Solanum verrcosum은 멕시코 원산으로 재배되고 있는 감자(Solanum tuberosum L.)와 비교하여 괴경을 형성을 하지만 배수성이 2배체로 4배체인 재배종 감자와 차이를 보이는 근연야생종 중 하나이다(Hanneman 1994; Hawkes 1990). S. verrucosum은 Phytophthora infestans에 의해 유발되는 감자역병, 감자잎말림바이러스(PLRV) 등에 저항성을 가지고 있어 감자의 새로운 품종 육성에 활용이 가능한 재료로 알려져 있다(Jansky 2000; Liu and Halterman 2009; Machida-Hirano 2015; Ruiz de Galarreta et al. 1998). 이러한 유용 형질을 도입하여 감자 신품종을 육성하기 위해서는 보편적으로 전통적인 교배육종을 통해 이루어질 수 있으나 EBN (Endosperm Balanced Number)이 S. verrucosum의 경우 2로 EBN이 4인 재배종 감자와 차이가 있어 생리적 불화합성으로 인해 직접적인 교배가 불가능하다(Cho et al. 1997; Ortiz and Ehlenfeldt 1992; Spooner et al. 2014). 이러한 교잡불화합성의 생리적 장벽을 극복하고

근연야생종이 지닌 유용 형질을 도입하기 위해 체세포융합을 이용하여 체세포잡종 계통을 육성하는 방법이 이용될 수 있으며, S. verrucosum과 S. tuberosum 간에 체세포융합으로 이루어진 계통을 포함하여(Carrasco et al. 2000) 다양한 근연야생종을 대상으로 한 체세포융합을 이용한 체세포잡종 계통의 육성이 이루어진 바가 있다(Kim-Lee et al. 2005; Sedlák et al. 2022; Tu et al. 2021; Williams et al. 1993). 따라서, S. verrucosum의 원형질체를 분리 및 융합하여 체세포잡종을 육성하는 연구가 수행 중이며, 체세포융합 이후 체세포잡종 계통 획득 시, 체세포잡종 계통에 S. verrucosum과 S. tuberosum의 핵내 및 세포질 DNA가 어떻게 전달되는지를 확인하고 활용 가능한 계통을 선발하기 위해, 본 연구에서는 엽록체 DNA의 정보를 이용하여 S. verrucosum과 S. tuberosum을 구별할 수 있는 S. verrucosum 특이적 분자마커를 개발하고자 하였다.

엽록체 유전체는 일반적으로 원형의 이중가닥 분자구조로 이루어져 있으며, 각각 하나의 large single copy (LSC) 영역과 small single copy (SSC) 영역, 그리고 두 개의 inverted repeats (IRs) 영역으로 구성된 4분할의 구조를 가지고 있다(Yurina and Odintosova 1998). 다수의 감자 야생종과 재배종의 엽록체 전장 유전체 연구가 이미 진행되었으며 (Table 1), Solanum 속의 식물 뿐만 아니라 다수의 속씨식물들의 엽록체 유전체의 크기, 유전자의 구성, 심지어 전체 염기서열까지도 매우 유사한 것으로 확인되었다(Palmer 1991; Raubeson and Jansen 2005; Saski et al. 2005; Sugiura et al. 1998). 그러나, 유전자 재배열, 역위 등과 같은 염기서열의 구조적 변화가 식물의 엽록체 유전체에서 발생하여 변이를 일으켜 종간의 엽록체 전장 유전체를 비교하면 다수의 InDel이나 SNP가 존재하는 것을 확인할 수 있다(Calsa Junior et al. 2004; Cho et al. 2015; Jheng et al. 2012; Kim et al. 2005, 2018; Kim and Park 2019, 2020a, 2020b; Park 2021, 2022a, 2022b, 2023a, 2023b; Saski et al. 2005). 따라서, 본 연구에서는 S. verrucosum의 엽록체 전장 유전체를 구명하고, 이를 이용한 S. verrucosum 특이적 분자마커를 개발하고자 하였다.

Table 1 . Comparative analysis of the chloroplast genome sequence of S. verrucosum with those of 14 Solanaceae species.

