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J Plant Biotechnol (2023) 50:034-044

Published online April 26, 2023

https://doi.org/10.5010/JPB.2023.50.005.034

© The Korean Society of Plant Biotechnology

Solanum hjertingii 색소체 유전자형 선발을 위한 PCR 기반 분자마커 개발

박태호

대구대학교 원예학과

Received: 31 March 2023; Revised: 12 April 2023; Accepted: 12 April 2023

Development of PCR-based markers for selecting plastid genotypes of Solanum hjertingii

Tae-Ho Park

(Department of Horticulture, Daegu University, Gyeongsan 38453, South Korea)

Correspondence to : e-mail: thzoo@daegu.ac.kr

Received: 31 March 2023; Revised: 12 April 2023; Accepted: 12 April 2023

This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

The tetraploid Solanum hjertingii, a wild tuber-bearing species from Mexico is a relative of potato, S. tuberosum. The species has been identified as a potential source of resistance to blackening for potato breeding. It does not exhibit enzymatic browning nor blackspot which are physiological disorders. However, due to their sexual incompatibility, somatic hybridization between S. hjertingii and S. tuberosum must be used to introduce various traits from this wild species into potato. After somatic hybridization, molecular markers are essential for selecting fusion products. In this study, the chloroplast genome of S. hjertingii was sequenced by next-generation sequencing technology and compared with those of other Solanum species to develop specific markers for S. hjertingii. The chloroplast genome has a total sequence length of 155,545 bp, and its size, gene content, order and orientation are similar to those of the other Solanum species. Phylogenic analysis including 15 other Solanaceae species grouped S. hjertingii with S. demissum, S. hougasii, and S. stoloniferum. After detailed comparisons of the chloroplast genome sequence with eight other Solanum species, we identified one InDel and seven SNPs specific to S. hjertingii. Based on these, five PCR-based markers were developed for discriminating S. hjertingii from other Solanum species. The results obtained in this study will aid in exploring the evolutionary aspects of Solanum species and accelerating breeding using S. hjertingii.

Keywords cpDNA, InDels, PCR-based marker, Potato, SNPs, Solanum hjertingii

재배종 감자(Solanum tuberosum L.)의 근연야생종 중 하나인 멕시고 원산의 괴경을 형성하는 Solanum hjertingii는 괴경에서 발생하는 흑변현상(Blackspot bruising)에 강해 생리적 장해인 효소적 갈변과 흑반을 감소시키는 것으로 알려져 있어 감자의 신품종 육성에 유용한 형질로 이용이 가능하다(Culley et al. 2002; Hara-Skrzypiec and Jakuczun 2013; Hawkes 1990; Sim et al. 1997). 뿐만 아니라, 본 연구와 함께 수행되고 있는 연구에서 S. hjertingii는 역병저항성, 건조저항성, 내염성 등과 같은 다양한 생물학적 및 비생물학적 요인들에 저항성이 있는 것으로 확인되었다. 이러한 이유로 S. hjertingii가 가지고 있는 유용 형질을 이용하여 감자 신품종 육성에 이용하기 위한 시도가 지속되고 있으나, S. hjertingiiS. tubersoum이 모두 4배체 임에도 불구하고 각각 2와 4의 서로 다른 EBN (Endosperm Balanced Number)으로 인해 발생하는 교잡불화합성이 교배육종을 불가능하게 한다(Cho et al. 1997; Culley et al. 2002; Hawkes 1990; Ortiz and Ehlenfeldt 1992). 교잡불화합성의 근연야생종이 가지고 있는 유용 형질을 재배종 감자에 도입하기 위해서 교잡 가능한 다른 야생종과의 순차적 교배에 의한 형질의 도입이나 체세포융합에 의한 체세포잡종 계통의 육성과 같은 방법들이 이용될 수 있다(Binding et al. 1982; Hermsen 1966; Hermsen and Ramanna 1973; Iwanaga et al. 1991; Luthra et al. 2019; Park et al. 2005). S. hjertingii를 이용한 순차적 교배는 한차례 시도된 바가 있으나(Culley et al. 2002), 체세포융합에 의한 체세포잡종 계통의 육성은 아직 시도된 바가 없어 본 연구와 함께 연구가 진행중에 있으며, 향후 체세포잡종 계통 육성 시 잡종 계통의 세포질 유전체 구성을 확인하기 위한 목적으로 엽록체 유전체 정보 기반의 S. hjertingii 특이적 분자마커를 개발하게 되었다.

속씨식물의 엽록체 유전체는 일반적으로 원형의 이중가닥 분자구조를 가지고 있으며, 그 크기는 약 115-165 kb이고 large single copy (LSC), small single copy (SSC), 두 개의 inverted repeats (IRs) 영역을 가지는 전형적인 4분할 구조로 되어 있다(Yurina and Odintsova 1998). 재배종 감자와 감자의 근연야생종 또한 앞서 보고된 바와 같이 이와 매우 유사한 것으로 확인되었다(Palmer 1991; Raubeson and Jansen 2005; Saski et al. 2005; Sugiura et al. 1998) (Table 1). 그러나, 엽록체 유전체는 유전자의 재배열, 역위 등과 같은 구조적 변화에 의한 변이 발생으로 종간의 전체 엽록체 유전체를 비교해보면 종간의 염기서열 차이에 의해 발생하는 다수의 InDel과 SNP가 존재함을 알 수 있다(Calsa Junior et al. 2004; Cho et al. 2015; Jheng et al. 2012; Kim et al. 2005, 2018; Kim and Park 2019, 2020a, 2020b; Park 2021, 2022a, 2022b; Saski et al. 2005). 따라서, 본 연구에서는 Park (2022c)에 의해 알려진 S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체의 세부 분석 결과와, 이를 이용한 S. hjertingii 특이적 분자마커의 개발 결과를 제공하고자 한다.

Table 1 . Chloroplast genome sequence characteristics of S. hjertingii and 12 other Solanaceae species.

SpeciesAccession no.Total Length (bp)GC content (%)Total No. of genesNo. of tRNANo. of rRNAReference
S. hjertingiiMK690623155,54537.88134364In this study
S. acauleMK036506155,57037.84135364Park (2022b)
S. brevicauleMK036507155,53137.87135364Park (2022a)
S. demissumMK036508155,55837.87135364Park (2021)
S. hougasiiMF471372155,54937.87135364Kim and Park (2020b)
S. stoloniferumMF471373155,56737.87135364Kim and Park (2020a)
S. chacoenseMF471371155,53237.89136364Kim and Park (2019)
S. berthaultiiKY419708155,53337.88137394Kim et al. (2018)
S. commersoniiKM489054155,52537.88133334Cho et al. (2016)
S. nigrumKM489055155,43237.90139394Cho and Park (2016)
S. tuberosumKM489056155,31237.88130304Cho et al. (2016)
S. bulbocastanumDQ347958155,37137.88133304Daniell et al. (2006)
S. tuberosumNC008096155,29637.88131364Gargano et al. (2005)

*The data have been partially adopted from Park (2022b).


식물재료 및 DNA 분리

S. hjertingii 특이적 분자마커 개발에는 전체 엽록체 유전체 분석에 이용된 감자의 근연야생종 S. hjertingii (PI18 6559) 계통 SH1-16 (Park 2022c)과 S. hjertingii의 다른 계통 SH1-14가 추가되었으며, 재배종 감자 품종인 ‘대서’ (DS), ‘대지’ (DJ), ‘수미’ (SM), 그리고 총 14개 계통의 야생종이 이용되었다. 경산지역에서 자체적으로 수집한 S. nigrum (SN)을 제외한 모든 식물체는 국립식량과학원 고령지농업연구소로부터 분양받아 기내식물체로 유지하며 증식하여 이용되었으며, S. nigrum을 제외한 13개의 야생종은 S. acaule (PI310970, SA), S. berthaultii (PI310981, SB1), S. brevicaule (PI205394, SB2), S. candolleanum (PI210035, SC4), S. cardiophyllum (PI341233, SC1), S. commersonii (PI 558050, SC2), S. hougasii (PI161174, SH2), S. iopetalum (PI 230459, SI), S. jamesii (PI578326, SJ), S. kurtzianum (PI578236, SK), S. mochiquense (PI338616, SM1), S. pinnatisectum (PI190115, SP), S. stoloniferum (PI160224, SS)이다.

DNA 분리에는 Genomic DNA Extraction kit (Plants) (RBC, New Taipei City, Taiwan)가 사용되었으며, 모든 식물재료의 기내식물체를 계대배양 후 약 100 mg의 유식물체를 채취하여 수행되었다.

