 중국당귀의 경우 고유한 낮은 peak를 보이는 것이 50%의 비율로 참당귀를 혼합한 경우, 참당귀의 패턴과 유사하게 peak가 증가한 후 농도가 낮아짐에 따라 점차 peak가 비례하여 낮아지는 경향을 보였다. 결론적으로 종합하면, 순수한 하나의 계통만을 대상으로 한 경우에는 농도가 높아짐에 따라 비례하여 peak가 증가하지만, 다른 당귀 계통을 혼합한 경우 간섭에 의하여 peak가 달라지며 혼합 계통의 농도가 증가함에 따라 peak도 높아지는 것을 알 수 있었다. 그러나 3종류 이상의 다양한 당귀계통을 혼합 할 경우는 패턴의 예측이 쉽지 않은 경향을 보였다.
이상의 연구결과를 종합하여 보면 ITS 단편내 단일염기다형성을 포함하도록 제작한 범용 프라이머 조합은 국내외에서 수집된 5종의 다양한 당귀계통들에 대하여 정확하게 예상한 크기의 DNA 단편을 확인하였다. 이들 증폭된 DNA단편에 대한 염기서열 분석을 통하여 핵산증폭반응 과정에 어떠한 변이현상이 일어나지 않았음을 확인한 후, HRM 패턴을 비교한 결과 5계통을 확실하게 구분할 수 있었다. 특히 국내 자생종인 세발당귀는 참당귀와 비교할 때 식물의 형태학적으로 거의 구분이 불가능한 자생형 ecotype으로 본 연구에서 확인한 ITS 단편내에도 단 하나의 SNP만 확인될 정도로 염기서열도 거의 동일하였다. 하지만 서로 다른 HRM 패턴을 보여 본 기술의 정확도를 확인할 수 있었다. 따라서 선행연구에서 보고된 ARMS-PCR 기술을 적용하여 개발한 판별 마커(Lee et al. 2021)를 사용하여 시중에서 수집된 시료를 대상으로 먼저 진위 여부를 확인하고 HRM 분석기술로 재확인을 한다면 유통시장에서 무작위로 수집된 시료에 대한 판별의 신뢰도를 높이는데 크게 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
이에 더하여, 순수 분리한 DNA의 농도를 달리한 경우에 확인된 농도 별 HRM 패턴은 향후 표준곡선으로 활용이 가능할 것으로 사료되었다. 또한, 다양한 당귀 계통들이 식물 그 자체 또는 건조 등의 부분적인 가공과정을 거친 시료들이 서로 혼합하여 유통되는 경우에도 확인이 가능할 것으로 조사되었다. 하지만 본 연구에서는 공인된 당귀계통들에 대한 시료를 확보하여 염기서열분석을 통하여 해당 당귀 계통의 진위여부를 확인한 계통들을 대상으로 순수 분리 정제한 DNA를 서로 혼합하여 수행한 연구결과로, 향후 유통현장에서 실용화하기 위하여서는 생체 시료, 건제품 또는 분말 상태에서 혼합된 시료를 대상으로 한 분석이 먼저 수행되어야 할 것이다. 또한, DNA가 분해되기 쉬운 탕재 및 각종 가공된 한약재와 식품 등을 대상으로 추가 연구가 수행되어야 할 것으로 사료된다.
당귀는 약용으로 널리 사용되는 대표적인 다년생 식물이다. 다양한 당귀 계통의 유전적 다양성에 대한 정보는 당귀의 유전자원의 발굴 및 보존의 차원에서 매우 중요하다. 당귀는 현재 한국에 등록 된 중요한 약용 식물 종이지만, 다른 나라의 다른 유사한 종과 구별 할 수 있는 분자표지가 없는 실정이다. 그러므로, 본 연구에서는 HRM 분석을 통해 국내 토종 당귀계통인 참당귀를 식별하기 위해 유전체 염기서열의 핵 리보솜 DNA 내부(ITS)영역에서 단일염기다형성(SNP) 분자표지를 개발하였다. 본 연구에서는 또한 5가지 당귀계통들의 혼합된 염색체 DNA 시료를 이용하여 HRM 분석을 수행하였으며, 최종적으로는 혼합된 염색체 DNA의 다양한 비율을 사용하여 혼용되는 대표적인 당귀계통인 참당귀와 중국당귀를 재료로 HRM 분석을 진행하였다. 그러므로, 본 연구에서 개발된 SNP 분자표지는 다양한 지역 또는 국가에서 서식하는 당귀 계통들의 신속한 확인을 위해 매우 유용하게 이용될 것으로 생각된다.