Species	Accession no.	Total length (bp)	GC content (%)	Total no. of genes	No. of tRNAs	No. of rRNAs	Reference
S. verrucosum	MK690625	155,485	37.88	134	36	4	This study
S. hjertingii	MK690623	155,545	37.88	134	36	4	Park (2023a)
S. cardiophyllum	MK690622	155,570	37.90	134	36	4	Park (2023b)
S. acaule	MK036506	155,570	37.84	135	36	4	Park (2022b)
S. brevicaule	MK036507	155,531	37.87	135	36	4	Park (2022a)
S. demissum	MK036508	155,558	37.87	135	36	4	Park (2021)
S. hougasii	MF471372	155,549	37.87	135	36	4	Kim and Park (2020b)
S. stoloniferum	MF471373	155,567	37.87	135	36	4	Kim and Park (2020a)
S. chacoense	MF471371	155,532	37.89	136	36	4	Kim and Park (2019)
S. berthaultii	KY419708	155,533	37.88	137	39	4	Kim et al. (2018)
S. commersonii	KM489054	155,525	37.88	133	33	4	Cho et al. (2016)
S. nigrum	KM489055	155,432	37.90	139	39	4	Cho and Park (2016)
S. tuberosum	KM489056	155,312	37.88	130	30	4	Cho et al. (2016)
S. bulbocastanum	DQ347958	155,371	37.88	133	30	4	Daniell et al. (2006)
S. tuberosum	NC008096	155,296	37.88	131	36	4	Gargano et al. (2005)

*The data have been partially obtained from Park (2023b)..

식물재료 및 DNA 분리

S. verrucosum 특의적 분자마커 개발을 위해 야생종 S. verrucosum (PI160228)의 계통 중 하나인 SV1-4가 엽록체 전장 유전체 분석에 이용되었다. 추가로 재배종 감자 품종 중 ‘대서’(DS), ‘대지’(DJ), ‘수미’(SM) 와 총 12개의 야생종 계통, S. acaule (PI310970, SA), S. brevicaule (PI205394, SB2), S. cardiophyllum (PI341233, SC1), S. commersonii (PI558050, SC2), S. hjertingii (PI186559, SH1), S. hougasii (PI161174, SH2), S. jamesii (PI578326, SJ), S. kurtzianum (PI578236, SK), S. mochiquense (PI338616, SM1), S. pinnatisectum (PI190115, SP), S. stoloniferum (PI160224, SS), S. vernei (PI230468, SV2)이 이용되었다. 모든 식물체는 국립식량과학원 고령지농업연구소로부터 분양받아 이용되었으며, 기내식물체로 유지 및 증식되었다.

DNA는 기내식물체의 잎과 줄기를 약 100 mg 채취하여 Genomic DNA Extraction kit (Plants) (RBC, New Taipei City, Taiwan)를 이용하여 추출하였다.

S. verrucosum 엽록체 유전체의 완성 및 분석

S. verrucosum의 엽록체 전장 유전체 분석에는 S. verrucosum 계통 중 하나인 SV1-4를 이용하였으며, Macrogen (Macrogen, Seoul, South Korea)의 MiSeq (Illumina, SanDiego, CA, USA) 플랫폼을 이용하여 염기서열(raw data)을 확보하였다. 확보된 염기서열(raw data)의 분석과 조립은 파이젠에서 제공하는 생물정보학 파이프라인(http://phyzen.com)의 de novo assembly가 이용되었다(Cho et al. 2015). 전체 염기서열 중 high-quality (Phred score 20 이상) 염기서열을 추출하기 위해 CLC quality trim 프로그램을 통한 전처리(trimming) 과정을 거쳤으며, CLC de novo assemble 프로그램을 이용한 dnaLCW 방법으로 조립하였다. 이 후, 엽록체 유전체 유래의 contig만을 추출하여 contig를 확장하고 통합하는 과정과 gap-filling을 통해 엽록체 전장 유전체를 완성하였다. 각종 프로그램은 CLC genome assembler package version 4.2.1 (CLC Inc, Rarhus, Denmark)에서 제공하는 것을 이용하였다.