S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체 분석

S. hjertingii의 전체 유전체 분석에는 S. hjertingii의 계통인 SH1-16의 전체 DNA를 추출하여 이용하였으며, 전체 염기서열을 얻기 위해 Macrogen (Macrogen, Seoul, South Korea)의 Illumina Hiseq2000 (Illumina, SanDiego, CA, USA)의 플랫폼이 이용되었다. 얻어진 전체 염기서열 정보는 파이젠에 구축되어 있는 생물정보학 파이프라인(http://phyzen.com)의 de novo assembly에 의한 분석과정을 통해 완성되었다(Cho et al. 2015). 초기의 염기서열 조립은 CLC assembly cell package version 4.2.1 내의 프로그램이 이용되었다. 우선 Phred score 20 이상의 신뢰도 높은 염기서열 만을 CLC quality trim 프로그램에서 trimming하고, CLC de novo assemble 프로그램의 dnaLCW 방법으로 조립하였다. 이후 엽록체 유래의 염기서열로 구성된 contig를 추출하고 contig 확장과 통합을 거쳐 gap-filling하여 S. hjertingii의 엽록체 유전체 전체를 완성하였으며, trimmed read를 mapping하여 mapped read depth를 계산하고, BLASTN을 통해 확인된 homology가 가장 높은 종인 S. hougasii의 전체 엽록체 유전체(MF471372, Kim and Park 2020b)와 BLASTZ (Schwartz et al. 2003) 분석으로 확인하였다.

S. hjertingii 엽록체 전장 유전체에 존재하는 유전자는 Geseq 프로그램으로 확인하였고(Tillich et al. 2017), BLAST search를 기반으로 manual curation 과정을 거쳐 최종 유전자 부위를 확인하였다. 엽록체 유전체의 모든 특성들은 CPGView 프로그램을 통해 원형의 유전자지도에 표시되었으며, 추가로 trans 및 cis slicing 유전자에 대한 지도 또한 작성되었다(Liu et al. 2023, http://www.1kmpg.cn/cpgview/).

엽록체 유전체 비교 및 PCR 기반 분자마커 개발

S. hjertingii 엽록체 전장 유전체 정보를 이용한 계통발생학적 유전관계 분석을 위해 the National Center for Biotechnology Information (NCBI)로부터 감자 재배종 S. tuberosum (KM489056 및 NC008096), 가지과의 고추 Capsicum annuum (JX270811), 토마토 S. lycopersicum (NC007898), 까마중 S. nigrum (KM489055)과 감자의 근연 야생종 9종 S. acaule (MK036506), S. berthaultii (KY419708), S. brevicaule (MK036507), S. bulbocastanum (DQ347958), S. chacoense (MF471371), S. commersonii (KM489054), S. demissum (MK 036508), S. hougasii (MF471372), S. stoloniferum (MF471373) 등 총 15개의 엽록체 전장 유전체 염기서열을 확보하였다. 이들로부터 확인된 엽록체 코딩 서열을 MEGA6.0 프로그램으로 분석하였으며, Kimura 2-parameter 모델 기반의 Maximum likelihood 방법이 이용되었으며 1,000번의 Bootstrap 옵션을 적용하였다(Tamura et al. 2013).

S. hjertingii 특이적 분자마커는 S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체 염기서열을 NCBI로부터 얻은 S. berthaultii (KY 419708), S. bulbocastanum (DQ347958), S. cardiophyllum (MK690622), S. commersonii (KM489054), S. hougasii (MF 471372), S. jamesii (MK690624), S. tuberosum (KM489056), S. verrucosum (MK690625)의 전체 엽록체 유전체 염기서열과 ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)에 의해 다중 정렬하여 S. hjertingii 특이적 InDel 및 SNP를 구명한 후, S. hjertingii 특이성 검증 과정을 거쳐 개발되었다. InDel의 경우에는 InDel이 있는 영역에서 primer를 디자인하여 allele 특이적으로 나타나는 분자마커를 개발하고자 하였으며, SNP는 tetra-primer ARMS-PCR 방법을 적용하여 primer를 제작하여(Collins and Ke 2012; Ye et al. 2001), S. hjertingiiS. tuberosum을 포함하여 총 19개의 유전자 계통, S. hjertingii (SH1-16 및 SH1-14), S. tuberosum (감자품종 ‘대서’ (DS), ‘대지’ (DJ), ‘수미’ (SM)), S. nigrum (SN), S. cardiophyllum (SC1), S. jamesii (SJ), S. iopetalum (SI), S. acaule (SA), S. berthaultii (SB1), S. brevicaule (SB2), S. commersonii (SC2), S. candolleanum (SC4), S. hougasii (SH2), S. kurtzianum (SK), S. mochiquense (SM1), S. pinnatisectum (SP), S. stoloniferum (SS)을 대상으로 PCR을 진행하였다. InDel 기반의 분자마커 개발을 위한 PCR은 Thermocycler (Biometra, Göttingen, Germany)를 이용하여 총 25 ul (약 20 ng genomic DNA, 10 pMol each primer, 0.5 mM dNTPs, 1 U Taq polymerase (Genetbio, Daejeon, South Korea))으로, SNP 기반의 분자마커 개발을 위한 PCR은 총 25 ul (약 20 ng genomic DNA, 10 pMol each inner primer, 1 pMol each outer primer, 0.5 mM dNTPs, 1 U Taq polymerase (Genetbio, Daejeon, South Korea))으로 수행되었다. PCR은 RedSafe (Intron Biotechnology, Seongnam, South Korea)로 염색하여 1% agarose gel에서 확인하였다.

감자 야생종 S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체

S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체는 NGS 기술에 의해 완성되었다(Park 2022b). 추가로 S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체의 완성 과정과 결과를 세부적으로 기술하면, 4,907,888 read를 통해 총 염기서열 약 1.5 Gbp를 생산하였다. 이중 약 91.4%의 정보를 CLC quality trim 프로그램으로 전처리하고 Phred score 20 이상의 결과를 추출하여, 전체 염기서열 중 high-quality 서열인 평균 283.5 bp 길이의 총 염기서열 정보 약 1.27 Gbp를 얻었다. 이는 전체 raw data의 약 86.1%로, 앞서 보고된 S. brevicaule의 전장 유전체 분석 결과에서 얻은 총 염기서열이 2.46 Gbp와 비교하여 거의 절반 밖에 되지 않지만, 전체 염기서열 대비 추출 염기서열의 비율은 오히려 약 9% 많은 수준으로 데이터가 효율적으로 이용되었다(Park 2022a). 또한, de novo assembly, contig 선발, 확장 및 통합, 그리고 gap-filling 과정 등을 거쳐 155,545 bp (MK690623)의 S. hjertingii 엽록체 전장 유전체가 완성되었으며, 결과적으로 aligned read 수는 약 21만 4천개, 엽록체 유전체 평균 coverage는 약 385.9x, 전체 trimmed read를 완성된 유전체 서열에 mapping하여 확인한 read depth는 약 200-500으로 S. brevicaule 등 다른 근연야생종의 엽록체 전장 유전체의 완성된 결과 보다는 다소 적은 데이터가 이용되기는 하였으나 충분히 신뢰할 만한 결과를 보여주었다(Park 2022a). 구조는 85,976 bp의 LSC, 18,383 bp의 SSC, 그리고 한 쌍의 25,593 bp 크기의 IRa 및 IRb로 구성된 원형 이중가닥 분자로 다른 식물의 엽록체 유전체와 동일하였으며, S. hougasii의 전체 엽록체 유전체 염기서열(MF471372, Kim and Park 2020b)과의 비교 및 BLASTZ 분석(Schwartz et al. 2003)으로도 유사성을 확인하였다. S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체 염기서열을 NCBI에서 Blastn 한 결과 S. hougasii (MF471372), S. stoloniferum (MF471373)과 각각 99.97%, 99.96%의 높은 유사도를 보였으며, GC 비율도 37.88%로 매우 유사하였다(Table 1).

S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체에는 105개의 단백질 코딩, 45개의 tRNA, 8개의 rRNA를 포함한 총 158개의 유전자가 있었으며, 이중 11개의 단백질 코딩 유전자, 9개의 tRNA, 4개의 rRNA는 한 쌍의 IR영역 IRa 및 IRb에 역배열로 중복되어 존배하고 있었다(Table 1, Fig. 1). 전체 염기서열 중 59.3%가 코딩 영역으로 158개의 유전자 평균 길이가 약 583.3 bp로, 이 중 단백질 코딩 유전자, tRNA, rRNA가 각각 평균 765.0 bp, 62.0 bp, 1,132.0 bp의 크기로 51.6%, 1.8%, 5.8%의 비율로 분포하며, Solanum 속의 다른 종들과 모두 유사하였다(Table 1). IR영역에서 중복되어 존재하는 2개의 유전자(rpl2, ndhB)를 포함하여 총 13개의 유전자(rps16, atpF, rpoC1, ycf3, clpP, petB, petD, rpl16, ndhA)는 cis-splicing 유전자이며, rps12는 tran-splicing 유전자로 확인되었다 (Fig. 2A and 2B).