본 연구는 농림축산식품부 농생명산업기술개발사업(과제번호:314021-03-1-SB050)에 의해 이루어진 결과입니다.
J Plant Biotechnol 2021; 48(2): 71-76
Published online June 30, 2021 https://doi.org/10.5010/JPB.2021.48.2.71
Copyright © The Korean Society of Plant Biotechnology.
이신우?이수진?한은희?신용욱?김윤희
경상국립대학교 생명과학대학 항노화신소재과학과
경상남도 농업기술원 약용자원연구소
경상국립대학교 사범대학 생물교육과 (농업생명과학연구원)
Shin-Woo Lee ・Soo Jin Lee ・Eun-Hee Han ・Yong-Wook Shin ・Yun-Hee Kim
(Department of Plant & Biomaterials Science, Chilam Campus, Gyeongsang National University, JinJu, Korea)
(Gyeongsangnam-do Agricultural Research and Extension Services, Jinju 52733, Korea)
(Department of BiologyEducation, College of Education, IALS, Gyeongsang National University, Jinju, Korea)
Correspondence to:e-mail: cefle@gnu.ac.kr
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Angelica is a perennial plant used widely for medicinal purposes. Information on the genetic diversity of Angelica populations is important for their conservation and germplasm utilization. Although Angelica is an important medicinal plant genus registered in South Korea, no molecular markers are currently available to distinguish individual species from other similar species in different countries, in particular, China and Japan. In this study, we developed single nucleotide polymorphism (SNP) markers derived from internal transcribed spacer regions of the nuclear ribosomal DNA to identify a distinct domestic species, Angelica gigas Nakai, via a high-resolution melting (HRM) curve analyses. We also performed HRM curve analysis of intentionally mixed genomic DNA samples from five Angelica species. Finally, we investigated A. gigas Nakai and A. sinensis using varying ratios of mixed genomic DNA templates. The SNP markers developed in this study are useful for rapidly identifying A. gigas species from different countries.
Keywords: Angelica, High-resolution melting, Internal transcribed spacer regions of rDNA, Single nucleotide polymorphisms
산형과(
특히 이들 식물체의 형태학적 성상이 상호 구분이 어렵고, 일부 부분적인 가공에 의한 말린 절편 또는 분말가루로 유통되기 때문에 유통시장에서 더욱더 혼란을 가중시키고 있다. 뿐만 아니라 유럽의 구당귀(歐當歸.
최근, 약용작물을 포함한 다양한 식물종의 분자생물학적 구분에 관한 연구는 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing, NGS) 등의 염기서열분석 기술의 발달과 함께 급속도로 발전하고 있다. 특히 바코드(barcode) 기술을 이용한 종의 판별에 관한 기술은 기존의 형태학적 특성이나 성상으로는 구분이 어렵고 애매하여 혼·오용이 심각한 한약재에 대한 종의 기원 판별에 큰 발전을 가져오게 하였다. 특히 PCR 기법을 이용한 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 및 simple sequence repeat (SSR) 등은 소량의 DNA를 이용하여 식물의 생장과 관계없이 모든 조직에서 안정적으로 탐색할 수 있으며 비교적 적은 비용으로 빠른 시간 안에 분석할 수 있다는 장점을 가진다(Jo et al. 2013).