완성된 엽록체 유전체 서열은 trimmed read를 mapping하여 각각의 위치별 mapped read depth를 계산하고 BLASTN을 수행하였으며, 그중 homology가 높은 종의 전장 엽록체 유전체 서열을 확인하고 BLASTZ 분석을 실시하였다(Schwartz et al. 2003). 유전자 분석은 Geseq 프로그램을 이용하였으며(Tillich et al. 2017), 추가로 BLAST search를 기반으로 manual curation을 통해 최종 확인하였다. 확인된 S. verrucosum의 엽록체 전장 유전체의 유전자는 OGDraw 프로그램을 이용하여 원형의 유전자지도 표시하여 최종 유전자 지도가 작성되었다(Lohse et al. 2007).

엽록체 유전체의 비교와 분자마커 개발

S. verrucosum의 유연관계 분석을 위해 S. verrucosum의 엽록체 전장 유전체 염기서열을 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에서 제공하는 12종의 감자 근연야생종을 포함한 총 16개의 가지과 식물, 고추 Capsicum annuum (JX270811), 토마토 S. lycopersicum (NC007898), 감자 S. tuberosum (KM489056 및 NC008096), 까마중 S. nigrum (KM489055), S. acaule (MK036506), S. berthaultii (KY419708), S. brevicaule (MK036507), S. bulbocastanum (DQ347958), S. cardiophyllum (MK690622), S. chacoense (MF471371), S. commersonii (KM489054), S. demissum (MK036508), S. hjertingii (MK690623), S. hougasii (MF471372), S. stoloniferum (MF471373)과 비교하였다. 이들의 엽록체 단백질 코딩 서열을 기반으로 1,000번의 Bootstrap 값을 가지는 MEGA11 프로그램의 GTR(General Time Reversible) 모델을 적용한 Maximum Likelihood 방법을 이용하여 계통발생학적 유연관계를 분석하였다(Tamura et al. 2021).

S. verrucosum 특이적인 분자마커 개발을 위해 S. verrucosum의 엽록체 전장 유전체 염기서열과 NCBI로부터 얻은 S. berthaultii (KY419708), S. bulbocastanum (DQ347958), S. cardiophyllum (MK690622), S. jamesii (MK690624), S. tuberosum (KM489056), S. hjertingii (MK690623), S. hougasii (MF471372), S. commersonii (KM489054)의 엽록체 전장 유전체 염기서열을 EMBL (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)의 ClustalW2에 의해 다중정렬 하였고 정렬된 염기서열을 비교하여 S. verrucosum에 특이적으로 나타는 InDel과 SNP 영역을 확인하였다. InDel 영역을 대상으로 하는 경우 InDel이 있는 영역에 primer를 제작하여 allele 특이적 분자마커를 개발하고자 하였으며, SNP 영역을 대상으로 하는 경우 tetra-primer ARMS (Amplification Refractory Mutation System)-PCR 기술을 이용하여 primer를 제작하였다(Collins and Ke 2012; Ye et al. 2001). S. verrucosum과 S. tuberosum을 포함한 총 16개의 계통, S. verrucosum (SV1), S. tuberosum (감자품종 ‘대지’ (DJ), ‘대서’ (DS), ‘수미’ (SM)), S. acaule (SA), S. cardiophyllum (SC1), S. brevicaule (SB2), S. commersonii (SC2), S. hjertingii (SH1), S. hougasii (SH2), S. kurtzianum (SK), S. jamesii (SJ), S. pinnatisectum (SP), S. mochiquense (SM1), S. stoloniferum (SS), S. vernei (SV2)를 대상으로 PCR을 진행하였다. InDel 기반의 분자마커 개발에는 총 20 ul 볼륨(약 20 ng genomic DNA, 0.5 mM dNTPs, 10 pMol each primer, 1 U Taq polymerase (Genetbio, Daejeon, South Korea)), SNP 기반의 분자마커 개발에는 총 20 ul 볼륨(약 20 ng genomic DNA, 10 pMol each inner primer, 1 pMol each outer primer, 0.5 mM dNTPs, 1 U Taq polymerase (Genetbio, Daejeon, South Korea))으로 Thermocycler (Biometra, Göttingen, Germany)을 이용하여 PCR이 수행되었다. PCR의 결과는 StaySafe (RBC, New Taipei City, Taiwan)로 핵산을 염색하여 1.5% agarose gel에서 확인하였다.