Fig. 1. Schematic map of the overall features of the S. hjertingii chloroplast genome. From the center outward, the first track shows the dispersed repeats, consisting of direct and palindromic repeats, connected with red and green arcs. The second track shows the long tandem repeats as short blue bars. The third track shows the short tandem repeats as short bars with different colors. The colors, the type of repeat they represent, and the description of the repeat types are as follows. Black, green, and yellow represent complex repeat, repeat unit size = 1, and repeat unit size = 2, respectively. The small single-copy (SSC), inverted repeat (IRa and IRb), and large single-copy (LSC) regions are shown on the fourth track. The GC content along the genome is plotted on the fifth track. The genes are shown on the sixth track, color-coded by their functional classification as described in the bottom left corner. The optional codon usage bias is displayed in the parentheses after the gene name. The transcription directions for the inner and outer genes are clockwise and counterclockwise, respectively
Fig. 2. Schematic map of the cis- (A) and trans- (B) splicing genes in the S. hjertingii chloroplast genome. The 13 cis-splicing genes are arranged from top to bottom based on their order in the chloroplast genome. The gene names are shown on the left, and the gene structures are on the right with exons in black and introns in white (lengths not to scale). The arrow indicates the sense direction of the gene. The trans-splicing gene rps12 in the chloroplast genome has three unique exons, two of which being located in the IR regions, are duplicated

엽록체 유전체 비교 및 계통수

S. hjertingii의 엽록체 유전체와 가지과의 다른 15종의 엽록체 유전체의 코딩 서열을 비교하여 계통수를 작성하였다(Fig. 3). S. hjertingii는 계통수에서 감자의 근연야생종 중 S. demissum (MF036508), S. hougasii (MF471372), S. stoloniferum (MK471373)과 유연관계가 가장 가까우며, 이는 앞서 확인된 엽록체 전장 유전체의 전체 염기서열을 Blast 한 결과와도 일치하였다. 같은 가지과 내에서는 토마토(S. lycopersicum), 까마중(S. nigrum), 고추(Capsicum annuum)와는 상대적으로 유연관계가 멀었다. 또한, S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체 염기서열을 감자 재배종 및 7개의 근연야생종 전체 엽록체 유전체 염기서열을 EMBL의 ClustalW2 (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)로 다중 정렬한 결과 S. hjertingii 특이적인 1개의 InDel과 7개의 SNP를 확인하였다(Fig. 4). S. hjertingii 특이적 InDel과 SNP의 수는 상대적으로 적었는데, 이는 다중 정렬에 S. hjertingii의 유전체와 유사도가 매우 높은 S. hougasii가 포함된 결과로 유추할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 동일한 가지속에 속한 재배종 감자와 근연야생종들이 다양한 유전적 요인에 의해 발생할 수 있는 변이에 의해 S. hjertingii 특이적인 InDel과 SNP가 존재하며, 이를 활용한 S. hjertingii 특이적 분자마커의 개발을 가능하게 하였다(Cho and Park 2016; Chung et al. 2006; Kim et al. 2018; Kim and Park 2019, 2020a, 2020b; Park 2021, 2022a, 2022b). 하나의 InDel은 유전자 영역에 존재하였으며, 7개의 SNP 중, 4개는 유전자 영역에 3개는 유전자 간 영역에 분포하고 있었다. 4개의 유전자 영역에 존재하는 SNP의 경우 모두 유전자의 intron에 존재하는 것으로 확인되었다.

Fig. 3. Maximum-likelihood phylogenetic tree of S. hjertingii with 15 other Solanaceae family members based on their chloroplast genome protein-coding sequences. Bootstrap values from 1,000 replicates are shown on each node
Fig. 4. Multiple alignments of the sequences on the intergenic or intragenic regions containing the InDels and SNPs used to develop the PCR-based markers. The chloroplast genome sequences of S. cardiophyllum (SC1_9: MK690622), S. jamesii (SJ8: MK690624), S. bulbocastanum (Sblb: DQ347958), S. berthaultii (Sber: KY419708), S. tuberosum (Stub: KM489056), S. verrucosum (SV1_4: MK690625), S. hougasii (SH2_10: MF471372), S. hjertingii (SH1_16: MK690623), and S. commersonii (Scmr: KM489054) were listed from top to bottom for each InDel and SNP region. The regions of the InDels and SNPs detected in S. hjertingii are in bold, highlighted, and underlined

S. hjertingii 특이적 분자마커 개발

S. hjertingii를 포함한 9종의 전체 엽록체 유전체 염기서열의 다중 정렬 결과로 확인된 S. hjertingii 특이적 InDel과 SNP는 S. hjertingii 특이적인 분자마커 개발에 이용되었다. InDel은 InDel 영역 특이적인 primer를 제작하여 PCR을 통해 다형성의 차이가 나타나는 S. hjertingii 특이적인 SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) 마커의 개발이 가능하였다(Cho et al. 2015; Garcia-Lor et al. 2013; Park 2022b; Yamaki et al. 2013) (Table 2 and Fig. 5A). SNP의 경우, 존재하는 S. hjertingii 특이적 SNP 영역을 기준으로 SNP를 포함하는 DNA 단편과 SNP 영역을 대상으로 S. hjertingii 특이적 또는 S. hjertingii를 제외한 Solanum 종 특이적인 DNA 단편을 증폭할 수 있는 tetra-primer ARMS-PCR 방법(Collins and Ke 2012; Ye et al. 2001)을 적용하여 primer를 제작하였다(Table 2). Tetra-primer ARMS-PCR 방법은 다양한 생명체를 대상으로 SNP가 존재하는 계통간의 비교를 PCR 방법으로 손쉽게 구명할 수 있는 방법으로 널리 활용되고 있으며(Kou et al. 2017; Mahmoudi et al. 2019; Zou et al. 2018), 본 연구에서도 간편히 큰 비용을 들이지 않고 Solanum 종간의 구별이 가능한 SNP 정보를 활용한 PCR 기반의 S. hjertingii 특이적인(Fig. 5B, 5C, 5D) 또는 비특이적인(Fig. 5B, 5C, 5D, 5E) 4개의 분자마커를 개발할 수 있었다. 이중 SH1_InDel1 (Fig. 4 and Fig. 5A)는 ycf1 유전자에 존재하는 InDel 기반으로 개발되었고, SH1_ SNP1 (Fig. 4 and Fig. 5B)과 SH1_SNP6(Fig. 4 and Fig. 5E)은 각각 trnS과 rpl16 유전자 내의 Intron 영역에, SH1_SNP2 (Fig. 4 and Fig. 5C)와 SH1_SNP3 (Fig. 4 and Fig. 5D)은 각각 psaAycf3ycf4cemA 유전자 사이에 존재하는 SNP 기반으로 개발되었다.

Table 2 . Primers for generating S. hjertingii specific and non-specific markers

InDel/SNPSystemPrimer sequence (5’ → 3’)Touchdown PCRAnnealing temperature (°C)Amplicon size
SH1-16_InDel1Forward primerAGTTTCTTATGTTTTAATTCCNo58 °C531 bp (insert sequence ‘tttattagg’ specific to S. hjertingii)
Reverse primerTCCTAATAAACCTAATAAAAC

SH1-16_SNP1Forward inner primerGTATGAATAAAGGATCCATGGATGCAANo54 °C313 bp (from two outer primers)
198 bp (A allele specific to S. hjertingii)
171 bp (G allele non- specific to S. hjertingii)
Reverse inner primerTAGTTACGATTAGAAATAAACTTTCTCTC
Forward outer primerAGAACAAATACACATTATCGTGATTTGT
Reverse outer primerTTTCTATTTAATAGGATCCTGAGGAAAA

SH1-16_SNP3Forward inner primerGGACCTTTTAACCTTTTAAAAACCCTTGTGYes70 °C to 61 °C336 bp (from two outer primers)
246 bp (A allele specific to S. hjertingii)
181 bp (G allele non- specific to S. hjertingii)
Reverse inner primerAAGTCGTTTTTGGATCAATCCAAAGACT
Forward outer primerCGCCAACAGTCAAATAATTAGTGAACCT
Reverse outer primerTAGTAATGTCTAATGGCTACTCGCGTGA

SH1-16_SNP5Forward inner primerAGAATCAGAACGTTCATTCAATTGAAYes70 °C to 61 °C397 bp (from two outer primers)
260 bp (C allele specific to S. hjertingii)
190 bp (A allele non- specific to S. hjertingii)
Reverse inner primerTTTATGGTTCTTTCATATACGTTTCCG
Forward outer primerCGATTCCTTATAAAAGATATTCAGTCCG
Reverse outer primerATTGAACTAAAAAAAATTCTTGCTTTCG

SH1-16_SNP6Forward inner primerCTATTAGTAATTTGTATATCTTGTTGGGNo54 °C214 bp (from two outer primers)
144 bp (A allele non- specific to S. hjertingii)
Reverse inner primerTTAGAAAACTACAAAGTTTAGTTATCTCTT
Forward outer primerAGCTAGAATAGTCAATCTTAAGTTAAGAT
Reverse outer primerAAATTTAGGACAATACAATAAAGGAC