당귀 속 식물에서는 현재까지 RAPD 및 SSR 분자마커 등을 사용한 종 식별에 대한 연구 사례들이 보고된 바 있으며(Jeong et al. 2019; Lee et al. 2001; Liao et al. 2013; Mei et al. 2015), 최근 본 연구팀에서는 핵내 리보솜 RNA를 암호 하는 유전자 단편 내 Internal Transcribed Spacer (ITS) 영역의 염기서열을 비교하여 SNP를 확인하고 이를 이용한 Amplification Refractory Mutation System (ARMS)-PCR기술을 적용하여 국내 토종 당귀계통인 참당귀와 세발당귀를 외래 당귀 계통인 일당귀, 중국당귀, 구당귀와 판별한 바 있다(Lee et al. 2021). 최근에는 이러한 SNP를 포함하는 특정 barcode단편을 이용하여 High Resolution Melting (HRM) curve 패턴 분석기술로 특정 계통의 판별에 관한 연구보고가 많아지고 있다. HRM curve 패턴 분석기술은 SNP를 포함하는 약 200 bp의 DNA단편을 대상으로 서서히 온도를 상승시키면서 나타나는 melting curve 패턴을 비교하여 계통 간의 구분이 가능할 뿐만 아니라 이들 계통들이 서로 혼재되어 있는 경우 그 농도까지 예측이 가능한 기술이다(Han et al. 2015; Kim et al. 2018). 실지로 가짜 올리브오일을 판별하기 위하여 해바라기, 땅콩, 옥수수, 참깨, 쌀 등에서 추출한 오일과 올리브오일을 대상으로 HRM curve패턴을 비교한 결과 상호 구분이 가능하였으며 이들이 혼재되어 있는 경우에도 판별이 가능하였다고 하였다(Vietina et al. 2013). 또한 Jaakola et al. (2010)은 HRM 분석기술을 이용하여 야생형을 포함한 다양한 베리(berry)계통의 판별이 가능하였다고 보고하였다. 또한 크리스마스 장미(
실험에서 사용한 당귀 계통은 선행연구에서 사용된 국내 자생하는 참당귀(
수집된 계통별로 일정량의 식물체, 종자 및 한약재 재료 등을 액체질소에 급속 냉동시킨 후 곱게 갈아서 얻은 분말을 이용하여 GeneAll사의 ExgeneTM Plant SV 키트를 이용하여 회사에서 제공한 실험방법에 따라 염색체 DNA를 분리하였다. 정제된 DNA는 1% agarose gel에서 전기영동을 실시하여 DNA의 분리 과정에서의 분해 정도를 확인한 후 Micro-spectrometer (BioPrince, SD-2000, Gangwon, South Korea)를 이용하여 234 nm, 260 nm, 280 nm에서 각각 흡광도를 측정하여
ITS 유전자 내의 SNP를 확인하고자 유전자 단편의 증폭을 위하여 유전자의 염기서열정보를 사용하여 선행연구에서 제작된 프라이머를 이용하였다(Lee et al. 2021). 유전자의 증폭은 iNtRON 회사(Gyeonggi Province, South Korea)에서 제공하는 PCR 반응용 완충 용액 및 i-pfu DNA polymerase를 사용하여 중합반응과정에서 야기될 수 있는 돌연변이를 최소화하였다. 제조사에서 제공하는 실험방법에 따라 순수 분리한 DNA 50 ng과 프라이머를 각각 10 pmole을 혼합한 후 94℃에서 5분간 DNA를 변성 시킨 후 94℃에서 30초, 60℃에서 10초, 72℃에서 30초를 1 cycle로 하여 35 cycle 반복 후 72℃에서 5분간 연장반응을 시킨 후 4℃에서 반응을 종료하고 증폭된 DNA밴드는 2.0% agarose gel을 이용하여 전기영동 하여 그 결과를 확인하였다. 증폭되어진 각 유전자 단편의 클로닝 과정에서 돌연변이가 일어날 수도 있으므로 클로닝을 하지 않고 증폭된 DNA단편을 ExpinTM PCR SV (GeneAll, Seoul, South Korea) Kit를 사용하여 순수 정제한 후 직접 염기서열분석을 의뢰하였다. 또한 최종적으로 확인된 SNP는 최소 5반복 이상 수행하여 검정하였다.
Table 1에서 제시된 프라이머를 이용하여 HRM (High Resolution Melting) curve 패턴을 분석하기 이전에 이들 프라이머가 목표 유전자 단편을 정확하게 증폭 하는지의 여부를 조사하기 위하여 각각의 프라이머 조합을 이용하여 각 당귀 시료들에서 분리한 DNA를 주형으로 PCR로 증폭시켜 전기영동을 통해 확인하였다. 또한 확인된 밴드들을 순수 정제하여 염기서열분석을 한 결과 각각의 종에서 확인된 ITS 유전자와 100% 일치하는 것을 확인한 후 HRM curve 패턴 분석을 실시하였다. 각 당귀 시료에서 분리한 DNA를 각각 10 ng씩 넣고, 프라이머를 각각 5 pmol 넣고 10 μl의 SsoFast™ EvaGreen Supermix BIO-RAD, 172-5200 premixture를 넣고 전체 반응액을 20 μl로 맞춘 후 Mx3005P QPCR Systems (Agilent Technologies, Santa Clara, USA)을 사용하여 HRM curve 분석을 수행하였다.