S. verrucosum의 엽록체 유전체 완성

S. verrucosum 엽록체 전장 유전체의 완성에는 NGS (Next-Generation Sequencing) 기술이 이용되었다. NGS 전체 raw data는 약 1.4 Gbp로, 이는 4,898,164 read를 통해 생산되었고 평균 길이는 301.0 bp였다. 전체 read의 약 97.90%를 사용하여 Phred score 20이상의 high-quality 염기서열을 CLC quality trim 프로그램을 이용한 전처리 과정을 거쳐 추출하였고 평균 길이가 약 285.5 bp인 염기서열 정보 약 1.2 Gbp를 얻을 수 있었다. 이는 전체 raw data의 약 81.12%로 이 염기서열을 de novo assembly하고, 엽록체 유래의 contig 선별, 확장, 통합 및 gap-filling 과정 등을 거쳐 엽록체 전장 유전체를 완성하였다. 전체 엽록체 유전체 서열의 길이는 155,485 bp로 나타났으며, aligned read는 171,370개, 평균 coverage는 약 310.87x인 것으로 확인되었다. 각 위치별 read depth는 완성된 유전체 서열에 전체 trimmed read를 mapping 하여 계산한 결과 최소 145 이상이었다. 구조는 원형 이중가닥 분자로 다른 식물의 엽록체 유전체와 동일한 형태로 나타났으며, 85,952 bp의 LSC, 18,347 bp의 SSC, 그리고 한 쌍의 25,593 bp IRa/IRb로 이루어져 있었다. S. hougasii 엽록체 유전체 염기서열 (MF471372, Cho et al. 2018; Kim and Park 2020b)과의 비교 및 BLASTZ 분석(Schwartz et al. 2003)을 통해서도 그 유사성이 확인되었다(Fig. 1). S. verrucosum의 엽록체 전장 유전체 염기서열을 대상으로 NCBI에서 BLASTN search를 실시한 결과 S. hougasii (MF471372), S. stoloniferum (MF471373)과 99.93%의 높은 유사도를 보였고, GC의 비율도 각각 37.88%로 매우 유사한 결과를 보여주었다(Table 1).

Figure 1. Assembly of the complete chloroplast genome sequence of S. verrucosum. Four representative contigs for the chloroplast genome of S. verrucosum and comparison with the corresponding regions of the S. hougasii chloroplast genome (MF471372) are combined. Blue and yellow bars indicate contig matching with the reference sequence in forward and reverse orientation, respectively

S. verrucosum의 유전자 분포는 총 158개로 전체 엽록체 유전체에 105개의 단백질 코딩, 45개의 tRNA, 8개의 rRNA가 존재하였으며, 이 중 단백질 코딩 유전자 11개, tRNA 8개, rRNA 4개가 IRa /IRb 영역에 역배열로 중복되어 있는 것으로 확인되었다(Table 1, Fig. 2). 전체 염기서열 중 코딩 영역이 차지하는 비율은 59.2%로 158개의 유전자가 평균 길이 약 583.3 bp로, 이중 단백질 코딩 유전자, tRNA, rRNA 각각의 평균 길이는 764.9 bp, 62.4 bp, 1,131.0 bp로 전체에서 51.6%, 1.8%, 5.8%를 차기하고 있었으며, 이는 Solanum 속의 다른 종들의 유전자 종류, 순서, 개수 등과 매우 유사하였다(Table 1).

Figure 2. Gene map of the S. verrucosum chloroplast genome. Genes presented on the outside of the map are transcribed in the clockwise direction, whereas genes presented on the inside are transcribed in the counterclockwise direction