Fig. 5. PCR-based markers for discriminating S. hjertingii from other Solanum species. A: SH1-16_InDel1. B: SH1-16_SNP1. C: SH1-16_SNP3. D: SH1-16_SNP5. E: SH1-16_SNP6. The marker SH1-16_InDel1 is positively specific to S. hjertingii while the marker SH1-16_SNP6 is negatively specific to S. hjertingii. Markers SH1-16_SNP1, SH1-16_SNP3, and SH1-16_SNP5 are both positively and negatively specific to S. hjertingii. SH1-16 and SH1-14 indicate two different lines of S. hjertingii (PI186559). SN is S. nigrum collected in Gyeongsan, South Korea. M, DS, DJ, SM, SC1, SJ, SI, SA, SB1, SB2, SC2, SC4, SH2, SK, SM1, SP, and SS indicate a size marker ladder, potato varieties ‘Daeseo’, ‘Daeji’, ‘Sumi’, S. cardiophyllum (PI341233), S. jamesii (PI578326), S. iopetalum (PI230459), S. acaule (PI310970), S. berthaultii (PI310981), S. brevicaule (PI205394), S. commersonii (PI558050), S. candolleanum (PI210035), S. hougasii (PI161174), S. kurtzianum (PI578236), S. mochiquense (PI338616), S. pinnatisectum (PI190115), and S. stoloniferum (PI160224), respectively. Red and yellow arrows indicate positive and negative bands on S. cardiophyllum, respectively

감자와 감자의 근연야생종의 엽록체 전장유전체의 전체 염기서열을 구명하고 이 정보를 이용하여 유전자형을 구분할 수 있는 감자 또는 감자의 근연야생종 특이적인 분자마커의 개발은 핵 내의 염색체 DNA를 대상으로 분자마커를 개발하는 것과 함께 감자의 신품종 육성과 Solanum 속의 식물들 간의 진화학적 연구에 기여할 수 있을 것이다(Bohs and Olmstead 1997; Hosaka and Sanetomo 2012). 특히, 감자의 신품종 육성을 위해 다양한 근연야생종이 가지고 있는 유용 형질을 활용하고자 하는 노력이 지속적으로 이루어지고 있으나, 배수성 및 EBN의 차이로 교배육종이 잘 이루어지지 않아 원형질체를 이용한 체세포융합에 의한 체세포잡종을 육성하고자 하는 노력이 진행되고 있다. 이러한 과정에서 체세포잡종의 핵내 유전체 정보 뿐 만 아니라, 세포질의 유전체 정보를 이용한 유전자형을 확인하는 작업이 필요한데, Solanum 속 및 다양한 식물종에서 체세포융합 과정에서 세포질에 존재하는 미토콘드리아 유전체에서는 높은 빈도의 재조합이 발생하나 엽록체 유전체의 경우 한 쪽의 엽록체 유전체만 무작위로 전달이 되는 경우 뿐 만 아니라 양친의 유전체 모두가 전달되는 경우도 있었다(Chen et al. 2013; Cho et al. 2016; Lössl et al. 2000; Mohapatra et al. 1998; Smyda-Dajmund et al. 2016; Wang et al. 2011; Xiang et al. 2004). 따라서, 본 연구의 결과인 InDel 및 SNP 기반의 분자마커는 S. hjertingii를 이용한 감자의 신품종 육성 과정에서 체세포잡종을 육성하여 S. hjertingiiS. tuberosum 유래의 엽록체 유전체의 유전자형 판별에 이용될 수 있을 것이다.

멕시코 유래의 4배체 감자 근연야생종 중 하나인 Solanum hjertingii는 괴경에서 발생하는 흑변현상에 강한 것으로 알려져 감자의 신품종 육성에 유용한 형질로 이용이 가능하다. 이러한 저항성은 생리적 장해인 효소적 갈변과 흑반을 감소시킬 수 있다. 하지만, S. hjertingiiS. tuberosum은 생리적 장벽에 기인한 교잡종 생산이 제한적인 관계로 직접적인 교배육종보다는 체세포잡종을 육성하는 방법을 활용할 수 있다. 체세포잡종 계통이 육성이 되면 분자표지를 이용한 적절한 잡종 계통을 선발하는 것이 필요하여, 본 연구에서는 S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체 정보를 이용하여 S. hjertingii 특이적인 PCR 기반의 분자마커를 개발하였다. S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체는 155,545 bp였으며, 다른 Solanum 종들과 구조 및 유전자 구성이 매우 유사하였고, 가지과의 다른 15개의 종들과 계통수 분석에서 근연야생종 S. demissum, S. hougasii, S. stoloniferum과 매우 가까운 유연관계를 나타냈다. 또한, S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체와 8개의 다른 Solanum 종의 전체 엽록체 유전체의 다중 정렬 결과로 S. hjertingii 특이적인 1개의 InDel 영역과 7개의 SNP 영역을 확인하였고, 이를 이용하여 1개의 InDel 및 4개의 SNP 기반 PCR마커를 개발하였다. 본 연구의 결과는 S. hjertingii의 진화적 측면에서의 연구와 S. hjertingii를 이용한 감자의 신품종 육성 연구에 기여를 할 수 있을 것이다.

이 성과는 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임(No. NRF-2021R1F1A1045981).

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Article

Research Article

J Plant Biotechnol 2023; 50(1): 34-44

Published online April 26, 2023 https://doi.org/10.5010/JPB.2023.50.005.034

Copyright © The Korean Society of Plant Biotechnology.

Solanum hjertingii 색소체 유전자형 선발을 위한 PCR 기반 분자마커 개발

박태호

대구대학교 원예학과

Received: 31 March 2023; Revised: 12 April 2023; Accepted: 12 April 2023

Development of PCR-based markers for selecting plastid genotypes of Solanum hjertingii

Tae-Ho Park

(Department of Horticulture, Daegu University, Gyeongsan 38453, South Korea)

Correspondence to:e-mail: thzoo@daegu.ac.kr

Received: 31 March 2023; Revised: 12 April 2023; Accepted: 12 April 2023

This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

The tetraploid Solanum hjertingii, a wild tuber-bearing species from Mexico is a relative of potato, S. tuberosum. The species has been identified as a potential source of resistance to blackening for potato breeding. It does not exhibit enzymatic browning nor blackspot which are physiological disorders. However, due to their sexual incompatibility, somatic hybridization between S. hjertingii and S. tuberosum must be used to introduce various traits from this wild species into potato. After somatic hybridization, molecular markers are essential for selecting fusion products. In this study, the chloroplast genome of S. hjertingii was sequenced by next-generation sequencing technology and compared with those of other Solanum species to develop specific markers for S. hjertingii. The chloroplast genome has a total sequence length of 155,545 bp, and its size, gene content, order and orientation are similar to those of the other Solanum species. Phylogenic analysis including 15 other Solanaceae species grouped S. hjertingii with S. demissum, S. hougasii, and S. stoloniferum. After detailed comparisons of the chloroplast genome sequence with eight other Solanum species, we identified one InDel and seven SNPs specific to S. hjertingii. Based on these, five PCR-based markers were developed for discriminating S. hjertingii from other Solanum species. The results obtained in this study will aid in exploring the evolutionary aspects of Solanum species and accelerating breeding using S. hjertingii.

Keywords: cpDNA, InDels, PCR-based marker, Potato, SNPs, Solanum hjertingii

서 론

재배종 감자(Solanum tuberosum L.)의 근연야생종 중 하나인 멕시고 원산의 괴경을 형성하는 Solanum hjertingii는 괴경에서 발생하는 흑변현상(Blackspot bruising)에 강해 생리적 장해인 효소적 갈변과 흑반을 감소시키는 것으로 알려져 있어 감자의 신품종 육성에 유용한 형질로 이용이 가능하다(Culley et al. 2002; Hara-Skrzypiec and Jakuczun 2013; Hawkes 1990; Sim et al. 1997). 뿐만 아니라, 본 연구와 함께 수행되고 있는 연구에서 S. hjertingii는 역병저항성, 건조저항성, 내염성 등과 같은 다양한 생물학적 및 비생물학적 요인들에 저항성이 있는 것으로 확인되었다. 이러한 이유로 S. hjertingii가 가지고 있는 유용 형질을 이용하여 감자 신품종 육성에 이용하기 위한 시도가 지속되고 있으나, S. hjertingiiS. tubersoum이 모두 4배체 임에도 불구하고 각각 2와 4의 서로 다른 EBN (Endosperm Balanced Number)으로 인해 발생하는 교잡불화합성이 교배육종을 불가능하게 한다(Cho et al. 1997; Culley et al. 2002; Hawkes 1990; Ortiz and Ehlenfeldt 1992). 교잡불화합성의 근연야생종이 가지고 있는 유용 형질을 재배종 감자에 도입하기 위해서 교잡 가능한 다른 야생종과의 순차적 교배에 의한 형질의 도입이나 체세포융합에 의한 체세포잡종 계통의 육성과 같은 방법들이 이용될 수 있다(Binding et al. 1982; Hermsen 1966; Hermsen and Ramanna 1973; Iwanaga et al. 1991; Luthra et al. 2019; Park et al. 2005). S. hjertingii를 이용한 순차적 교배는 한차례 시도된 바가 있으나(Culley et al. 2002), 체세포융합에 의한 체세포잡종 계통의 육성은 아직 시도된 바가 없어 본 연구와 함께 연구가 진행중에 있으며, 향후 체세포잡종 계통 육성 시 잡종 계통의 세포질 유전체 구성을 확인하기 위한 목적으로 엽록체 유전체 정보 기반의 S. hjertingii 특이적 분자마커를 개발하게 되었다.