Table 1 . Primer sequences for high-resolution melting analysis of the internal transcribed spacer (
Gene | Primers | Sequences (5'–3') | Tm (°C) | Size (bp) |
---|---|---|---|---|
Forward | CGAGTCTTTGAACGCAAGTT | 54.6 | 244 | |
Reverse | CTAAGATGACGAGGATTCGC | 54.4 |
선행연구에서 국내 토종 당귀[참당귀(
HRM 분석을 위해 사용될 참당귀 시료의 적정량을 조사하기 위해, 참당귀에서 순수 분리한 DNA를 희석하여 50, 25, 6, 3, 1%를 포함하도록 만든 일정 용액을 대상으로 HRM 패턴을 분석하였다(Fig. 2A). DNA의 농도에 따라 비교분석을 수행한 결과, 점차적으로 농도에 비례하여 melting curve의 peak가 상대적으로 낮아지는 것을 확인할 수 있었으며, 이 결과를 이용하여 표준 농도곡선으로 한다면 어느 정도의 농도를 추산할 수 있을 것으로 사료되었다. 또한, 참당귀를 기준으로 다른 당귀 계통의 DNA를 동일 비율로 혼합한 시료에 대한 HRM 패턴을 비교한 결과, 많은 종류의 시료가 혼합될수록 melting curve의 peak가 비례하여 낮아지는 결과를 확인 할 수 있었다(Fig. 2B). 이는 Fig. 2A의 참당귀의 농도가 낮아지는 경우와 유사한 패턴을 보임으로서, 실제로 표준 곡선을 활용하여 혼재된 시료 내의 참당귀의 순도를 확인할 수 있을 것으로 생각된다.
실제로 시중에서 참당귀가 중국당귀와 혼재되어 있는 경우를 가정하여 참당귀와 중국당귀의 순수 분리한 DNA를 일정비율로 혼합하여 HRM 패턴을 분석하였다(Fig. 3). 참당귀를 기준으로 하여 중국당귀의 농도별( 50, 25, 6, 3, 1%) 비율로 혼합한 경우. 혼합한 중국당귀의 농도가 낮아짐에 따라 peak가 낮아지는 경향을 보이는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 3A). 반대로, 중국당귀를 기준으로 참당귀를 동일한 비율로 혼합한 경우에도 유사한 패턴을 보였다(Fig. 3B). 즉 순수한 중국당귀의 경우 고유한 낮은 peak를 보이는 것이 50%의 비율로 참당귀를 혼합한 경우, 참당귀의 패턴과 유사하게 peak가 증가한 후 농도가 낮아짐에 따라 점차 peak가 비례하여 낮아지는 경향을 보였다. 결론적으로 종합하면, 순수한 하나의 계통만을 대상으로 한 경우에는 농도가 높아짐에 따라 비례하여 peak가 증가하지만, 다른 당귀 계통을 혼합한 경우 간섭에 의하여 peak가 달라지며 혼합 계통의 농도가 증가함에 따라 peak도 높아지는 것을 알 수 있었다. 그러나 3종류 이상의 다양한 당귀계통을 혼합 할 경우는 패턴의 예측이 쉽지 않은 경향을 보였다.