엽록체 유전체 비교 및 계통수

S. verrucosum과 다른 종들의 유연관계 확인을 위한 계통수 작성은 S. verrucosum을 포함한 총 16종의 가지과 작물의 엽록체 전장 유전체 코딩 서열을 기반으로 수행되었다(Fig. 3). 그 결과, S. verrucosum은 S. tuberosum 및 다수의 가지속(Solanum)에 포함된 종들과 매우 근접하게 위치하고 있었으며, 그 중 S. demissum, S. hougasii, S. stoloniferum, S. hjertingii와 거의 일치하는 수준으로 동일한 그룹으로 분류되는 것을 확인하였다. 상대적으로 까마중(S. nigrum), 고추(C. annuum) 토마토(S. lycopersicum)와는 다소 먼 유연관계를 확인하였다. 그리고, EMBL의 ClustalW2 (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)를 이용하여 S. verrucosum, 재배종 감자, 7종의 근연야생종의 전체 엽록체 염기서열을 대상으로 다중 정렬한 결과 S. verrucosum 특이적인 3개의 InDel과 5개의 SNP의 존재를 확인하였다(Fig. 4). S. verrucosum 특이적 InDel 및 SNP의 수는 다른 종들을 대상으로 한 연구결과와 비교해 볼 때, 상대적으로 매우 적은 것으로 이러한 결과는 다중 정렬에 S. verrucosum과 염기서열의 일치도가 매우 높은 S. hougasii와 S. hjertingii를 포함하여 진행하였기 때문에 나타난 것으로 생각할 수 있다. 하지만, 다양한 유전적 요인에 의해 변이가 발생하여 S. verrucosum 특이적인 InDel과 SNP가 존재하는 것으로 확인된 것이다(Cho and Park 2016; Chung et al. 2006; Kim et al. 2018; Kim and Park 2019, 2020a, 2020b; Park 2021, 2022a, 2022b, 2023a, 2023b; Saski et al. 2005). 결과적으로, InDel은 3개 모두 유전자 간 영역에 위치하고 있었으며, SNP는 5개 중 3개는 유전자 간 영역에 위치하고 있었고 2개는 유전자 내 영역에 위치하고 있었다.

Figure 3. Maximum-likelihood phylogenetic tree of S. verrucosum along with 16 Solanaceae family members based on chloroplast protein-coding sequences of each chloroplast genome. The numbers on each node indicate the bootstrap values from 1,000 replicates. Data were partially obtained from Park (2023a)

Figure 4. Multiple alignment of sequences on the intergenic or intragenic regions containing InDels and SNPs used to develop the PCR-based markers. The chloroplast genome sequences of S. cardiophyllum (SC1-9: MK690622), S. jamesii (SJ8: MK690624), S. bulbocastanum (Sblb: DQ347958), S. berthaultii (Sber: KY419708), S. tuberosum (Stub: KM489056), S. verrucosum (SV1-4: MK690625), S. hougasii (SH2-10: MF471372), S. hjertingii (SH1-16: MK690623), and S. commersonii (Scmr: KM489054) were used and listed from top to bottom in each region of the InDels and SNPs. The regions of the InDels and SNPs detected on that of S. verrucosum are bold, highlighted, and underlined

S. verrucosum 특이적 분자마커 개발

S. verrucosum 특이적인 분자마커 개발에는 앞서 다중 정렬의 결과로 확인된 S. verrucosum 특이적 InDel과 SNP가 이용되었다. 3개의 InDel 중 2개는 InDel 영역에 특이적인 primer를 제작이 가능하여 PCR을 통해 다양성의 차이가 나타나는 S. verrucosum 특이적인 SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) 마커 개발이 가능하였으나(Table 2, Fig. 5A, 5B), 나머지 1개 InDel의 경우, InDel 영역과 인근 영역에서 반복서열이 존재하고 있었기 때문에 개발이 불가능 하였다(Cho et al. 2015; Garcia-Lor et al. 2023; Kim and Park 2020b; Yamaki et al. 2013). SNP는 총 5개 중 2개의 영역을 대상으로 분자마커 개발이 수행되었으며, S. verrucosum 특이적 SNP를 중심으로 SNP를 포함하는 DNA 단편, 그리고 SNP에서 S. verrucosum 특이적으로 또는 S. verrucosum 이외의 Solanum 종에 특이적으로 DNA 단편을 증폭할 수 있는 tetra-primer ARMS-PCR 방법을 적용하여 primer를 제작하였다(Collins and Ke 2012; Ye et al. 2001)(Table 2). Tetra-primer ARMS-PCR 방법은 염기서열이 매우 유사한 SNP를 대상으로 primer의 제작이 어려운 종 또는 SNP가 존재하는 계통 간의 비교에서 PCR에 의해 비교적 쉽게 특이적 분자마커를 개발할 수 있는 방법으로 이용되고 있으며, 본 연구에서도 SNP 정보를 활용하여 상대적으로 큰 비용을 들이지 않고 간편히 Solanum 종을 구별할 수 있는 PCR 기반의 S. verrucosum 특이적인 (Fig. 5C, 5D) 또는 비특이적인(Fig. 5C, 5D) 2개의 분자마커를 개발할 수 있었다(Han et al. 2016; Kou et al. 2017; Mahmoudi et al. 2019; Zou et al. 2018). 최종적으로 본 연구에서는 InDel 및 SNP 기반의 S. verrucosum 특이적 분자마커가 각각 2개씩 개발되었다. SV1_InDel2 (Fig. 4, Fig. 5A)와 SV1_InDel3 (Fig. 4, Fig. 5B)은 각각 psaA와 ycf3 및 rpl32와 trnL 유전자 사이에 존재하는 SCAR 마커로 개발되었으며, SV1_SNP1 (Fig. 4, Fig. 5C)와 SV1_SNP3 (Fig. 4, Fig. 5D)은 각각 trnK와 rps16 유전자 사이 및 rpoC2 유전자 내에 존재하는 SNP를 기반으로 개발되었다.