속씨식물의 엽록체 유전체는 일반적으로 원형의 이중가닥 분자구조를 가지고 있으며, 그 크기는 약 115-165 kb이고 large single copy (LSC), small single copy (SSC), 두 개의 inverted repeats (IRs) 영역을 가지는 전형적인 4분할 구조로 되어 있다(Yurina and Odintsova 1998). 재배종 감자와 감자의 근연야생종 또한 앞서 보고된 바와 같이 이와 매우 유사한 것으로 확인되었다(Palmer 1991; Raubeson and Jansen 2005; Saski et al. 2005; Sugiura et al. 1998) (Table 1). 그러나, 엽록체 유전체는 유전자의 재배열, 역위 등과 같은 구조적 변화에 의한 변이 발생으로 종간의 전체 엽록체 유전체를 비교해보면 종간의 염기서열 차이에 의해 발생하는 다수의 InDel과 SNP가 존재함을 알 수 있다(Calsa Junior et al. 2004; Cho et al. 2015; Jheng et al. 2012; Kim et al. 2005, 2018; Kim and Park 2019, 2020a, 2020b; Park 2021, 2022a, 2022b; Saski et al. 2005). 따라서, 본 연구에서는 Park (2022c)에 의해 알려진 S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체의 세부 분석 결과와, 이를 이용한 S. hjertingii 특이적 분자마커의 개발 결과를 제공하고자 한다.

Table 1 . Chloroplast genome sequence characteristics of S. hjertingii and 12 other Solanaceae species..

SpeciesAccession no.Total Length (bp)GC content (%)Total No. of genesNo. of tRNANo. of rRNAReference
S. hjertingiiMK690623155,54537.88134364In this study
S. acauleMK036506155,57037.84135364Park (2022b)
S. brevicauleMK036507155,53137.87135364Park (2022a)
S. demissumMK036508155,55837.87135364Park (2021)
S. hougasiiMF471372155,54937.87135364Kim and Park (2020b)
S. stoloniferumMF471373155,56737.87135364Kim and Park (2020a)
S. chacoenseMF471371155,53237.89136364Kim and Park (2019)
S. berthaultiiKY419708155,53337.88137394Kim et al. (2018)
S. commersoniiKM489054155,52537.88133334Cho et al. (2016)
S. nigrumKM489055155,43237.90139394Cho and Park (2016)
S. tuberosumKM489056155,31237.88130304Cho et al. (2016)
S. bulbocastanumDQ347958155,37137.88133304Daniell et al. (2006)
S. tuberosumNC008096155,29637.88131364Gargano et al. (2005)

*The data have been partially adopted from Park (2022b)..


재료 및 방법

식물재료 및 DNA 분리

S. hjertingii 특이적 분자마커 개발에는 전체 엽록체 유전체 분석에 이용된 감자의 근연야생종 S. hjertingii (PI18 6559) 계통 SH1-16 (Park 2022c)과 S. hjertingii의 다른 계통 SH1-14가 추가되었으며, 재배종 감자 품종인 ‘대서’ (DS), ‘대지’ (DJ), ‘수미’ (SM), 그리고 총 14개 계통의 야생종이 이용되었다. 경산지역에서 자체적으로 수집한 S. nigrum (SN)을 제외한 모든 식물체는 국립식량과학원 고령지농업연구소로부터 분양받아 기내식물체로 유지하며 증식하여 이용되었으며, S. nigrum을 제외한 13개의 야생종은 S. acaule (PI310970, SA), S. berthaultii (PI310981, SB1), S. brevicaule (PI205394, SB2), S. candolleanum (PI210035, SC4), S. cardiophyllum (PI341233, SC1), S. commersonii (PI 558050, SC2), S. hougasii (PI161174, SH2), S. iopetalum (PI 230459, SI), S. jamesii (PI578326, SJ), S. kurtzianum (PI578236, SK), S. mochiquense (PI338616, SM1), S. pinnatisectum (PI190115, SP), S. stoloniferum (PI160224, SS)이다.

DNA 분리에는 Genomic DNA Extraction kit (Plants) (RBC, New Taipei City, Taiwan)가 사용되었으며, 모든 식물재료의 기내식물체를 계대배양 후 약 100 mg의 유식물체를 채취하여 수행되었다.

S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체 분석

S. hjertingii의 전체 유전체 분석에는 S. hjertingii의 계통인 SH1-16의 전체 DNA를 추출하여 이용하였으며, 전체 염기서열을 얻기 위해 Macrogen (Macrogen, Seoul, South Korea)의 Illumina Hiseq2000 (Illumina, SanDiego, CA, USA)의 플랫폼이 이용되었다. 얻어진 전체 염기서열 정보는 파이젠에 구축되어 있는 생물정보학 파이프라인(http://phyzen.com)의 de novo assembly에 의한 분석과정을 통해 완성되었다(Cho et al. 2015). 초기의 염기서열 조립은 CLC assembly cell package version 4.2.1 내의 프로그램이 이용되었다. 우선 Phred score 20 이상의 신뢰도 높은 염기서열 만을 CLC quality trim 프로그램에서 trimming하고, CLC de novo assemble 프로그램의 dnaLCW 방법으로 조립하였다. 이후 엽록체 유래의 염기서열로 구성된 contig를 추출하고 contig 확장과 통합을 거쳐 gap-filling하여 S. hjertingii의 엽록체 유전체 전체를 완성하였으며, trimmed read를 mapping하여 mapped read depth를 계산하고, BLASTN을 통해 확인된 homology가 가장 높은 종인 S. hougasii의 전체 엽록체 유전체(MF471372, Kim and Park 2020b)와 BLASTZ (Schwartz et al. 2003) 분석으로 확인하였다.

S. hjertingii 엽록체 전장 유전체에 존재하는 유전자는 Geseq 프로그램으로 확인하였고(Tillich et al. 2017), BLAST search를 기반으로 manual curation 과정을 거쳐 최종 유전자 부위를 확인하였다. 엽록체 유전체의 모든 특성들은 CPGView 프로그램을 통해 원형의 유전자지도에 표시되었으며, 추가로 trans 및 cis slicing 유전자에 대한 지도 또한 작성되었다(Liu et al. 2023, http://www.1kmpg.cn/cpgview/).

엽록체 유전체 비교 및 PCR 기반 분자마커 개발

S. hjertingii 엽록체 전장 유전체 정보를 이용한 계통발생학적 유전관계 분석을 위해 the National Center for Biotechnology Information (NCBI)로부터 감자 재배종 S. tuberosum (KM489056 및 NC008096), 가지과의 고추 Capsicum annuum (JX270811), 토마토 S. lycopersicum (NC007898), 까마중 S. nigrum (KM489055)과 감자의 근연 야생종 9종 S. acaule (MK036506), S. berthaultii (KY419708), S. brevicaule (MK036507), S. bulbocastanum (DQ347958), S. chacoense (MF471371), S. commersonii (KM489054), S. demissum (MK 036508), S. hougasii (MF471372), S. stoloniferum (MF471373) 등 총 15개의 엽록체 전장 유전체 염기서열을 확보하였다. 이들로부터 확인된 엽록체 코딩 서열을 MEGA6.0 프로그램으로 분석하였으며, Kimura 2-parameter 모델 기반의 Maximum likelihood 방법이 이용되었으며 1,000번의 Bootstrap 옵션을 적용하였다(Tamura et al. 2013).

S. hjertingii 특이적 분자마커는 S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체 염기서열을 NCBI로부터 얻은 S. berthaultii (KY 419708), S. bulbocastanum (DQ347958), S. cardiophyllum (MK690622), S. commersonii (KM489054), S. hougasii (MF 471372), S. jamesii (MK690624), S. tuberosum (KM489056), S. verrucosum (MK690625)의 전체 엽록체 유전체 염기서열과 ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)에 의해 다중 정렬하여 S. hjertingii 특이적 InDel 및 SNP를 구명한 후, S. hjertingii 특이성 검증 과정을 거쳐 개발되었다. InDel의 경우에는 InDel이 있는 영역에서 primer를 디자인하여 allele 특이적으로 나타나는 분자마커를 개발하고자 하였으며, SNP는 tetra-primer ARMS-PCR 방법을 적용하여 primer를 제작하여(Collins and Ke 2012; Ye et al. 2001), S. hjertingiiS. tuberosum을 포함하여 총 19개의 유전자 계통, S. hjertingii (SH1-16 및 SH1-14), S. tuberosum (감자품종 ‘대서’ (DS), ‘대지’ (DJ), ‘수미’ (SM)), S. nigrum (SN), S. cardiophyllum (SC1), S. jamesii (SJ), S. iopetalum (SI), S. acaule (SA), S. berthaultii (SB1), S. brevicaule (SB2), S. commersonii (SC2), S. candolleanum (SC4), S. hougasii (SH2), S. kurtzianum (SK), S. mochiquense (SM1), S. pinnatisectum (SP), S. stoloniferum (SS)을 대상으로 PCR을 진행하였다. InDel 기반의 분자마커 개발을 위한 PCR은 Thermocycler (Biometra, Göttingen, Germany)를 이용하여 총 25 ul (약 20 ng genomic DNA, 10 pMol each primer, 0.5 mM dNTPs, 1 U Taq polymerase (Genetbio, Daejeon, South Korea))으로, SNP 기반의 분자마커 개발을 위한 PCR은 총 25 ul (약 20 ng genomic DNA, 10 pMol each inner primer, 1 pMol each outer primer, 0.5 mM dNTPs, 1 U Taq polymerase (Genetbio, Daejeon, South Korea))으로 수행되었다. PCR은 RedSafe (Intron Biotechnology, Seongnam, South Korea)로 염색하여 1% agarose gel에서 확인하였다.