이상의 연구결과를 종합하여 보면 ITS 단편내 단일염기다형성을 포함하도록 제작한 범용 프라이머 조합은 국내외에서 수집된 5종의 다양한 당귀계통들에 대하여 정확하게 예상한 크기의 DNA 단편을 확인하였다. 이들 증폭된 DNA단편에 대한 염기서열 분석을 통하여 핵산증폭반응 과정에 어떠한 변이현상이 일어나지 않았음을 확인한 후, HRM 패턴을 비교한 결과 5계통을 확실하게 구분할 수 있었다. 특히 국내 자생종인 세발당귀는 참당귀와 비교할 때 식물의 형태학적으로 거의 구분이 불가능한 자생형 ecotype으로 본 연구에서 확인한 ITS 단편내에도 단 하나의 SNP만 확인될 정도로 염기서열도 거의 동일하였다. 하지만 서로 다른 HRM 패턴을 보여 본 기술의 정확도를 확인할 수 있었다. 따라서 선행연구에서 보고된 ARMS-PCR 기술을 적용하여 개발한 판별 마커(Lee et al. 2021)를 사용하여 시중에서 수집된 시료를 대상으로 먼저 진위 여부를 확인하고 HRM 분석기술로 재확인을 한다면 유통시장에서 무작위로 수집된 시료에 대한 판별의 신뢰도를 높이는데 크게 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
이에 더하여, 순수 분리한 DNA의 농도를 달리한 경우에 확인된 농도 별 HRM 패턴은 향후 표준곡선으로 활용이 가능할 것으로 사료되었다. 또한, 다양한 당귀 계통들이 식물 그 자체 또는 건조 등의 부분적인 가공과정을 거친 시료들이 서로 혼합하여 유통되는 경우에도 확인이 가능할 것으로 조사되었다. 하지만 본 연구에서는 공인된 당귀계통들에 대한 시료를 확보하여 염기서열분석을 통하여 해당 당귀 계통의 진위여부를 확인한 계통들을 대상으로 순수 분리 정제한 DNA를 서로 혼합하여 수행한 연구결과로, 향후 유통현장에서 실용화하기 위하여서는 생체 시료, 건제품 또는 분말 상태에서 혼합된 시료를 대상으로 한 분석이 먼저 수행되어야 할 것이다. 또한, DNA가 분해되기 쉬운 탕재 및 각종 가공된 한약재와 식품 등을 대상으로 추가 연구가 수행되어야 할 것으로 사료된다.
당귀는 약용으로 널리 사용되는 대표적인 다년생 식물이다. 다양한 당귀 계통의 유전적 다양성에 대한 정보는 당귀의 유전자원의 발굴 및 보존의 차원에서 매우 중요하다. 당귀는 현재 한국에 등록 된 중요한 약용 식물 종이지만, 다른 나라의 다른 유사한 종과 구별 할 수 있는 분자표지가 없는 실정이다. 그러므로, 본 연구에서는 HRM 분석을 통해 국내 토종 당귀계통인 참당귀를 식별하기 위해 유전체 염기서열의 핵 리보솜 DNA 내부(ITS)영역에서 단일염기다형성(SNP) 분자표지를 개발하였다. 본 연구에서는 또한 5가지 당귀계통들의 혼합된 염색체 DNA 시료를 이용하여 HRM 분석을 수행하였으며, 최종적으로는 혼합된 염색체 DNA의 다양한 비율을 사용하여 혼용되는 대표적인 당귀계통인 참당귀와 중국당귀를 재료로 HRM 분석을 진행하였다. 그러므로, 본 연구에서 개발된 SNP 분자표지는 다양한 지역 또는 국가에서 서식하는 당귀 계통들의 신속한 확인을 위해 매우 유용하게 이용될 것으로 생각된다.
본 연구는 농림축산식품부 농생명산업기술개발사업(과제번호:314021-03-1-SB050)에 의해 이루어진 결과입니다.
Table 1 . Primer sequences for high-resolution melting analysis of the internal transcribed spacer (
Gene | Primers | Sequences (5'–3') | Tm (°C) | Size (bp) |
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Forward | CGAGTCTTTGAACGCAAGTT | 54.6 | 244 | |
Reverse | CTAAGATGACGAGGATTCGC | 54.4 |
Shin-Woo Lee ·Soo Jin Lee ·Eun-Hee Han ·Yong-Wook Shin ·Yun-Hee Kim
J Plant Biotechnol 2021; 48(1): 26-33Shin-Woo Lee, Soo Jin Lee, and Yun-Hee Kim
J Plant Biotechnol 2018; 45(2): 102-109Ick-Hyun Jo, Kyong-Hwan Bang, Chi Eun Hong, Jang-Uk Kim, Jung-Woo Lee, Dong-Hwi Kim, Dong-Yun Hyun, Hojin Ryu, and Young-Chang Kim
J Plant Biotechnol 2016; 43(4): 417-421
Journal of
Plant Biotechnology