Figure 5. PCR-based markers for the discrimination of S. verrucosum from other Solanum species. A: SV1-4_InDel2. B: SV1-4_InDel3. C: SV1-4_SNP1. D: SV1-4_SNP3. The marker SV1-4_InDel2 is positively specific to S. verrucosum. The marker SV1-4_InDel3 is negatively specific to S. verrucosum. The markers SV1-4_SNP1 and SV1-4_SNP3 are both positively and negatively specific to S. verrucosum. M, SV1, DS, DJ, SM, SA, SB2, SC1, SC2, SH1, SH2, SJ, SK, SM1, SP, SS and SV2 indicate a size marker ladder, S. verrucosum (PI160228), potato varieties ‘Daeseo’, ‘Daeji’, ‘Sumi’, S. acaule (PI310970), S. brevicaule (PI205394), S. cardiophyllum (PI341233), S. commersonii (PI558050), S. hjertingii (PI186559), S. hougasii (PI161174), S. jamesii (PI578326), S. kurtzianum (PI578236), S. mochiquense (PI338616), S. pinnatisectum (PI190115), S. stoloniferum (PI160224), and S. vernei (PI230468), respectively. Red and yellow arrowsindicate positive and negative bands on S. verrucosum, respectively

Table 2 . Primers used to generate S. verrucosum-specific and non-specific markers.

InDel/SNP	Strand	Primer sequence (5’ → 3’)	Tm (°C)	Size
SV1-4_InDel2	Forward primer	ACTAGAGCAATTATGATCTGG	64°C	479 bp (insert sequence ‘TCCAAAAGC’ specific to S. verrucosum)
	Reverse primer	TGCTTTTGGAGCTTTTGGA
SV1-4_InDel3	Forward primer	TTGTTTTCTCGAACTTTCTCA	62°C	528 bp (delete sequence 21bp non-specific to S. verrucosum)
	Reverse primer	TTGTCTTGAACTCATAATAGC
SV1-4_SNP1	Forward inner primer	GTTCCGAAATGCCCGAATTTAATATGTC	62°C	375 bp (from two outer primers), 239 bp (T allele specific to S. verrucosum), 194 bp (C allele non-specific to S. verrucosum)
	Reverse inner primer	CGACAAAACCTCTTATTTTATTGATCTGCA
	Forward outer primer	AAGGGCTTGTGTTGGATTGGAACTAC
	Reverse outer primer	GGAAATACAAAAAAGGGGGTAGTGATTTGT
SV1-4_SNP3	Forward inner primer	ATGTTCCTAAAGGGCCCAATGAAGTC	58°C	435 bp (from two outer primers), 268 bp (T allele specific to S. verrucosum), 222 bp (C allele non-specific to S. verrucosum)
	Reverse inner primer	TTAAAAAAGATCCCCTAATTCCAATTCGA
	Forward outer primer	TGGAGAAAAGACCAATTCAAATTGACTG
	Reverse outer primer	TTCCAAGGCAAAAATTCAACAATCTCTT