결과 및 고찰

감자 야생종 S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체

S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체는 NGS 기술에 의해 완성되었다(Park 2022b). 추가로 S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체의 완성 과정과 결과를 세부적으로 기술하면, 4,907,888 read를 통해 총 염기서열 약 1.5 Gbp를 생산하였다. 이중 약 91.4%의 정보를 CLC quality trim 프로그램으로 전처리하고 Phred score 20 이상의 결과를 추출하여, 전체 염기서열 중 high-quality 서열인 평균 283.5 bp 길이의 총 염기서열 정보 약 1.27 Gbp를 얻었다. 이는 전체 raw data의 약 86.1%로, 앞서 보고된 S. brevicaule의 전장 유전체 분석 결과에서 얻은 총 염기서열이 2.46 Gbp와 비교하여 거의 절반 밖에 되지 않지만, 전체 염기서열 대비 추출 염기서열의 비율은 오히려 약 9% 많은 수준으로 데이터가 효율적으로 이용되었다(Park 2022a). 또한, de novo assembly, contig 선발, 확장 및 통합, 그리고 gap-filling 과정 등을 거쳐 155,545 bp (MK690623)의 S. hjertingii 엽록체 전장 유전체가 완성되었으며, 결과적으로 aligned read 수는 약 21만 4천개, 엽록체 유전체 평균 coverage는 약 385.9x, 전체 trimmed read를 완성된 유전체 서열에 mapping하여 확인한 read depth는 약 200-500으로 S. brevicaule 등 다른 근연야생종의 엽록체 전장 유전체의 완성된 결과 보다는 다소 적은 데이터가 이용되기는 하였으나 충분히 신뢰할 만한 결과를 보여주었다(Park 2022a). 구조는 85,976 bp의 LSC, 18,383 bp의 SSC, 그리고 한 쌍의 25,593 bp 크기의 IRa 및 IRb로 구성된 원형 이중가닥 분자로 다른 식물의 엽록체 유전체와 동일하였으며, S. hougasii의 전체 엽록체 유전체 염기서열(MF471372, Kim and Park 2020b)과의 비교 및 BLASTZ 분석(Schwartz et al. 2003)으로도 유사성을 확인하였다. S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체 염기서열을 NCBI에서 Blastn 한 결과 S. hougasii (MF471372), S. stoloniferum (MF471373)과 각각 99.97%, 99.96%의 높은 유사도를 보였으며, GC 비율도 37.88%로 매우 유사하였다(Table 1).

S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체에는 105개의 단백질 코딩, 45개의 tRNA, 8개의 rRNA를 포함한 총 158개의 유전자가 있었으며, 이중 11개의 단백질 코딩 유전자, 9개의 tRNA, 4개의 rRNA는 한 쌍의 IR영역 IRa 및 IRb에 역배열로 중복되어 존배하고 있었다(Table 1, Fig. 1). 전체 염기서열 중 59.3%가 코딩 영역으로 158개의 유전자 평균 길이가 약 583.3 bp로, 이 중 단백질 코딩 유전자, tRNA, rRNA가 각각 평균 765.0 bp, 62.0 bp, 1,132.0 bp의 크기로 51.6%, 1.8%, 5.8%의 비율로 분포하며, Solanum 속의 다른 종들과 모두 유사하였다(Table 1). IR영역에서 중복되어 존재하는 2개의 유전자(rpl2, ndhB)를 포함하여 총 13개의 유전자(rps16, atpF, rpoC1, ycf3, clpP, petB, petD, rpl16, ndhA)는 cis-splicing 유전자이며, rps12는 tran-splicing 유전자로 확인되었다 (Fig. 2A and 2B).

Figure 1. Schematic map of the overall features of the S. hjertingii chloroplast genome. From the center outward, the first track shows the dispersed repeats, consisting of direct and palindromic repeats, connected with red and green arcs. The second track shows the long tandem repeats as short blue bars. The third track shows the short tandem repeats as short bars with different colors. The colors, the type of repeat they represent, and the description of the repeat types are as follows. Black, green, and yellow represent complex repeat, repeat unit size = 1, and repeat unit size = 2, respectively. The small single-copy (SSC), inverted repeat (IRa and IRb), and large single-copy (LSC) regions are shown on the fourth track. The GC content along the genome is plotted on the fifth track. The genes are shown on the sixth track, color-coded by their functional classification as described in the bottom left corner. The optional codon usage bias is displayed in the parentheses after the gene name. The transcription directions for the inner and outer genes are clockwise and counterclockwise, respectively
Figure 2. Schematic map of the cis- (A) and trans- (B) splicing genes in the S. hjertingii chloroplast genome. The 13 cis-splicing genes are arranged from top to bottom based on their order in the chloroplast genome. The gene names are shown on the left, and the gene structures are on the right with exons in black and introns in white (lengths not to scale). The arrow indicates the sense direction of the gene. The trans-splicing gene rps12 in the chloroplast genome has three unique exons, two of which being located in the IR regions, are duplicated

엽록체 유전체 비교 및 계통수

S. hjertingii의 엽록체 유전체와 가지과의 다른 15종의 엽록체 유전체의 코딩 서열을 비교하여 계통수를 작성하였다(Fig. 3). S. hjertingii는 계통수에서 감자의 근연야생종 중 S. demissum (MF036508), S. hougasii (MF471372), S. stoloniferum (MK471373)과 유연관계가 가장 가까우며, 이는 앞서 확인된 엽록체 전장 유전체의 전체 염기서열을 Blast 한 결과와도 일치하였다. 같은 가지과 내에서는 토마토(S. lycopersicum), 까마중(S. nigrum), 고추(Capsicum annuum)와는 상대적으로 유연관계가 멀었다. 또한, S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체 염기서열을 감자 재배종 및 7개의 근연야생종 전체 엽록체 유전체 염기서열을 EMBL의 ClustalW2 (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)로 다중 정렬한 결과 S. hjertingii 특이적인 1개의 InDel과 7개의 SNP를 확인하였다(Fig. 4). S. hjertingii 특이적 InDel과 SNP의 수는 상대적으로 적었는데, 이는 다중 정렬에 S. hjertingii의 유전체와 유사도가 매우 높은 S. hougasii가 포함된 결과로 유추할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 동일한 가지속에 속한 재배종 감자와 근연야생종들이 다양한 유전적 요인에 의해 발생할 수 있는 변이에 의해 S. hjertingii 특이적인 InDel과 SNP가 존재하며, 이를 활용한 S. hjertingii 특이적 분자마커의 개발을 가능하게 하였다(Cho and Park 2016; Chung et al. 2006; Kim et al. 2018; Kim and Park 2019, 2020a, 2020b; Park 2021, 2022a, 2022b). 하나의 InDel은 유전자 영역에 존재하였으며, 7개의 SNP 중, 4개는 유전자 영역에 3개는 유전자 간 영역에 분포하고 있었다. 4개의 유전자 영역에 존재하는 SNP의 경우 모두 유전자의 intron에 존재하는 것으로 확인되었다.