세포의 핵 내 염색체 DNA 정보를 기반으로 한 분자마커 개발과 함께 재배종 감자와 감자의 근연야생종의 엽록체 전장 유전체를 분석하여 종 간의 유전자형 구별이 가능한 분자마커의 개발은 감자의 진화학적 연구와 신품종 육성에 기여할 수 있을 것이다(Bohs and Olmstead 1997; Hosaka and Sanetomo 2012). 감자의 신품종 육성에 있어 근연야생종의 유용 형질을 재배종 감자에 도입하려는 시도가 있지만, 배수성과 EBN의 차이로 교배육종의 방법으로는 유용 형질의 도입이 어려워 체세포융합을 이용한 체세포잡종을 만들어 활용하고 있으며, 이러한 과정에서 적절한 유전자형의 체세포잡종 선발이 필요하다. 유전자형을 확인하는 과정에서는 서로 다른 종의 염색체 조합 뿐만 아니라 엽록체 및 미토콘드리아 유전체의 전달에 대한 확인도 필요한데, Solanum 속의 종들을 포함한 다양한 식물종의 체세포융합이나 식물체가 재분화 되는 과정에서 핵 내 및 미토콘드리아 유전체에서는 높은 재조합 빈도가 나타나고, 엽록체 유전체에서는 한쪽 친의 엽록체 유전체가 무작위적 배분이 되는 것으로 알려져 있으나, 양친의 엽록체 유전체가 모두 전달되는 경우도 있었으며, 그로 인해 체세포융합으로 얻은 잡종 계통들의 유전자형을 구별하고 육종에 활용하기 적절한 계통을 선발하는 것이 필요하다(Chen et al. 2013; Cho et al. 2016; Cho and Park 2014; Lössl et al. 2000; Mohapatra et al. 1998; Smyda-Dajmund et al. 2016; Wang et al. 2011; Xiang et al. 2004). 따라서, 본 연구에서 개발된 InDel과 SNP 정보를 기반으로 한 분자마커는 체세포융합 방법으로 육성된 체세포잡종을 활용하여 감자의 신품종을 육성하는 과정에서 S. verrucosum 과 S. tuberosum의 엽록체 유전체를 대상으로 한 유전자형 구분에 이용될 것이다.

멕시코에서 자생하는 감자 근연야생종 중 하나인 Solanum verrucosum은 Phytophthora infestans에 대한 저항성으로 인해 감자 육종에 널리 활용되어 왔다. 그러나 2배체인 S. verrucosum은 EBN 값이 2로, 4배체인 재배용 감자와 다르므로 직접적인 교배가 불가능하다. 이 문제를 극복하기 위해 체세포융합이 사용되며, 체세포융합 후에는 분자 마커를 사용하여 적절한 융합체를 선택하는 것이 필수적이다. 이에 본 연구는 차세대 유전체 기술을 기반으로 S. verrucosum의 엽록체 전장 유전체 서열을 구명하고, 이를 기반으로 S. verrucosum 특이적인 분자마커를 개발하기 위해 다른 8개의 Solanum 종과 비교하였다. S. verrucosum의 엽록체 전장 유전체 총 길이는 155,485 bp이며, 전체적인 크기, 구조 등은 다른 Solanum 속에 속한 다른 종과 매우 유사하였다. S. verrucosum을 포함한 16개의 다른 가지과의 계통수 분석 결과에서 S. verrucosum이 S. demissum, S. hougasii, S. stoloniferum 및 S. hjertingii와 가장 밀접한 유연관계를 가졌다. S. verrucosum을 포함한 9개의 Solanum 종의 전체 엽록체 염기서열을 다중 정렬하여 S. verrucosum에 특이적인 3개의 InDel 영역과 5개의 SNP 영역이 구명되었다. 따라서 이러한 InDel 및 SNP를 기반으로 S. verrucosum 특이적인 PCR 기반 분자마커 4개가 개발되었다. 이 분자마커는 S. verrucosum을 다른 Solanum 종과 구별하는 데 사용될 수 있다. 본 연구는 융합체 선발을 용이하게 하고 S. verrucosum을 활용한 감자 신품종 육성에 기여할 것이다.