Figure 3. Maximum-likelihood phylogenetic tree of S. hjertingii with 15 other Solanaceae family members based on their chloroplast genome protein-coding sequences. Bootstrap values from 1,000 replicates are shown on each node
Figure 4. Multiple alignments of the sequences on the intergenic or intragenic regions containing the InDels and SNPs used to develop the PCR-based markers. The chloroplast genome sequences of S. cardiophyllum (SC1_9: MK690622), S. jamesii (SJ8: MK690624), S. bulbocastanum (Sblb: DQ347958), S. berthaultii (Sber: KY419708), S. tuberosum (Stub: KM489056), S. verrucosum (SV1_4: MK690625), S. hougasii (SH2_10: MF471372), S. hjertingii (SH1_16: MK690623), and S. commersonii (Scmr: KM489054) were listed from top to bottom for each InDel and SNP region. The regions of the InDels and SNPs detected in S. hjertingii are in bold, highlighted, and underlined

S. hjertingii 특이적 분자마커 개발

S. hjertingii를 포함한 9종의 전체 엽록체 유전체 염기서열의 다중 정렬 결과로 확인된 S. hjertingii 특이적 InDel과 SNP는 S. hjertingii 특이적인 분자마커 개발에 이용되었다. InDel은 InDel 영역 특이적인 primer를 제작하여 PCR을 통해 다형성의 차이가 나타나는 S. hjertingii 특이적인 SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) 마커의 개발이 가능하였다(Cho et al. 2015; Garcia-Lor et al. 2013; Park 2022b; Yamaki et al. 2013) (Table 2 and Fig. 5A). SNP의 경우, 존재하는 S. hjertingii 특이적 SNP 영역을 기준으로 SNP를 포함하는 DNA 단편과 SNP 영역을 대상으로 S. hjertingii 특이적 또는 S. hjertingii를 제외한 Solanum 종 특이적인 DNA 단편을 증폭할 수 있는 tetra-primer ARMS-PCR 방법(Collins and Ke 2012; Ye et al. 2001)을 적용하여 primer를 제작하였다(Table 2). Tetra-primer ARMS-PCR 방법은 다양한 생명체를 대상으로 SNP가 존재하는 계통간의 비교를 PCR 방법으로 손쉽게 구명할 수 있는 방법으로 널리 활용되고 있으며(Kou et al. 2017; Mahmoudi et al. 2019; Zou et al. 2018), 본 연구에서도 간편히 큰 비용을 들이지 않고 Solanum 종간의 구별이 가능한 SNP 정보를 활용한 PCR 기반의 S. hjertingii 특이적인(Fig. 5B, 5C, 5D) 또는 비특이적인(Fig. 5B, 5C, 5D, 5E) 4개의 분자마커를 개발할 수 있었다. 이중 SH1_InDel1 (Fig. 4 and Fig. 5A)는 ycf1 유전자에 존재하는 InDel 기반으로 개발되었고, SH1_ SNP1 (Fig. 4 and Fig. 5B)과 SH1_SNP6(Fig. 4 and Fig. 5E)은 각각 trnS과 rpl16 유전자 내의 Intron 영역에, SH1_SNP2 (Fig. 4 and Fig. 5C)와 SH1_SNP3 (Fig. 4 and Fig. 5D)은 각각 psaAycf3ycf4cemA 유전자 사이에 존재하는 SNP 기반으로 개발되었다.

Table 2 . Primers for generating S. hjertingii specific and non-specific markers.

InDel/SNPSystemPrimer sequence (5’ → 3’)Touchdown PCRAnnealing temperature (°C)Amplicon size
SH1-16_InDel1Forward primerAGTTTCTTATGTTTTAATTCCNo58 °C531 bp (insert sequence ‘tttattagg’ specific to S. hjertingii)
Reverse primerTCCTAATAAACCTAATAAAAC

SH1-16_SNP1Forward inner primerGTATGAATAAAGGATCCATGGATGCAANo54 °C313 bp (from two outer primers)
198 bp (A allele specific to S. hjertingii)
171 bp (G allele non- specific to S. hjertingii)
Reverse inner primerTAGTTACGATTAGAAATAAACTTTCTCTC
Forward outer primerAGAACAAATACACATTATCGTGATTTGT
Reverse outer primerTTTCTATTTAATAGGATCCTGAGGAAAA

SH1-16_SNP3Forward inner primerGGACCTTTTAACCTTTTAAAAACCCTTGTGYes70 °C to 61 °C336 bp (from two outer primers)
246 bp (A allele specific to S. hjertingii)
181 bp (G allele non- specific to S. hjertingii)
Reverse inner primerAAGTCGTTTTTGGATCAATCCAAAGACT
Forward outer primerCGCCAACAGTCAAATAATTAGTGAACCT
Reverse outer primerTAGTAATGTCTAATGGCTACTCGCGTGA

SH1-16_SNP5Forward inner primerAGAATCAGAACGTTCATTCAATTGAAYes70 °C to 61 °C397 bp (from two outer primers)
260 bp (C allele specific to S. hjertingii)
190 bp (A allele non- specific to S. hjertingii)
Reverse inner primerTTTATGGTTCTTTCATATACGTTTCCG
Forward outer primerCGATTCCTTATAAAAGATATTCAGTCCG
Reverse outer primerATTGAACTAAAAAAAATTCTTGCTTTCG

SH1-16_SNP6Forward inner primerCTATTAGTAATTTGTATATCTTGTTGGGNo54 °C214 bp (from two outer primers)
144 bp (A allele non- specific to S. hjertingii)
Reverse inner primerTTAGAAAACTACAAAGTTTAGTTATCTCTT
Forward outer primerAGCTAGAATAGTCAATCTTAAGTTAAGAT
Reverse outer primerAAATTTAGGACAATACAATAAAGGAC

Figure 5. PCR-based markers for discriminating S. hjertingii from other Solanum species. A: SH1-16_InDel1. B: SH1-16_SNP1. C: SH1-16_SNP3. D: SH1-16_SNP5. E: SH1-16_SNP6. The marker SH1-16_InDel1 is positively specific to S. hjertingii while the marker SH1-16_SNP6 is negatively specific to S. hjertingii. Markers SH1-16_SNP1, SH1-16_SNP3, and SH1-16_SNP5 are both positively and negatively specific to S. hjertingii. SH1-16 and SH1-14 indicate two different lines of S. hjertingii (PI186559). SN is S. nigrum collected in Gyeongsan, South Korea. M, DS, DJ, SM, SC1, SJ, SI, SA, SB1, SB2, SC2, SC4, SH2, SK, SM1, SP, and SS indicate a size marker ladder, potato varieties ‘Daeseo’, ‘Daeji’, ‘Sumi’, S. cardiophyllum (PI341233), S. jamesii (PI578326), S. iopetalum (PI230459), S. acaule (PI310970), S. berthaultii (PI310981), S. brevicaule (PI205394), S. commersonii (PI558050), S. candolleanum (PI210035), S. hougasii (PI161174), S. kurtzianum (PI578236), S. mochiquense (PI338616), S. pinnatisectum (PI190115), and S. stoloniferum (PI160224), respectively. Red and yellow arrows indicate positive and negative bands on S. cardiophyllum, respectively

감자와 감자의 근연야생종의 엽록체 전장유전체의 전체 염기서열을 구명하고 이 정보를 이용하여 유전자형을 구분할 수 있는 감자 또는 감자의 근연야생종 특이적인 분자마커의 개발은 핵 내의 염색체 DNA를 대상으로 분자마커를 개발하는 것과 함께 감자의 신품종 육성과 Solanum 속의 식물들 간의 진화학적 연구에 기여할 수 있을 것이다(Bohs and Olmstead 1997; Hosaka and Sanetomo 2012). 특히, 감자의 신품종 육성을 위해 다양한 근연야생종이 가지고 있는 유용 형질을 활용하고자 하는 노력이 지속적으로 이루어지고 있으나, 배수성 및 EBN의 차이로 교배육종이 잘 이루어지지 않아 원형질체를 이용한 체세포융합에 의한 체세포잡종을 육성하고자 하는 노력이 진행되고 있다. 이러한 과정에서 체세포잡종의 핵내 유전체 정보 뿐 만 아니라, 세포질의 유전체 정보를 이용한 유전자형을 확인하는 작업이 필요한데, Solanum 속 및 다양한 식물종에서 체세포융합 과정에서 세포질에 존재하는 미토콘드리아 유전체에서는 높은 빈도의 재조합이 발생하나 엽록체 유전체의 경우 한 쪽의 엽록체 유전체만 무작위로 전달이 되는 경우 뿐 만 아니라 양친의 유전체 모두가 전달되는 경우도 있었다(Chen et al. 2013; Cho et al. 2016; Lössl et al. 2000; Mohapatra et al. 1998; Smyda-Dajmund et al. 2016; Wang et al. 2011; Xiang et al. 2004). 따라서, 본 연구의 결과인 InDel 및 SNP 기반의 분자마커는 S. hjertingii를 이용한 감자의 신품종 육성 과정에서 체세포잡종을 육성하여 S. hjertingiiS. tuberosum 유래의 엽록체 유전체의 유전자형 판별에 이용될 수 있을 것이다.

적 요

멕시코 유래의 4배체 감자 근연야생종 중 하나인 Solanum hjertingii는 괴경에서 발생하는 흑변현상에 강한 것으로 알려져 감자의 신품종 육성에 유용한 형질로 이용이 가능하다. 이러한 저항성은 생리적 장해인 효소적 갈변과 흑반을 감소시킬 수 있다. 하지만, S. hjertingiiS. tuberosum은 생리적 장벽에 기인한 교잡종 생산이 제한적인 관계로 직접적인 교배육종보다는 체세포잡종을 육성하는 방법을 활용할 수 있다. 체세포잡종 계통이 육성이 되면 분자표지를 이용한 적절한 잡종 계통을 선발하는 것이 필요하여, 본 연구에서는 S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체 정보를 이용하여 S. hjertingii 특이적인 PCR 기반의 분자마커를 개발하였다. S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체는 155,545 bp였으며, 다른 Solanum 종들과 구조 및 유전자 구성이 매우 유사하였고, 가지과의 다른 15개의 종들과 계통수 분석에서 근연야생종 S. demissum, S. hougasii, S. stoloniferum과 매우 가까운 유연관계를 나타냈다. 또한, S. hjertingii의 전체 엽록체 유전체와 8개의 다른 Solanum 종의 전체 엽록체 유전체의 다중 정렬 결과로 S. hjertingii 특이적인 1개의 InDel 영역과 7개의 SNP 영역을 확인하였고, 이를 이용하여 1개의 InDel 및 4개의 SNP 기반 PCR마커를 개발하였다. 본 연구의 결과는 S. hjertingii의 진화적 측면에서의 연구와 S. hjertingii를 이용한 감자의 신품종 육성 연구에 기여를 할 수 있을 것이다.

사 사

이 성과는 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임(No. NRF-2021R1F1A1045981).

Fig 1.

Figure 1.Schematic map of the overall features of the S. hjertingii chloroplast genome. From the center outward, the first track shows the dispersed repeats, consisting of direct and palindromic repeats, connected with red and green arcs. The second track shows the long tandem repeats as short blue bars. The third track shows the short tandem repeats as short bars with different colors. The colors, the type of repeat they represent, and the description of the repeat types are as follows. Black, green, and yellow represent complex repeat, repeat unit size = 1, and repeat unit size = 2, respectively. The small single-copy (SSC), inverted repeat (IRa and IRb), and large single-copy (LSC) regions are shown on the fourth track. The GC content along the genome is plotted on the fifth track. The genes are shown on the sixth track, color-coded by their functional classification as described in the bottom left corner. The optional codon usage bias is displayed in the parentheses after the gene name. The transcription directions for the inner and outer genes are clockwise and counterclockwise, respectively
Journal of Plant Biotechnology 2023; 50: 34-44https://doi.org/10.5010/JPB.2023.50.005.034

Fig 2.

Figure 2.Schematic map of the cis- (A) and trans- (B) splicing genes in the S. hjertingii chloroplast genome. The 13 cis-splicing genes are arranged from top to bottom based on their order in the chloroplast genome. The gene names are shown on the left, and the gene structures are on the right with exons in black and introns in white (lengths not to scale). The arrow indicates the sense direction of the gene. The trans-splicing gene rps12 in the chloroplast genome has three unique exons, two of which being located in the IR regions, are duplicated
Journal of Plant Biotechnology 2023; 50: 34-44https://doi.org/10.5010/JPB.2023.50.005.034

Fig 3.

Figure 3.Maximum-likelihood phylogenetic tree of S. hjertingii with 15 other Solanaceae family members based on their chloroplast genome protein-coding sequences. Bootstrap values from 1,000 replicates are shown on each node
Journal of Plant Biotechnology 2023; 50: 34-44https://doi.org/10.5010/JPB.2023.50.005.034

Fig 4.

Figure 4.Multiple alignments of the sequences on the intergenic or intragenic regions containing the InDels and SNPs used to develop the PCR-based markers. The chloroplast genome sequences of S. cardiophyllum (SC1_9: MK690622), S. jamesii (SJ8: MK690624), S. bulbocastanum (Sblb: DQ347958), S. berthaultii (Sber: KY419708), S. tuberosum (Stub: KM489056), S. verrucosum (SV1_4: MK690625), S. hougasii (SH2_10: MF471372), S. hjertingii (SH1_16: MK690623), and S. commersonii (Scmr: KM489054) were listed from top to bottom for each InDel and SNP region. The regions of the InDels and SNPs detected in S. hjertingii are in bold, highlighted, and underlined
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Fig 5.

Figure 5.PCR-based markers for discriminating S. hjertingii from other Solanum species. A: SH1-16_InDel1. B: SH1-16_SNP1. C: SH1-16_SNP3. D: SH1-16_SNP5. E: SH1-16_SNP6. The marker SH1-16_InDel1 is positively specific to S. hjertingii while the marker SH1-16_SNP6 is negatively specific to S. hjertingii. Markers SH1-16_SNP1, SH1-16_SNP3, and SH1-16_SNP5 are both positively and negatively specific to S. hjertingii. SH1-16 and SH1-14 indicate two different lines of S. hjertingii (PI186559). SN is S. nigrum collected in Gyeongsan, South Korea. M, DS, DJ, SM, SC1, SJ, SI, SA, SB1, SB2, SC2, SC4, SH2, SK, SM1, SP, and SS indicate a size marker ladder, potato varieties ‘Daeseo’, ‘Daeji’, ‘Sumi’, S. cardiophyllum (PI341233), S. jamesii (PI578326), S. iopetalum (PI230459), S. acaule (PI310970), S. berthaultii (PI310981), S. brevicaule (PI205394), S. commersonii (PI558050), S. candolleanum (PI210035), S. hougasii (PI161174), S. kurtzianum (PI578236), S. mochiquense (PI338616), S. pinnatisectum (PI190115), and S. stoloniferum (PI160224), respectively. Red and yellow arrows indicate positive and negative bands on S. cardiophyllum, respectively
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Table 1 . Chloroplast genome sequence characteristics of S. hjertingii and 12 other Solanaceae species..

SpeciesAccession no.Total Length (bp)GC content (%)Total No. of genesNo. of tRNANo. of rRNAReference
S. hjertingiiMK690623155,54537.88134364In this study
S. acauleMK036506155,57037.84135364Park (2022b)
S. brevicauleMK036507155,53137.87135364Park (2022a)
S. demissumMK036508155,55837.87135364Park (2021)
S. hougasiiMF471372155,54937.87135364Kim and Park (2020b)
S. stoloniferumMF471373155,56737.87135364Kim and Park (2020a)
S. chacoenseMF471371155,53237.89136364Kim and Park (2019)
S. berthaultiiKY419708155,53337.88137394Kim et al. (2018)
S. commersoniiKM489054155,52537.88133334Cho et al. (2016)
S. nigrumKM489055155,43237.90139394Cho and Park (2016)
S. tuberosumKM489056155,31237.88130304Cho et al. (2016)
S. bulbocastanumDQ347958155,37137.88133304Daniell et al. (2006)
S. tuberosumNC008096155,29637.88131364Gargano et al. (2005)

*The data have been partially adopted from Park (2022b)..


Table 2 . Primers for generating S. hjertingii specific and non-specific markers.

InDel/SNPSystemPrimer sequence (5’ → 3’)Touchdown PCRAnnealing temperature (°C)Amplicon size
SH1-16_InDel1Forward primerAGTTTCTTATGTTTTAATTCCNo58 °C531 bp (insert sequence ‘tttattagg’ specific to S. hjertingii)
Reverse primerTCCTAATAAACCTAATAAAAC

SH1-16_SNP1Forward inner primerGTATGAATAAAGGATCCATGGATGCAANo54 °C313 bp (from two outer primers)
198 bp (A allele specific to S. hjertingii)
171 bp (G allele non- specific to S. hjertingii)
Reverse inner primerTAGTTACGATTAGAAATAAACTTTCTCTC
Forward outer primerAGAACAAATACACATTATCGTGATTTGT
Reverse outer primerTTTCTATTTAATAGGATCCTGAGGAAAA

SH1-16_SNP3Forward inner primerGGACCTTTTAACCTTTTAAAAACCCTTGTGYes70 °C to 61 °C336 bp (from two outer primers)
246 bp (A allele specific to S. hjertingii)
181 bp (G allele non- specific to S. hjertingii)
Reverse inner primerAAGTCGTTTTTGGATCAATCCAAAGACT
Forward outer primerCGCCAACAGTCAAATAATTAGTGAACCT
Reverse outer primerTAGTAATGTCTAATGGCTACTCGCGTGA

SH1-16_SNP5Forward inner primerAGAATCAGAACGTTCATTCAATTGAAYes70 °C to 61 °C397 bp (from two outer primers)
260 bp (C allele specific to S. hjertingii)
190 bp (A allele non- specific to S. hjertingii)
Reverse inner primerTTTATGGTTCTTTCATATACGTTTCCG
Forward outer primerCGATTCCTTATAAAAGATATTCAGTCCG
Reverse outer primerATTGAACTAAAAAAAATTCTTGCTTTCG

SH1-16_SNP6Forward inner primerCTATTAGTAATTTGTATATCTTGTTGGGNo54 °C214 bp (from two outer primers)
144 bp (A allele non- specific to S. hjertingii)
Reverse inner primerTTAGAAAACTACAAAGTTTAGTTATCTCTT
Forward outer primerAGCTAGAATAGTCAATCTTAAGTTAAGAT
Reverse outer primerAAATTTAGGACAATACAATAAAGGAC

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JPB
Vol 51. 2024

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Plant Biotechnology

pISSN 1229-2818
eISSN 2384-1397
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